李 會(huì)，王 超，黃思杰，陳 健，楊立飛*

(1 南京農(nóng)業(yè)大學(xué) 園藝學(xué)院，南京 210095；2 環(huán)境保護(hù)部南京環(huán)境科學(xué)研究所，南京 210042；3 江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院 農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量安全與營養(yǎng)研究所，南京 210014)

天然多胺 (polyamine，PA) 包括腐胺(putrescine，Put)、亞精胺(spermidine，Spd) 和精胺(spermine，Spm)，是真核生物與原核生物細(xì)胞代謝過程中必需的一類小分子量多聚有機(jī)陽離子，其普遍分布于高等植物中[1]。目前，人們認(rèn)為PA參與植物一系列生理過程，包括生長、發(fā)育和應(yīng)激反應(yīng)[2-3]。內(nèi)源性PA含量取決于合成和分解代謝之間的動(dòng)態(tài)平衡，負(fù)責(zé)PA分解代謝的2類胺氧化酶分別為銅胺氧化酶 (copper amine oxidase，CuAO) 和多胺氧化酶 (polyamine oxidase，PAO)[4-5]。PAO在維護(hù)細(xì)胞多胺平衡方面扮演了重要的角色，植物PAO負(fù)責(zé)含次級(jí)氨基PAs的分解代謝，氧化Spd和Spm形成相應(yīng)的氨基醛和二氨基丙烷，并釋放過氧化氫 (H2O2)[6-7]。

越來越多的研究表明，PAO催化產(chǎn)生的H2O2在調(diào)控一系列生理生化過程中發(fā)揮重要作用，并直接或間接地參與植物生長發(fā)育的調(diào)控，例如，PAO催化Spd產(chǎn)生的H2O2可以激活Ca2+滲透通道來調(diào)控花粉管生長[8]，PAO還參與植物的氮代謝[9]，PAOs介導(dǎo)的分解代謝與程序性細(xì)胞死亡有關(guān)[10]。與此同時(shí)，PAO催化PAs的反應(yīng)，對(duì)于植物抵抗生物或非生物脅迫也有重要的影響，例如，通過PA氧化產(chǎn)生的H2O2參與超敏反應(yīng)，調(diào)控植物對(duì)病原菌的抗性[11]。此外，PAO還可以通過基因表達(dá)的差異性影響氧化還原相關(guān)蛋白的表達(dá)，從而使番茄增強(qiáng)對(duì)鹽脅迫的抵抗能力[12]。

植物PAO在不同的亞細(xì)胞位置具有特異性表達(dá)，例如，Slocum等[13]研究顯示豆科植物的PAO主要存在于胚軸組織的細(xì)胞壁上，而覃廣泉等[14]首次報(bào)道大豆PAO在細(xì)胞膜和液泡膜上也有分布。具有不同的生化功能的PAO，其亞細(xì)胞定位也具有特異性，負(fù)責(zé)PAs終極氧化反應(yīng)的ZmPAO1(玉米)、OsPAO7(水稻)位于質(zhì)外體[15-16]，而參與Spm逆向轉(zhuǎn)化的AtPAO1～5和OsPAO1、OsPAO3～5定位于細(xì)胞質(zhì)及過氧化物酶體中[17-18]，這表明了PAO在不同亞細(xì)胞中的表達(dá)對(duì)于其發(fā)揮不同的生理作用有著重要的意義。

植物PAOs由一個(gè)或幾個(gè)成員組成的小基因家族編碼，例如，擬南芥基因組中含有5個(gè)PAO基因 (AtPAO1～AtPAO5)；水稻基因組中包含7個(gè)PAO基因 (OsPAO1～OsPAO7)[19-20]；Cervelli等[21]也從玉米中分離到3個(gè)PAO基因。目前已從擬南芥[17]、水稻[18]、玉米[21]、大麥[22]、煙草[23]、蘋果[24]和楊樹[25]等植物中鑒定分離出了一系列編碼PAO的基因，但是其中只有擬南芥的PAO基因家族得到廣泛的關(guān)注和研究，在雙子葉植物中，對(duì)PAO基因家族成員的研究和分析還比較少。

番茄作為主要的蔬菜作物之一，它不但是重要的農(nóng)藝作物，也是研究雙子葉植物的模式植物之一。目前，對(duì)于番茄PAO的研究多集中于總酶活測(cè)定，而對(duì)番茄PAO基因家族信息的全面分析鮮有報(bào)道。本研究以番茄基因組數(shù)據(jù)為基礎(chǔ)，對(duì)番茄PAO基因家族進(jìn)行了鑒定和分析，系統(tǒng)地分析了番茄PAO基因家族的基本信息以及組織表達(dá)情況，旨在為進(jìn)一步對(duì)番茄PAO基因的克隆以及功能鑒定提供基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 材料與儀器

試驗(yàn)材料番茄 (Solanumlycopersicum)品種為‘合作906’，購自上海長種番茄種業(yè)有限公司；RNA提取試劑盒購自TIANGEN公司；反轉(zhuǎn)錄試劑盒和熒光定量PCR分析試劑盒 (SYBR Premix Ex Taq) 均購自大連TaKaRa公司。

所用實(shí)驗(yàn)儀器有光照培養(yǎng)箱 (寧波江南儀器有限公司)、電子天平 (AR5120,美國AHOMS公司)、實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀(美國Applied Biosystems 7500 Fast Real-Time PCR System)、凝膠成像系統(tǒng) (Gel Doc 2000，上海天能科技有限公司)、普通PCR儀 (美國BIORAD/伯樂，C1000)等。

1.2 方 法

1.2.1材料培養(yǎng)選取飽滿的番茄種子用1% NaClO溶液消毒10 min，用蒸餾水沖洗3遍，然后用去離子水浸種6～8 h，將其播種于培養(yǎng)皿中于黑暗處催芽。待根長1 cm時(shí)挑選生長狀況一致的幼苗，轉(zhuǎn)入Hoagland營養(yǎng)液中培養(yǎng)，光照培養(yǎng)箱的培養(yǎng)條件是：溫度26 ℃/22 ℃、光周期16/8 h、相對(duì)濕度75%、光照強(qiáng)度200 μmol·m-2·s-1。培養(yǎng)10 d，分別取真葉、子葉、莖、根提取總RNA。

1.2.2番茄SlPAOs的篩選及進(jìn)化分析從擬南芥基因組數(shù)據(jù)庫 TAIR (http://www.arabidopsis.org/) 中下載已經(jīng)報(bào)道的AtPAOs序列，作為檢索依據(jù)在SGN (https://solgenomics.net/) 的番茄基因組數(shù)據(jù)庫中進(jìn)行Blast檢索，獲得番茄同源SlPAOs基因序列及其氨基酸序列信息。已報(bào)道的水稻OsPAOs序列從水稻基因組數(shù)據(jù)庫RGAP (http://rice.plantbiology.msu.edu/) 獲得[18]。針對(duì)篩選到的番茄SlPAOs氨基酸序列以及擬南芥AtPAOs、水稻OsPAOs序列，利用Clustal X 2.1進(jìn)行多重比對(duì)，再通過MEGA 6.0構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹。

表1 引物序列信息

1.2.3番茄SlPAOs基因結(jié)構(gòu)分析將SGN中獲得的番茄SlPAOs基因組序列和CDS序列，分別輸入GSDS2.0 (http://gsds.cbi.pku.edu.cn/)，進(jìn)行內(nèi)含子和外顯子結(jié)構(gòu)分析[26]。

1.2.4番茄SlPAOs蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)與分析利用在線軟件ExPaSy中提供的Compute pI工具 (http://web.expasy.org/compute_pi/) 計(jì)算番茄SlPAOs的分子量、理論等電點(diǎn)；ProtScale工具 (http://web.expasy.org/protscale/) 分析其親/疏水性；ProtParam工具 (http://web.ex-pasy.org/protparam/) 分析蛋白的氨基酸組成及理化性質(zhì)；SOPMA工具 (https://npsa-prabi.ibcp.fr/cgi-bin/npsa_automat.pl? page=npsa_sopma.html) 預(yù)測(cè)分析其α-螺旋、β-折疊和無卷曲情況。蛋白結(jié)構(gòu)域利用在線網(wǎng)站(http://www. ebi.ac.uk/ interpro/search/sequence-search)進(jìn)行分析；亞細(xì)胞定位由WoLF PSORT Prediction程序 (http://wolfpsort.org.html) 進(jìn)行預(yù)測(cè)。

1.2.5番茄SlPAOs組織表達(dá)分析取干燥的種子及新鮮的真葉、子葉、莖、根提取組織總RNA，按照TaKaRa PrimeScriptTMRT reagent試劑盒說明書合成cDNA，4 ℃保存，作為后續(xù)PCR擴(kuò)增的模板。SlPAOs引物利用在線網(wǎng)站http://sg.idtdna.com/primerquest/Home/Index設(shè)計(jì)，引物序列信息見表1。根據(jù)熒光定量PCR分析試劑盒 (SYBR Premix Ex Taq) 說明，采用Applied Biosystems 7500 Fast Real-Time PCR System對(duì)目的基因相對(duì)表達(dá)量進(jìn)行qPCR分析。以看家基因Actin作為內(nèi)標(biāo)對(duì)表達(dá)結(jié)果進(jìn)行校準(zhǔn)。

1.2.6統(tǒng)計(jì)分析采用SPSS2.0對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行單因素方差分析 (ANOVA)，然后采用最小顯著極差法 (LSD) 進(jìn)行多重比較，分析任意兩個(gè)處理之間在0.05水平的差異顯著性。

2 結(jié)果與分析

2.1 番茄SlPAOs序列的篩選與鑒定

以擬南芥AtPAOs基因家族為檢索靶標(biāo)，從番茄基因組中檢索到了11個(gè)PAO基因，分別命名為SlPAO1-11 (表2)。這11個(gè)SlPAOs基因分布在7條不同的染色體上。SlPAO1位于1號(hào)染色體；SlPAO2、SlPAO7、SlPAO9、SlPAO10位于7號(hào)染色體；SlPAO3和SlPAO8位于12號(hào)染色體；SlPAO4、SlPAO5、SlPAO6、SlPAO11分別位于2、3、5、4號(hào)染色體。番茄11個(gè)SlPAOs可以編碼含478 (SlPAO5) 至2078 (SlPAO11) 個(gè)氨基酸的蛋白。SlPAOs蛋白的分子量范圍是52.86～227.87 kD，SlPAO9～11的分子量較之SlPAO1～8偏大。理論等電點(diǎn)分析結(jié)果顯示SlPAO9編碼堿性蛋白，其余呈酸性。

表2 番茄SlPAOs基因家族基本信息

2.2 番茄SlPAOs基因結(jié)構(gòu)分析

基因結(jié)構(gòu) (內(nèi)含子、外顯子、5′/3′非翻譯區(qū)) 分析結(jié)果表明：番茄SlPAOs基因結(jié)構(gòu)特征亦呈現(xiàn)明顯的亞家族分布規(guī)律 (圖1)。亞家族Ⅰ和Ⅱb中的SlPAO1-5具備完全一致的基因結(jié)構(gòu)特征，即：10個(gè)外顯子，9個(gè)內(nèi)含子，且都具有5′/3′非翻譯區(qū)；亞家族Ⅱa中的SlPAO6～8只有1個(gè)外顯子，無內(nèi)含子和5′/3′非翻譯區(qū)；亞家族Ⅲ中的SlPAOs基因結(jié)構(gòu)無明顯的規(guī)律特征，SlPAO9含有7個(gè)外顯子，無非翻譯區(qū)存在；SlPAO10和SlPAO11具有3′非翻譯區(qū)，外顯子分別為2個(gè)和8個(gè)。

2.3 番茄SlPAOs的進(jìn)化分類及蛋白結(jié)構(gòu)域分析

為了分析SlPAOs的進(jìn)化關(guān)系，利用11個(gè)SlPAOs、9個(gè)擬南芥AtPAOs[22]、11個(gè)水稻OsPAOs[26]的氨基酸序列構(gòu)建了系統(tǒng)發(fā)育樹 (圖2，A)。番茄SlPAO家族分為Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ 三大亞家族。其中SlPAO1屬于亞家族Ⅰ；SlPAO2～8歸于亞家族Ⅱ；SlPAO9～11歸于亞家族Ⅲ。根據(jù)Chen等[20]對(duì)水稻OsPAOs家族的功能分類，Ⅰ中的SlPAOs作用于PAs的最終分解代謝，Ⅱ中的SlPAOs作用于催化Spm向Spd的轉(zhuǎn)化。Ⅲ 中的SlPAOs雖然也具備典型的氨基氧化酶保守結(jié)構(gòu)域 (Amino_oxidase)，但其上游還具備獨(dú)特的SWIRM結(jié)構(gòu)域 (圖2，B)，其主要功能是催化H3K4組蛋白賴氨酸的脫甲基化，屬于組蛋白賴氨酸特異性脫甲基化酶類，而非真正的PAO。因此，Ⅰ和Ⅱ中的SlPAO1～8是典型的PAO，而Ⅲ 中SlPAO9～11是非典型PAO。對(duì)于亞家族Ⅱ中的SlPAOs，又可進(jìn)一步分為2種類型 (Ⅱa、Ⅱb)，Ⅱa包括SlPAO6～8，Ⅱb包括SlPAO2～5，這是基于其亞細(xì)胞定位有所不同。

2.4 番茄SlPAOs的亞細(xì)胞預(yù)測(cè)分析

利用WoLF PSORT Prediction預(yù)測(cè)結(jié)果顯示SlPAOs的亞細(xì)胞定位呈現(xiàn)明顯的亞家族特征(表3)。亞家族Ⅰ中的SlPAO1位于液泡；亞家族Ⅱb中的SlPAO2-5位于過氧化物酶體；亞家族Ⅱa中的SlPAO6和SlPAO8位于細(xì)胞質(zhì)內(nèi)，SlPAO7位于細(xì)胞核；亞家族Ⅲ分布較為廣泛，SlPAO9位于細(xì)胞質(zhì)，SlPAO10位于細(xì)胞核內(nèi)，SlPAO11位于質(zhì)膜。

2.5 番茄SlPAOs蛋白理化性質(zhì)與二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)分析

SlPAOs親水性預(yù)測(cè)結(jié)果顯示 (表4)，SlPAO1-SlPAO11預(yù)測(cè)值均小于0，結(jié)合脂肪系數(shù)來看，表明SlPAOs蛋白均為親水性蛋白。不穩(wěn)定指數(shù)的結(jié)果顯示：SlPAO1～SlPAO6以及SlPAO8 (不穩(wěn)定指數(shù)<40) 屬于較穩(wěn)定蛋白，而SlPAO7及SlPAO9～SlPAO11 (不穩(wěn)定指數(shù)>40) 穩(wěn)定性相對(duì)較差?？傮w來看，亞家族Ⅰ和Ⅱ中的SlPAOs相對(duì)穩(wěn)定。蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)結(jié)果顯示 (表4)：11個(gè)SlPAOs二級(jí)結(jié)構(gòu)主要組成部分是α-螺旋和無規(guī)則卷曲，延伸片段次之，β-折疊占很小的一部分(10%左右)，均無β-轉(zhuǎn)角結(jié)構(gòu)存在。

圖1 番茄SlPAOs的基因結(jié)構(gòu)Fig.1 Gene structure of tomato SlPAOs

A. 番茄(SlPAOs)、水稻(OsPAOs)和擬南芥(AtPAOs)基因家族系統(tǒng)進(jìn)化樹；B. SlPAOs蛋白結(jié)構(gòu)域分布圖2 PAO基因家族系統(tǒng)進(jìn)化樹及番茄SlPAOs蛋白結(jié)構(gòu)域分布A. Phylogenetic tree of PAO protein family in tomato (SlPAOs), rice (OsPAOs) and Arabidopsis (AtPAOs);B. Protein domain structure of tomato SlPAOsFig.2 Phylogenetic tree of PAO gene family and protein domain structure of tomato SlPAOs

2.6 番茄SlPAOs的組織表達(dá)分析

由于進(jìn)化和結(jié)構(gòu)分析中發(fā)現(xiàn)番茄中的SlPAO1～8編碼典型的PAO，我們進(jìn)一步分析了這8個(gè)基因在番茄植株不同組織 (種子、真葉、子葉、莖、根) 的相對(duì)表達(dá)量。結(jié)果如圖3所示，這些基因在不同組織中均有表達(dá)，但是相對(duì)表達(dá)量卻有很大差異。SlPAO1在莖中顯著高表達(dá)，而SlPAO2在干燥種子中顯著高表達(dá)；SlPAO3相對(duì)在葉片和莖中表達(dá)較高；SlPAO4的表達(dá)多集中于種子、莖、根；SlPAO5顯著富集于子葉和莖中，且極大高于其他組織；SlPAO6主要在真葉和根中表達(dá)；SlPAO7在真葉中表達(dá)顯著；SlPAO8主要表達(dá)于種子中。對(duì)于不同組織而言，干燥種子中相對(duì)表達(dá)量較高的有SlPAO2、SlPAO4、SlPAO8；真葉中相對(duì)表達(dá)量較高的有SlPAO3、SlPAO6、SlPAO7；子葉中相對(duì)表達(dá)量較高的有SlPAO3和SlPAO5；莖中相對(duì)表達(dá)量較高的有SlPAO1、SlPAO3、SlPAO5；根中相對(duì)表達(dá)量較高的有SlPAO4、SlPAO5、SlPAO6、SlPAO7。

表4 番茄SlPAOs蛋白理化性質(zhì)及二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)

表3 番茄SlPAOs亞細(xì)胞定位預(yù)測(cè)分析

3 討 論

本研究從番茄基因組中鑒定出11個(gè)PAO基因 (SlPAO1～11)，進(jìn)化樹和結(jié)構(gòu)與分析顯示亞家族Ⅰ和Ⅱ (包括Ⅱa和Ⅱb) 的SlPAO1～8編碼真正的PAO，而亞家族Ⅲ 的SlPAO9～11編碼蛋白為脫甲基化酶類 (屬于非典型性PAO)?；蚪Y(jié)構(gòu)分析、蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)和亞細(xì)胞定位預(yù)測(cè)分析亦顯示出：亞家族Ⅰ和Ⅱ具有明顯的規(guī)律特征。Angelini等[27]認(rèn)為植物中的PAO根據(jù)生化功能分為兩大類：一類負(fù)責(zé)PA的終極氧化反應(yīng)，一類負(fù)責(zé)PA的逆向轉(zhuǎn)化反應(yīng)。本研究分析所得番茄SlPAOs家族分類同樣符合這一特征。另外，進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)的多重亞家族分類表明了番茄SlPAOs可能的功能多樣性。AtPAO1和OsPAO7已被證明催化PA的最終代謝[16, 19]，由此可推測(cè)與它們同屬亞家族Ⅰ的番茄SlPAO1亦可能具備此生化功能。生化和遺傳學(xué)證據(jù)表明：OsPAO1和AtPAO5都是定位于細(xì)胞質(zhì)的直系同源功能蛋白，催化PA的逆向轉(zhuǎn)化[28]。進(jìn)化分析亦證實(shí)OsPAO1和AtPAO5屬于同一個(gè)亞家族 (Ⅱa)，其中包括番茄SlPAO6～8?；蚪Y(jié)構(gòu)分析顯示SlPAO6～8具備區(qū)別于其他SlPAOs的獨(dú)特特征，即：只有1個(gè)外顯子 (無內(nèi)含子)。通過對(duì)OsPAO1和AtPAO5的基因組序列分析發(fā)現(xiàn)兩者也是只具有1個(gè)外顯子，這表明亞家族Ⅱa中不同物種的PAOs基因在進(jìn)化上相對(duì)保守一致，而基因功能的重要性可能是導(dǎo)致這種自然保守進(jìn)化的原因[29]，無內(nèi)含子意味著不需要轉(zhuǎn)錄過程的拼接修飾過程，從而可能快速完成轉(zhuǎn)錄翻譯過程并發(fā)揮生理功能。有報(bào)道證明水稻中的OsPAO3/4/5定位于過氧化物酶體，催化PA的逆向轉(zhuǎn)化[18]，進(jìn)化分析顯示亞家族Ⅱb中包含了OsPAO3/4/5和番茄SlPAO2～5，從而可以推測(cè)出SlPAO2～5可能具備與OsPAO3/4/5相似的生化功能。另外，亞家族I和IIb中的所有的SlPAOs(SlPAO1～5) 基因結(jié)構(gòu)特征非常一致，但較為復(fù)雜 (10外顯子/9內(nèi)含子)。番茄轉(zhuǎn)座子對(duì)于基因結(jié)構(gòu)的進(jìn)化和形成發(fā)揮重要作用[30]，進(jìn)一步解析基因組中轉(zhuǎn)座子分布規(guī)律對(duì)這些基因中內(nèi)含子形成的影響，將有助于揭示SlPAO1～5進(jìn)化規(guī)律與生理功能之間的相關(guān)性。

不同小寫字母表示同一基因在不同組織中的表達(dá)差異顯著(P <0.05)圖3 番茄SlPAOs家族8個(gè)基因在不同組織(種子、真葉、子葉、莖、根)中的相對(duì)表達(dá)分析Different normal letters indicate significant differences among treatments at 0.05 levelFig.3 Analysis of relative expression of SlPAOs in different tissues(seed, eupylla, cotyledon, stem, root)

基因表達(dá)結(jié)果顯示SlPAO1～8在不同組織中的表達(dá)呈現(xiàn)豐富的多樣性。有報(bào)道證明水稻OsPAO5及其產(chǎn)生的H2O2參與調(diào)控水稻種子的萌發(fā)過程[20]。我們研究發(fā)現(xiàn)與OsPAO5親緣關(guān)系較近的SlPAO4在種子和幼苗根中的表達(dá)量相對(duì)較高，說明SlPAO4和OsPAO5可能在分別調(diào)控雙子葉和單子葉植物生理過程中發(fā)揮相似作用。本研究發(fā)現(xiàn)SlPAO7在葉片中具有相對(duì)較高的表達(dá)量，而最近在擬南芥中的研究可能解釋此生理現(xiàn)象，SlPAO7與擬南芥AtPAO5親緣關(guān)系較近，遺傳學(xué)證據(jù)顯示AtPAO5通過調(diào)控葉綠素和脫落酸信號(hào)應(yīng)對(duì)鹽脅迫[31]，同時(shí)脫落酸是調(diào)控葉片氣孔關(guān)閉的關(guān)鍵信號(hào)分子。另外，我們還發(fā)現(xiàn)SlPAO5在各組織中的表達(dá)量比種子高達(dá)27～174倍。進(jìn)化分析顯示番茄SlPAO5與AtPAO4親緣關(guān)系較近，Sequeramutiozabal等[32]通過AtPAO4功能缺失突變體的代謝組學(xué)分析，發(fā)現(xiàn)AtPAO4能夠通過影響植物整個(gè)代謝組循環(huán)來調(diào)控植物衰老過程，由此可推測(cè)高表達(dá)量的SlPAO5可能在調(diào)控植物生理過程方面發(fā)揮多重作用。

綜上所述，本研究從番茄基因組中分析出了SlPAOs家族基因，分類分析和組織表達(dá)分析顯示出其可能的生化和生理功能多樣性，為后續(xù)這些基因的功能鑒定提供了重要參考。

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