桑正林，楊順強(qiáng)，武 婷，吳銀梅，趙啟君

(昭通學(xué)院，云南昭通 657000)

根系分泌物是植物與土壤進(jìn)行物質(zhì)交換和信息傳遞的重要載體物質(zhì)，是植物響應(yīng)外界脅迫的重要途徑，是構(gòu)成植物不同根際微生態(tài)特征的關(guān)鍵因素，同時(shí)也是根際對(duì)話的主要調(diào)控者[1]。植物通過根系的分泌作用，實(shí)現(xiàn)植物與根際環(huán)境間的物質(zhì)、能量與信息的交流，它是植物對(duì)環(huán)境的一種適應(yīng)性機(jī)制，植物根系分泌物的化感作用被更多、更準(zhǔn)確的看作是一種生態(tài)學(xué)現(xiàn)象[2-3]。根系分泌物中的化感物質(zhì)種類和數(shù)量受物種、生長環(huán)境、營養(yǎng)狀況、氣候因子、生長階段等因素影響[4]。一般認(rèn)為，植物感病品種的根系分泌物能刺激病原菌孢子萌發(fā)，而抗病品種的根系分泌物則抑制孢子萌發(fā)[5-6]。黃瓜根系分泌物中總氨基酸含量隨品種抗性的增加而降低，其中苯丙氨酸含量與黃瓜枯萎病病情指數(shù)呈顯著正相關(guān)[7]；黑豆、豆角、番茄的根系分泌物可通過抑制黃瓜種子發(fā)芽勢來抑制其發(fā)芽[8]；茄子根系分泌物中的香草醛可促進(jìn)茄子種子萌發(fā)和幼苗生長，而肉桂酸對(duì)黃萎菌的孢子萌發(fā)、茄子種子萌發(fā)及幼苗生長均表現(xiàn)為抑制作用[9]。

煙草黑脛病是煙草上普遍發(fā)生，危害較大的土傳性真菌病害，幾乎可以為害任何生長階段的煙草植株和侵染所有栽培品種，在某些病害嚴(yán)重的地塊，煙草黑脛病的發(fā)病率高達(dá) 75%以上，嚴(yán)重影響了煙草產(chǎn)量和品質(zhì)的提高。不同抗性蠶豆品種根系分泌物中總糖含量隨抗病性的降低而升高，抗病品種的根系分泌物抑制了尖孢鐮刀菌的孢子萌發(fā)和菌絲生長，感病品種根系分泌物則顯著促進(jìn)尖孢鐮刀菌孢子萌發(fā)和菌絲生長[10]；西瓜根系分泌物中可溶性糖含量顯著高于水稻的，感病西瓜品種根系分泌物中的可溶性糖含量又顯著高于抗病品種[11]。煙草黑脛病的發(fā)生應(yīng)該與其根系分泌物存在一定的關(guān)聯(lián)，但針對(duì)烤煙根系分泌物及化感作用的品種差異研究還鮮有報(bào)道，為此，本試驗(yàn)采用對(duì)煙草黑脛病不同抗性的4個(gè)烤煙品種為材料，研究各烤煙品種根系分泌單糖的特點(diǎn)及單糖對(duì)煙草黑脛病菌的化感作用，探究烤煙根系分泌單糖及其對(duì)黑脛病化感作用的品種差異，為烤煙品種選育及病害防治提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 材料及其培養(yǎng)

參試烤煙品種中，‘NC102’為高抗黑脛病烤煙品種，‘K326’為中抗黑脛病烤煙品種，‘云煙87’為中感黑脛病烤煙品種，‘紅花大金元’為高感黑脛病烤煙品種[12]。采用漂浮育苗法育苗，2012年4月30日，采用上口直徑43 cm、底部直徑30 cm、高35 cm的塑料盆進(jìn)行盆栽。盆栽用土為未種植過烤煙的耕層土，每盆裝土25 kg，盆栽土壤有機(jī)質(zhì)61.60 g·kg-1、pH值6.54、堿解氮67.47 mg·kg-1、有效磷30.84 mg·kg-1、速效鉀269.30 mg·kg-1。每盆1株，每品種移栽30盆。采用煙草專用復(fù)混肥料(N∶P2O5∶K2O=12∶10∶24)作為肥源，一次性作為底肥施入，每盆施8 g純氮。煙苗移栽后置于云南農(nóng)業(yè)大學(xué)校內(nèi)塑料大棚內(nèi)，期間采用相同的管理方法培養(yǎng)煙株。

1.2 單糖對(duì)煙草黑脛病菌的化感試驗(yàn)

黑脛病菌從云南昭通市昭陽區(qū)守望鄉(xiāng)感染黑脛病的煙株上分離獲得，經(jīng)分離、培養(yǎng)、鏡檢、再接種觀察， 確定為黑脛病菌。采用燕麥培養(yǎng)基(燕麥片30 g， 瓊脂18 g， 蒸餾水1 000 mL)培養(yǎng)黑脛病菌。在直徑75 mm培養(yǎng)皿中加入10 mL瓊脂培養(yǎng)基(瓊脂18 g，蒸餾水1 000 mL)，根據(jù)根系樣品中各單糖的平均濃度，配制4.000、2.000、1.000、0.500 mg·mL-1的葡萄糖、木糖、阿拉伯糖、半乳糖和混合糖(取4.000、2.000、1.000、0.500 mg·mL-1的木糖、阿拉伯糖、葡萄糖和半乳糖溶液等體積混合，分別得4.000、2.000、1.000、0.500 mg·mL-1的混合糖溶液)溶液。2013年3月20日，取上述糖溶液各3 mL分別加入到裝有瓊脂培養(yǎng)基的培養(yǎng)皿中，取長勢健壯、一致的黑脛病菌，在無菌條件下用孔徑5 mm的打孔器取黑脛病菌塊，分別接種于已加入不同濃度糖溶液的培養(yǎng)皿中央，每皿接種1個(gè)菌種塊，對(duì)照(CK)組加入去離子水3 mL，每處理3次重復(fù)。置于25 ℃條件下培養(yǎng)、觀察，于培養(yǎng)的第4、5、6、7天上午9:00用游標(biāo)卡尺測定菌落直徑，采用十字形測定后求平均值代表其菌落直徑。

1.3 烤煙根系及根際土的取樣及處理

參照李世清等[13-14]的方法。分別在烤煙的團(tuán)棵期、旺長期、現(xiàn)蕾期和成熟期取樣，各品種選取生長一致的3株取混合樣。小心將煙株從盆內(nèi)取出，輕輕抖落根系外圍土壤， 收集緊密附著于根系上的土壤，帶回室內(nèi)挑出根系、碎石等雜質(zhì)，風(fēng)干至恒重，過40目篩，得根際土樣；將根系用自來水沖洗干凈，再用蒸餾水沖洗3遍，剪取直徑小于1 mm的側(cè)根，105 ℃殺青20 min，65 ℃烘干至恒重，粉碎，過40目篩，得根系樣。

1.4 標(biāo)準(zhǔn)品和樣品的衍生及單糖含量測定

參照楊興斌等[15]的方法。取葡萄糖、阿拉伯糖、核糖、半乳糖、木糖和鼠李糖標(biāo)品用重蒸水配成1 000、500、250、100、50、10、5 和0 μg·mL-1的系列混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，分別取混合標(biāo)準(zhǔn)溶液200 μL，依次加入0.5 mol·L-1的PMP(1-苯基-3-甲基-5-吡唑啉酮)甲醇溶液100 μL，0.3 mol·L-1的NaOH溶液100 μL，搖勻，70 ℃水浴30 min，冷卻，加0.3 mol·L-1的HCl溶液100 μL，搖勻后，加入1 mL氯仿萃取3次后，過0.45 μm微孔濾膜，得標(biāo)準(zhǔn)衍生液。稱取0.2 g根系樣，放入5 mL離心管中，加入4 mL重蒸水，超聲提取30 min后，12 000 r·min-1，5 ℃離心15 min，上清液在50 ℃下減壓濃縮至干，用1 mL重蒸水分3次沖洗，合并得提取液。取提取液200 μL，其衍生方法同標(biāo)準(zhǔn)溶液；稱取10 g根際土樣，放入50 mL離心管中，加入40 mL重蒸水，剩余步驟同根樣。

標(biāo)準(zhǔn)液、根樣和土樣衍生液的單糖含量采用高效毛細(xì)管區(qū)帶電泳法測定。毛細(xì)管總長度48.5 cm，有效柱長為39.0 cm，內(nèi)徑為75 μm；硼砂緩沖液：50 mmol·L-1，pH 10.80；溫度：20 ℃；電壓：10 kV；進(jìn)樣方式：5 000 Pa壓力自動(dòng)進(jìn)樣5 s，檢測波長為245 nm。每次進(jìn)樣前，依次用0.1 mol·L-1NaOH溶液、重蒸水、硼砂緩沖液沖洗毛細(xì)管柱3 min。

1.5 數(shù)據(jù)處理

采用SPSS17.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，多重比較采用Duncan法。

單糖對(duì)黑脛病的化感效應(yīng)采用 Willamson[16]的化感作用效應(yīng)指數(shù)(response index，RI)法進(jìn)行分析。

(1)

(2)

其中：C為對(duì)照值；T為處理值，RI為化感效應(yīng)指數(shù)(RI>0，為促進(jìn)作用；RI<0，為抑制作用，絕對(duì)值大小與作用強(qiáng)度一致)。

2 結(jié)果與分析

2.1 標(biāo)準(zhǔn)品和樣品中單糖的毛細(xì)管電泳圖譜和標(biāo)準(zhǔn)曲線

將衍生后的混合單糖標(biāo)準(zhǔn)液、根系樣品提取液及根際土樣品提取液上機(jī)檢測，在21 min內(nèi)， 標(biāo)準(zhǔn)液檢出了木糖、阿拉伯糖、核糖、葡萄糖、鼠李糖和半乳糖6種單糖，獲得了基線穩(wěn)定、無拖尾、靈敏度高的理想毛細(xì)管電泳圖譜， 根系及根際土樣品也檢出了多種單糖(圖1)。根據(jù)混合標(biāo)準(zhǔn)溶液的毛細(xì)管電泳圖譜，以質(zhì)量濃度對(duì)峰面積制作標(biāo)準(zhǔn)曲線， 得出各單糖濃度與峰面積的線性關(guān)系，經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)檢測線性關(guān)系良好(表1)，可作為計(jì)算樣品中單糖含量使用。

2.2 烤煙根際土中主要單糖含量在發(fā)育時(shí)期間和品種間的差異

各品種烤煙根際土中檢出的主要單糖組分及含量隨著發(fā)育時(shí)期的變化而存在差異(表2)?！?7’和‘紅花大金元’根際土中的木糖、阿拉伯糖、葡萄糖和半乳糖均在團(tuán)顆期時(shí)含量高；‘NC102’和‘K326’根際土中的木糖、阿拉伯糖和葡萄糖在現(xiàn)蕾期和成熟期時(shí)含量較高；各烤煙品種檢出的單糖中葡萄糖在各時(shí)期含量均最高，其含量在團(tuán)棵期時(shí)表現(xiàn)為‘NC102’(2.255 μg·g-1)<‘K326’(4.774 μg·g-1)<‘云87’(7.100 μg·g-1)<‘紅花大金元’(11.068 μg·g-1)。根際土單糖總量(4種單糖之和)同樣因烤煙品種、生育時(shí)期不同而存在差異?！甆C102’在成熟期時(shí)含量最高(11.127 μg·g-1)，‘K326’在現(xiàn)蕾期含量最高(8.337μg·g-1)，‘云87’在旺長期含量最高(10.877 μg·g-1)，‘紅花大金元’在團(tuán)顆期時(shí)含量最高(15.579 μg·g-1)；在團(tuán)棵期時(shí)，各品種間單糖總量順序?yàn)椤甆C102’<‘K326’<‘云87’<‘紅花大金元’。以上結(jié)果表明：根際土中含量最高的單糖為葡萄糖，高感和中感黑脛病烤煙品種在團(tuán)顆期時(shí)各單糖含量較高，使其單糖總量較高，為煙草黑脛病菌的生長提供了物質(zhì)和能量，使烤煙容易感病。

1.PMP； 2.木糖； 3.阿拉伯糖； 4.核糖； 5.葡萄糖； 6.鼠李糖； 7.半乳糖圖1 標(biāo)準(zhǔn)液和團(tuán)棵期‘K326’樣品中單糖的毛細(xì)管電泳圖譜1.PMP； 2. Xylose； 3. Arabinose； 4. Ribose； 5. Glucose； 6. Rhamnose； 7. GalactoseFig.1 HPCE electrophoretogram of mixed standard solution and samples in ‘K326’ variety at rosette stage

單糖Monosaccharide標(biāo)準(zhǔn)曲線Standard curve相關(guān)系數(shù)(r)Correlation coefficient單糖Monosaccharide標(biāo)準(zhǔn)曲線Standard curve相關(guān)系數(shù)(r)Correlation coefficient木糖 Xylosey=1 019.2x-5 360.30.998 6葡萄糖 Glucosey=416.15x-2 543.10.997 1阿拉伯糖 Arabinosey=1 146.9x-2 7720.999 2鼠李糖 Rhamnosey=822.24x+862.230.997 1核糖 Ribosey=738.59x+742.970.999 9半乳糖 Galactosey=1 093.1x+2 800.20.999 0

2.3 烤煙根系中主要單糖含量在品種間和生育期間的差異

在烤煙根系中檢出的木糖、阿拉伯糖、葡萄糖和半乳糖含量因烤煙品種和生育時(shí)期的不同而變化(表3)?？緹煾的咎呛桶⒗呛吭谄贩N‘NC102’、‘K326’、‘紅花大金元’中呈升高-降低-升高的變化趨勢，在品種‘云87’中則呈先升高后降低的變化趨勢，均在旺長期時(shí)含量最高；各烤煙品種根系中葡萄糖含量在各發(fā)育時(shí)期均高于同期其他單糖含量，且均隨著生育期呈先升高后降低的變化趨勢，在現(xiàn)蕾期時(shí)含量顯著高于其余時(shí)期。‘NC102’木糖含量在旺長期、現(xiàn)蕾期和成熟期時(shí)顯著高于其他品種；‘NC102’中阿拉伯糖含量在旺長期和成熟期顯著高于其他品種，‘云87’的阿拉伯糖含量則在團(tuán)顆期和現(xiàn)蕾期顯著高于其他品種；‘NC102’的葡萄糖含量在旺長期和現(xiàn)蕾期顯著高于其他品種，‘紅花大金元’的葡萄糖含量則團(tuán)顆期和成熟期顯著高于其他品種；‘NC102’中半乳糖含量在團(tuán)顆期、旺長期和成熟期時(shí)顯著高于其他品種。隨著生育期的推進(jìn)，各品種根系單糖總量均呈現(xiàn)出先升后降的變化趨勢，并均在現(xiàn)蕾期達(dá)到最大值，且顯著高于其余生育期；在團(tuán)棵期時(shí)，單糖總量以‘NC102’和‘紅花大金元’最高，且差異不顯著，而‘云87’的最低(6 574.259 μg·g-1)；在旺長期時(shí)，‘NC102’單糖總量顯著高于其余品種；現(xiàn)蕾期時(shí)，各品種間單糖總量均處于最高水平，品種間差異顯著，‘云87’的單糖總量最低；成熟期時(shí)，‘紅花大金元’的單糖總量最高(15 171.738 μg·g-1)， ‘NC102’最低(4 537.383 μg·g-1)。上述結(jié)果表明：根系中單糖的種類及含量與烤煙抗黑脛病的相關(guān)性不明顯。

2.4 不同濃度糖溶液對(duì)煙草黑脛病菌菌落生長的影響及其化感效應(yīng)

煙草黑脛病菌菌落直徑在不同濃度混合糖和各單糖溶液處理后均顯著大于對(duì)照，均隨處理時(shí)間的延長而逐漸增大；各濃度溶液對(duì)菌絲生長均表現(xiàn)為顯著促進(jìn)作用，且濃度間存在顯著性差異，但又因單糖種類和濃度的不同而存在差異(圖2)。其中，黑脛病菌菌落直徑基本隨混合糖濃度升高而增大，在4.000 mg·mL-1濃度處理第4 天和第7天時(shí)分別為48.932和68.317 mm，分別是同期對(duì)照的10.715和7.505倍；在整個(gè)觀測期內(nèi)，混合糖濃度較高處理的黑脛病菌菌絲生長較快，菌落直徑較大(圖2，A)。同時(shí)，黑脛病菌絲在2.000 mg·mL-1葡萄糖處理下生長最快，并顯著高于其余濃度處理，其第7 天時(shí)菌落直徑(68.940 mm)是同期對(duì)照的7.573倍(圖2，B)；黑脛病菌絲在1.000和2.000 mg·mL-1木糖溶液處理下生長較快，其第7 天時(shí)菌落直徑分別達(dá)63.607 和63.237 mm，分別是同期對(duì)照的6.947和6.687倍(圖2，C)；而黑脛病菌菌落直徑在1.000 mg·mL-1阿拉伯糖處理4 d后就達(dá)40.420 mm，在2.000 mg·mL-1濃度處理第7天時(shí)達(dá)68.817 mm，此時(shí)為同期對(duì)照的7.560倍(圖2，D)；黑脛病菌菌絲生長在2.000 mg·mL-1半乳糖溶液處理下受到促進(jìn)作用最強(qiáng)，并始終顯著高于其余濃度處理，其處理第7天時(shí)菌落直徑是同期對(duì)照的7.418倍(圖2，E)。以上菌落直徑的結(jié)果分析表明，黑脛病菌菌絲的生長因單糖種類、濃度及作用時(shí)間的不同而不同。

表2 各烤煙品種根際土中主要單糖含量比較分析

注：不同小寫與大寫字母分別表示同列和同行在0.05水平下的差異顯著性，以下各表與此相同

Note: The different normal and capital letters among same column indicated significant difference at 0. 05 level. The same as follows

表3 各烤煙品種根系中主要單糖比較分析

A.混合糖；B.葡萄糖；C.木糖；D.阿拉伯糖；E.半乳糖； 同一時(shí)間不同字母表示處理間在0.05水平存在顯著性差異圖2 不同濃度糖溶液處理下黑脛病菌落生長的變化A.Mixed sugar；B.Glucose；C.Xylose；D.Arabinose；E.Galactose； The different normal letters within the same stage indicate significant difference among treatments at 0.05 levelFig.2 The growth of P. parasitica var. nicotiana colonies under different concentrations of saccharide

進(jìn)一步的化感效應(yīng)分析發(fā)現(xiàn)，各單糖在所設(shè)濃度下對(duì)黑脛病菌菌絲生長的化感作用指數(shù)均為正值，表現(xiàn)為促進(jìn)作用(表4)。其中，在單一糖處理下，黑脛病菌菌絲生長的化感作用指數(shù)表現(xiàn)為隨濃度增加先升高后降低的趨勢，并大多在2.000 mg·mL-1濃度處理下化感作用指數(shù)最大，促進(jìn)作用最強(qiáng)，而在4.000 mg·mL-1濃度處理下化感作用指數(shù)有所降低，促進(jìn)作用有所減弱；混合糖處理下，化感作用指數(shù)隨糖溶液濃度的增加而增大，并在4.000 mg·mL-1濃度處理下最大，促進(jìn)作用最強(qiáng)。

3 討 論

在本研究中，各烤煙品種的根際土和根系中在烤煙不同發(fā)育時(shí)期中均檢出了木糖、阿拉伯糖、葡萄糖和半乳糖，檢出的各糖組分及含量因烤煙品種、生育時(shí)期及部位不同而存在差異；在烤煙團(tuán)棵期時(shí)，抗病品種‘NC102’、‘K326’根際土中的葡萄糖、單糖總量較感病品種‘云87’、‘紅花大金元’低。同時(shí)，不同濃度木糖、阿拉伯糖、葡萄糖、半乳糖和混合糖溶液處理對(duì)黑脛病菌菌絲的生長均表現(xiàn)為促進(jìn)作用，這種促進(jìn)作用因糖種類、濃度和處理時(shí)間不同而存在差異，且在單一糖處理下以濃度為2.000 mg·mL-1時(shí)促進(jìn)作用最強(qiáng)，在混合糖溶液處理下以濃度為4.000 mg·mL-1時(shí)促進(jìn)作用最強(qiáng)?？梢姡緹煾胁∑贩N能夠分泌較多的葡萄糖和其他單糖到根際土中，從而促進(jìn)煙草黑脛病菌的生長，導(dǎo)致發(fā)病。

表4 不同類型單糖對(duì)黑脛病菌的化感作用指數(shù)

植物根系分泌物的產(chǎn)生和釋放是植物在環(huán)境脅迫壓力下形成的，是植物在進(jìn)化過程中產(chǎn)生的一種對(duì)環(huán)境的適應(yīng)性機(jī)制[17]。目前根系分泌物的產(chǎn)生機(jī)制還不十分清楚，主要觀點(diǎn)有主動(dòng)釋放、被動(dòng)釋放、代謝途徑、非代謝途徑[18]。本試驗(yàn)中，烤煙根系與根際土中的單糖含量對(duì)應(yīng)性不強(qiáng)，表明烤煙根系分泌單糖可能主要是一種主動(dòng)釋放，與烤煙品種特性有關(guān)；在烤煙生長過程中，隨發(fā)育時(shí)期不同，根系分泌物的數(shù)量和種類存在差異，根際微生物的數(shù)量亦隨之發(fā)生變化[19]。煙草不同生育階段對(duì)黑脛病的抗性也存在較大差異，煙草黑脛病的爆發(fā)多發(fā)生在高溫高濕的季節(jié)，從大田生育期來看，以團(tuán)棵期至旺長期前后發(fā)病普遍，盛發(fā)期是現(xiàn)蕾階段[20]。本試驗(yàn)中，感病烤煙品種從移栽后至團(tuán)棵期期間分泌到根際土中的葡萄糖、單糖總量比抗病品種的高，而各單糖及混合糖溶液對(duì)黑脛病菌的生長均起促進(jìn)作用。煙草黑脛病是土傳真菌病害，感病品種之所以較抗病品種易感病，原因可能是感病品種在生長發(fā)育前期通過根系分泌較多的單糖到根際土中，為土壤中黑脛病菌的生長發(fā)育提供了物質(zhì)和能源，促進(jìn)了煙草黑脛病菌的生長，導(dǎo)致煙草黑脛病的發(fā)生。

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