張浩宇，樊俊苗，王 婷，杜 方

(山西農(nóng)業(yè)大學(xué) 園藝學(xué)院，山西太谷 030801)

萜類物質(zhì)廣泛存在于自然界生物體內(nèi)，大約有55 000種，構(gòu)成了最大的天然產(chǎn)物家族[1]。在高等植物中，有些萜類物質(zhì)參與生理代謝活動(dòng)，如光合作用、呼吸作用和細(xì)胞周期控制等[2]，有些萜類化合物如丹參中的丹參酮類具有藥理活性[3]，有些萜類化合物為食品工業(yè)和化妝品工業(yè)的重要原料[4]，同時(shí)低分子量的萜類也是百合花香成分中的重要物質(zhì)[5]。萜類物質(zhì)合成途徑有位于質(zhì)體的2-C-甲基-D-赤藻糖醇-4-磷酸(2-C-methyl-D-erythritol 4-phosphate, MEP)和位于胞質(zhì)的甲羥戊酸(mevalonate, MVA)兩條途徑[6]。1-脫氧木酮糖-5-磷酸合成酶(1-deoxy-D-xylulose-5-phosphate synthase, DXS)是MEP途徑中的關(guān)鍵酶[7-8]，并且已有研究表明其在擬南芥中發(fā)揮著限速酶作用[9]，是萜類次生代謝物質(zhì)等下游產(chǎn)物的一個(gè)關(guān)鍵調(diào)控位點(diǎn)。

百合作為主要的切花和盆花材料，在國(guó)內(nèi)外花卉市場(chǎng)占有重要地位[10]。百合不僅具有艷麗的色彩，還有豐富的香型，有墨香、濃香、甜香、淡香以及無香[11]。近年來，百合花香是學(xué)者研究的一大熱點(diǎn)。從揭示花香成分[12-13]、釋放器官[14]、散發(fā)規(guī)律[15-16]到代謝通路的挖掘[17]以及相關(guān)基因、調(diào)控基因的克隆[18]和原核生物表達(dá)驗(yàn)證[19]，都取得了突破性的進(jìn)展。通常亞洲百合無香味，而東方百合香味濃烈，嚴(yán)重影響消費(fèi)者的購(gòu)買欲。因此，改良花香是育種家孜孜以求的育種目標(biāo)。已有研究表明，與有香百合相比，無香百合中單萜類化合物的釋放量很低或根本檢測(cè)不到[14]。因此，研究百合單萜類花香物質(zhì)的代謝通路及其關(guān)鍵基因?qū)τ诮沂净ㄏ悴町惐举|(zhì)原因具有重要意義。本研究采用RACE技術(shù)從東方百合‘演員’(LiliumOriental hybrid ‘Entertainer’)花瓣中克隆得到DXS的cDNA全長(zhǎng)，并對(duì)其在不同香型百合品種間表達(dá)特征進(jìn)行了研究，為今后通過基因工程改良百合花香提供了理論依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 材 料

試驗(yàn)材料(表1)種植于山西農(nóng)業(yè)大學(xué)園藝學(xué)院園藝站百合圃。2017年5～7月陸續(xù)取不同品種百合盛開期花瓣，經(jīng)液氮速凍，-80 ℃保存，備用。

1.2 方 法

1.2.1RNA提取與cDNA第一鏈合成使用TaKaRa公司裂解液，采用Trizol法提取百合總RNA。使用生物光度計(jì)檢測(cè)RNA的濃度和純度，用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)RNA質(zhì)量，按照GenStar試劑盒說明反轉(zhuǎn)錄成cDNA。

1.2.2DXS基因的克隆從NCBI核酸數(shù)據(jù)庫(kù)中查詢獲得1條百合cDNA序列信息，GeneBank登錄號(hào)為KR998332.1。分別設(shè)計(jì)5′-RACE和3′-RACE引物(表2)，以‘演員’cDNA為模板，利用TaKaRa公司RACE試劑盒進(jìn)行PCR擴(kuò)增。PCR反應(yīng)總體系為50 μL，其中cDNA 2.5 μL，10×UPM引物5 μL,5′(3′)GSP引物1 μL,ddH2O 15.5 μL，2×SeqAmpTMBuffer 25 μL, SeqAmp DNA Polymerase 1 μL。PCR擴(kuò)增條件為：94 ℃ 30 s，72 ℃ 3 min，5個(gè)循環(huán)；94 ℃ 30 s，70 ℃ 30 s，72 ℃ 3 min，5個(gè)循環(huán)，94 ℃ 30 s，65 ℃ 30 s，72 ℃ 3 min，25個(gè)循環(huán)。1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，切膠回收目的片段，加A反應(yīng)按照天根加A試劑的方法標(biāo)準(zhǔn)操作。加A后，連接載體pMD-19T(TaKaRa)，轉(zhuǎn)化EscherichiacoliDH5α感受態(tài)細(xì)胞(全式金)，菌液PCR驗(yàn)證后送生工生物工程(上海)股份有限公司測(cè)序。利用DNAMAN軟件拼接測(cè)序結(jié)果，得到編碼序列。

表2 引物序列

表1 試驗(yàn)用材料基本信息

1.2.3生物信息學(xué)分析利用ProtParam (http://web.expasy.org/protparam/) 預(yù)測(cè)LeDXS分子量和理論等電點(diǎn)[20]。用SMART在線軟件 (http://smart.embl-heidelberg.de/) 預(yù)測(cè)LeDXS蛋白結(jié)構(gòu)域[21]。通過SignalP4.1 (http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/) 在線軟件進(jìn)行信號(hào)肽預(yù)測(cè)[22]。用在線軟件ExPASy (http://web.expasy.org/protparam/) 分析蛋白質(zhì)親水性/疏水性；用TMHMM Server V2.0 (http://www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM/) 在線軟件對(duì)LeDXS進(jìn)行跨膜性分析[23]。用PRABI (https://npsa-prabi.ibcp.fr/cgi-bin/secpred sopma.pl) 預(yù)測(cè)蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)[24]。用DNAMAN Version 9軟件進(jìn)行序列比對(duì)及翻譯，用MEGA6.0軟件構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹[25]。

1.2.4實(shí)時(shí)熒光定量PCR分析根據(jù)已克隆的百合LeDXS的cDNA序列分析結(jié)果，設(shè)計(jì)熒光定量引物，Blast比對(duì)確定引物特異性。分別以不同品種盛開期花瓣的cDNA為模板，以Actin基因作為內(nèi)參基因，反應(yīng)引物DXS-F、DXS-R、Actin-F、Actin-R見表2。參照杜方等[26]的步驟進(jìn)行熒光定量PCR，研究不同品種百合LeDXS基因表達(dá)差異，每個(gè)試驗(yàn)進(jìn)行3次重復(fù)。所得數(shù)據(jù)采用Excel進(jìn)行平均數(shù)統(tǒng)計(jì)，2-ΔΔCT法[27]計(jì)算相對(duì)表達(dá)量，以SPSS V20軟件進(jìn)行方差分析，LSD多重比較，利用Excel 2010繪圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 LeDXS基因全長(zhǎng)cDNA的克隆

通過RACE法，以東方百合‘演員’花瓣cDNA為模板，分別進(jìn)行5′和3′-RACE擴(kuò)增、TA克隆和測(cè)序分析，獲得5′末端序列長(zhǎng)度2 254 bp，獲得3′末端序列長(zhǎng)度1 004 bp(圖1)，與預(yù)期結(jié)果一致。命名該基因?yàn)長(zhǎng)eDXS，GenBank登錄號(hào)為MF576067。該基因全長(zhǎng)2 471 bp，其中包含5′-UTR 50 bp，3′-UTR 279 bp和開放閱讀框2 142 bp，編碼713個(gè)氨基酸。通過DNAMAN軟件翻譯獲得LeDXS基因編碼的氨基酸序列(圖2)。

2.2 DXS蛋白結(jié)構(gòu)分析

SMART預(yù)測(cè)氨基酸序列中含有3個(gè)功能結(jié)構(gòu)域，分別是N端DXP合成結(jié)構(gòu)域、TPP結(jié)合結(jié)構(gòu)域和轉(zhuǎn)酮醇酶結(jié)構(gòu)域(圖2)。ProtParam分析該蛋白相對(duì)分子量為76.3 kD，理論等電點(diǎn)為6.65，化學(xué)式為C3370H5374N942O1016S32，原子量10734。信號(hào)肽結(jié)果分析表明，LeDXS不屬于分泌蛋白。LeDXS GRAVY(Grand average of hydropathicity)值為負(fù)值，表明蛋白屬于親水性蛋白。蛋白跨膜性分析顯示無跨膜區(qū)域，不屬于膜蛋白。二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)顯示，其氨基酸組成α-螺旋(Hh)為267個(gè)(37.45%)，延伸鏈(Ee)為139個(gè)(19.50%)，β-轉(zhuǎn)角(Tt)為81個(gè)(11.36%)，無規(guī)則卷曲為226個(gè)(31.70%)。

2.3 多序列比對(duì)與聚類分析

百合‘演員’中克隆的DXS基因分別與已分離獲得的LhDXS基因[13]、Unique8314[28]序列一致性都高達(dá)99%(圖3)，與無油樟(Amborellatrichopoda)、蔓花生(Arachisduranensis)、黃芪(Astragalusmembranaceus)的一致性分別達(dá)74%、74%、73%。用MEGA7軟件對(duì)10種可以產(chǎn)生萜類化合物的植物進(jìn)行DXS聚類分析，結(jié)果表明所獲得的百合DXS基因?qū)儆诘谝活惢颍禽^為保守的管家基因(圖4)。

2.4 百合DXS基因在品種間的表達(dá)模式

采用qRT-PCR方法檢測(cè)LeDXS在13個(gè)百合品種的表達(dá)情況。由圖5可知，LeDXS在不同品種中均有表達(dá)，在濃香型東方百合‘白夢(mèng)’中表達(dá)量最高，在無香的亞洲百合‘小珍珠’中最低；濃香型百合表達(dá)量與淡香型和無香型之間差異顯著，但淡香型和無香型百合基因表達(dá)差異不顯著；同一香型百合之間基因表達(dá)差異也不盡相同，濃香型百合之間存在顯著差異。LeDXS在百合不同品種間的表達(dá)量表明，不同品種百合花香的差異與LeDXS基因表達(dá)有關(guān)。

圖1 DXS基因片段RACE電泳圖Fig.1 Electrophoresis pattern of RACE fragments of DXS

ATG為起始密碼子；TAG為終止密碼子；粉色、藍(lán)色和綠色箭頭分別表示N端DXP合成結(jié)構(gòu)域(DXP_synthase_N)、TPP結(jié)合結(jié)構(gòu)域(Transket_pyr)和轉(zhuǎn)酮醇酶結(jié)構(gòu)域 (Transketolase_C)在氨基酸序列中的起止位置圖2 百合LeDXS基因的核酸序列及推導(dǎo)的氨基酸序列The ATG in the red box is the start codon; the TAG in the box is the stop codon; the pink, blue and green arrows indicate the starting and ending positions of the N-terminal DXP synthesis domain, the TPP binding domain and the transketolase domain in the amino acid sequence, respectivelyFig.2 The nucleotide (above) and deduced amino acid sequences (below) of LeDXS

3 討 論

萜類物質(zhì)在植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)和自身防御等方面發(fā)揮重要作用[29]。張輝秀等[13]研究表明濃香型百合萜烯類釋放量最高，在淡香類中沒有檢測(cè)到，并且認(rèn)為其中兩種單萜成分是百合花致香的關(guān)鍵成分。DXS基因是萜類物質(zhì)合成MEP途徑的第一個(gè)關(guān)鍵酶基因，萜類含量與DXS的表達(dá)水平密切相關(guān)[30]，目前已在178種植物中分離和克隆[31]。DXS基因過表達(dá)或干擾表達(dá)均能夠改變次生代謝物質(zhì)合成，在擬南芥(Arabidopsisthaliana)[32]、胡蘿卜(Daucuscarota)[33]、寬葉薰衣草(Lavandulalatifolia)[34]和獼猴桃(Actinidiachinensis)[35]等植物中都已進(jìn)行了初步功能驗(yàn)證。不同物種DXS基因家族成員數(shù)不同，以前的研究認(rèn)為DXS酶由1～3個(gè)基因編碼，基于RNA-seq測(cè)序的研究表明，胡蘿卜[33]和煙草(Nicotianatabacum)[36]有中分別有5個(gè)和6個(gè)，對(duì)于百合DXS基因研究甚少，目前，已知的百合DXS家族成員至少有2個(gè)，前人只在 ‘Belladonna’中獲得部分cDNA序列[14]，張騰旬在東方百合‘西伯利亞’品種中也克隆得到1個(gè)DXS基因cDNA全長(zhǎng)，屬于Ⅱ型DXS[37]，但序列信息尚未公布。本研究通過RACE技術(shù)，克隆了百合DXS基因cDNA全長(zhǎng)，并利用生物信息學(xué)手段分析研究其編碼的蛋白特性，該蛋白具有親水性特點(diǎn)，不屬于分泌蛋白，由此推測(cè)它只在質(zhì)體中發(fā)揮功能。

通過對(duì)基因的表達(dá)規(guī)律研究，發(fā)現(xiàn)其表達(dá)量與器官、花、果實(shí)發(fā)育程度、晝夜節(jié)律、品種等有關(guān)。研究表明CnDXS2在夜香樹(CestrumnocturnumL.)葉片中的表達(dá)量總體高于花器官[38]。隨著花朵開放級(jí)數(shù)和果實(shí)成熟，玫瑰花瓣[39]和獼猴桃果實(shí)[35]中DXS基因表達(dá)量逐級(jí)增加。茉莉花瓣中DXS基因的表達(dá)具有晝夜節(jié)律性[40]。課題組之前的研究表明，LhDXS在百合‘索邦’花和鱗片中顯著高表達(dá)，但只在‘朱麗葉’花中顯著高表達(dá)[26]。本研究發(fā)現(xiàn)，LeDXS基因的表達(dá)水平與花香的釋放呈現(xiàn)一定的規(guī)律，濃香型百合基因表達(dá)量顯著高于淡香型和無香型百合。Johnson的研究結(jié)果表明，濃香型百合‘Conca’d Or’比淡香型‘Santander’DXS基因表達(dá)量高[14]，與本研究結(jié)果一致。

紅色部分為3個(gè)序列不完全一致位點(diǎn)；黑色方框中ATG為起始密碼子，方框中TAG為終止密碼子圖3 百合DXS基因多序列比對(duì)The red parts indicate some differences exist in the 3 sequences; the ATG in the black box is the start codon, the TAG in the black box is the stop codonFig.3 Multiple sequence alignment of DXS from lilies

圖4 LeDXS與其他植物DXS蛋白的系統(tǒng)進(jìn)化樹Fig.4 Phylogenetic tree analysis of LeDXS and DXS of other plants

本試驗(yàn)主要從百合中分離獲得一個(gè)DXS基因cDNA全長(zhǎng)，對(duì)其進(jìn)行了初步研究，發(fā)現(xiàn)LeDXS屬于DXSⅠ，是功能較為保守的一類，分析了該基因在不同品種中的表達(dá)模式，推測(cè)LeDXS在百合花香萜類化合物合成途徑中起重要作用，后期需進(jìn)一步對(duì)百合DXS基因家族成員數(shù)目、分類和功能以及在百合花香代謝調(diào)控中的作用機(jī)制進(jìn)行研究，對(duì)于明確花香差異的本質(zhì)原因，以及利用現(xiàn)代生物育種技術(shù)改良百合花香具有一定的意義。

品種名稱同表1；不同小寫字母代表不同品種的差異顯著性(P<0.05)圖5 DXS在不同品種百合的相對(duì)表達(dá)量The names of cultivars are the same as Table 1; Different normal letters show significant differences among different cultivars(P<0.05)Fig.5 Expression analysis of DXS in different cultivars

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