董 云，王 毅，靳豐蔚，吳旺澤，方 彥，徐妙云,王 磊

(1 甘肅省農(nóng)業(yè)科學(xué)院 作物研究所，蘭州 730070; 2 西北師范大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，蘭州 730070；3 甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué) 干旱生境作物學(xué)重點實驗室，蘭州 730070； 4 中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院 生物技術(shù)研究所，北京 100081)

農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中，通過增加種植密度來提高產(chǎn)量是一個重要的育種目標(biāo)，同時，緊湊的株型有利于中、后期的田間管理和機(jī)械化采摘，可以提高勞動生產(chǎn)率、減輕勞動強(qiáng)度和降低生產(chǎn)成本[1]。因為株型發(fā)育對作物的重要意義，各國學(xué)者通過QTL和突變體資源鑒定到了一些調(diào)控株型發(fā)育的基因，像水稻LAZY1[2]、玉米ZmLAZY1[3]、擬南芥AtLAZY1和ATLPA1等調(diào)控了植物葉、莖分枝等株型發(fā)育[3]。另外生長素的不對稱分布以及生長素合成和轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑調(diào)控的莖向地性也影響植物株型發(fā)育[4]。油菜是中國重要的油料作物之一，同時也是發(fā)展能源農(nóng)業(yè)的優(yōu)良經(jīng)濟(jì)作物。株型性狀是油菜重要的數(shù)量性狀，涉及到分枝夾角、植株高度、分枝數(shù)、分枝部位高度、結(jié)角密度、主花序有效角果數(shù)等性狀，由主效基因控制[5-6]。油菜株型發(fā)育對油菜產(chǎn)量和機(jī)械化收割具有重要意義，然而油菜株型發(fā)育的調(diào)控機(jī)理目前還不清楚[7]。

miRNAs是一類在進(jìn)化上保守的長約21nt的非編碼單鏈RNA，主要在轉(zhuǎn)錄后通過介導(dǎo)靶mRNA降解或翻譯抑制來調(diào)控基因的表達(dá)水平，在生物體生長發(fā)育過程、生物或者非生物脅迫中起著非常重要的作用[8-9]。油菜復(fù)雜的分枝系統(tǒng)，是模式植物擬南芥和水稻所不具備的。研究miRNA參與調(diào)控油菜分枝形成和發(fā)育的遺傳控制機(jī)理具有重要意義。前期的研究結(jié)果表明Bna-miR1140是蕓薹屬特異miRNA[10]，并通過降解組測序分析得到Bna-miR1140的靶基因為一種糖基轉(zhuǎn)移酶(glycosyltransferase)和響應(yīng)調(diào)節(jié)因子(Arabidopsis response regulator ARR8-like protein)[11]，但Bna-miR1140參與調(diào)控株型發(fā)育的機(jī)理目前還不清楚。為了進(jìn)一步了解Bna-miR1140參與油菜株型發(fā)育的生物學(xué)功能，我們對蕓薹屬特異的miRNA家族Bna-miR1140前體在油菜中進(jìn)行過表達(dá)研究，以期初步了解Bna-miR1140參與油菜株型發(fā)育的表達(dá)調(diào)控機(jī)制，為油菜品種改良和油菜miRNAs調(diào)控機(jī)制的研究提供理論依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 材 料

甘藍(lán)型油菜(BrassicanapusL.)栽培種westar，由甘肅省農(nóng)業(yè)科學(xué)院作物研究所提供。

1.2 方 法

1.2.1油菜Bna-miR1140基因的分離根據(jù)Bna-miR1140前體序列設(shè)計引物，上游引物Bna-miR1140Fw的5′端添加XbaⅠ酶切位點，下游引物Bna-miR1140Rv的5′端添加SacⅠ酶切位點；測序引物NOS70按照植物表達(dá)載體pPZP212上NOS終止子序列設(shè)計；鑒定引物35SFw和35S50按照35S∷Bna-miR1140構(gòu)建設(shè)計。本研究所用引物序列詳見表1，均由上海生物工程有限公司合成。以CTAB法[12]從油菜幼苗中提取的DNA為模板，PCR擴(kuò)增197 bp的Bna-miR1140前體序列片段。PCR反應(yīng)體系：Taq(2 U/μL) 0.5 μL，10×Taq反應(yīng)緩沖液2.0 μL，dNTP mix (10 mmol/L) 0.5 μL，Bna-miR1140 Fw (10 μmol/L) 0.5 μL，Bna-miR1140 Rv (10 μmol/L) 0.5 μL，油菜DNA 1.0 μL，dH2O 15 μL。PCR反應(yīng)條件：94 ℃預(yù)變性4 min；94 ℃變性40 s，57.9 ℃退火40 s,72 ℃延伸40 s，共35個循環(huán)；72 ℃延伸10 min。

1.2.2油菜Bna-miR1140基因的過表達(dá)載體構(gòu)建取2.0 L PCR產(chǎn)物進(jìn)行1.5%瓊脂糖凝膠電泳，粗略估計PCR產(chǎn)物的擴(kuò)增量。根據(jù)PCR產(chǎn)物量，按照載體pEASY-T1Cloning Vector使用說明進(jìn)行T連接反應(yīng)，反應(yīng)結(jié)束后轉(zhuǎn)化大腸桿菌Trans1-T1。通過藍(lán)白斑篩選得到的單克隆，經(jīng)PCR和酶切鑒定后，送北京中科希林生物公司用引物M13﹢進(jìn)行測序驗證。用限制性內(nèi)切酶XbaⅠ和SacⅠ對pPZP212質(zhì)粒和測序正確的pEASY-T1-miR1140質(zhì)粒進(jìn)行雙酶切，凝膠電泳切膠回收10 095和197 bp DNA片段，膠回收后的Bna-miR1140基因前體片段和pPZP212載體片段用T4DNA連接酶按照摩爾比6∶1，在恒溫16 ℃條件下連接過夜。取2 LBna-miR1140基因前體片段與pPZP212載體片段連接的溶液，轉(zhuǎn)化大腸桿菌感受態(tài)Trans1-T1，再PCR和酶切鑒定陽性重組子35S∷Bna-miR1140，對鑒定正確的陽性重組子，搖菌后送北京中科希林生物公司用引物NOS70進(jìn)行測序驗證。測序驗證正確的陽性重組子35S∷Bna-miR1140電擊轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌LBA4404。

表1 引物名稱及序列

1.2.3油菜的轉(zhuǎn)化及陽性植株鑒定按照Prem L Bhalla和Mohan B Singh的方法[13]，通過農(nóng)桿菌介導(dǎo)浸染油菜子葉柄轉(zhuǎn)化油菜。經(jīng)kanamycin不同梯度培養(yǎng)篩選到的生根壯苗煉苗移栽后，用CTAB法提取其DNA，35SFw/Bna-miR1140 Rv和35S50/Bna-miR1140 Rv兩對鑒定引物分別進(jìn)行PCR擴(kuò)增，1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測，擴(kuò)增出511 bp和253 bp條帶的為陽性株。

1.2.4過表達(dá)35S∷Bna-miR1140的T0代轉(zhuǎn)化株及T1代表型分析以野生型油菜和轉(zhuǎn)化空載體pPZP212的T0代陽性株作對照，對PCR鑒定呈陽性的過表達(dá)35S∷Bna-miR1140的T0代轉(zhuǎn)化株進(jìn)行表型觀察，包括葉片形態(tài)、花器結(jié)構(gòu)、株型等，并統(tǒng)計分析株高、分枝部位、一次分枝、二次分枝、主花序長度、全株有效角果數(shù)、單株生產(chǎn)力、千粒重等。

選取分枝數(shù)多、PCR鑒定呈陽性的5株過表達(dá)35S∷Bna-miR1140的T0代轉(zhuǎn)化株系結(jié)的種子，在河北廊坊中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院試驗基地春播，試驗統(tǒng)一采用隨機(jī)區(qū)組排列，3次重復(fù)，小區(qū)面積2 m2，10行區(qū)，油菜保苗株數(shù)35株/m2。對照為野生型油菜栽培種westar和轉(zhuǎn)化空載體pPZP212的油菜T1代。試驗地土壤肥力和施肥水平同當(dāng)?shù)卮筇锷a(chǎn)條件。生育期間觀察記載出苗期、現(xiàn)蕾期、抽薹期、開花期、終花期、成熟期，并于盛花期調(diào)查每小區(qū)中株型有變異、分枝數(shù)多的株數(shù)。

2 結(jié)果與分析

2.1 油菜Bna-miR1140基因的分離

本研究選取Bna-miR1140 (MI0006482)為研究對象(圖1)。以油菜DNA為模板，Bna-miR1140 Fw為正向引物，Bna-miR1140 Rv為反向引物， PCR擴(kuò)增Bna-miR1140基因的前體序列，片段長197 bp(圖2，a)。PCR產(chǎn)物與pEASY-T1連接后，利用引物Bna-miR1140 Fw和Bna-miR1140 Rv，酶NcoⅠ/HindⅢ、SacⅠ，分別對質(zhì)粒Bna-miR1140-pEASY-T1進(jìn)行PCR、雙酶切及單酶切鑒定，結(jié)果質(zhì)粒PCR條帶和酶切條帶大小均為200 bp左右(圖2，b～d)，說明Bna-miR1140基因的前體序列PCR產(chǎn)物成功連接到克隆載體。并對Bna-miR1140-pEASY-T1測序驗證，序列長197 bp，與miRbase18.0中比對結(jié)果一致，證明PCR擴(kuò)增產(chǎn)物為Bna-miR1140基因的前體序列，符合后續(xù)實驗中表達(dá)載體構(gòu)建和表達(dá)分析的要求。

2.2 油菜Bna-miR1140植物過表達(dá)載體的構(gòu)建

通過用SacI和XbaI分別雙酶切植物表達(dá)載體質(zhì)粒pPZP212和測序驗證正確的克隆質(zhì)粒pEASY-T1-miR1140(圖3，a)，切膠回收197和10 095 bp質(zhì)粒酶切片段(圖3，b、c)，再用T4DNA連接酶將回收的Bna-miR1140基因前體片段和pPZP212載體片段連接。轉(zhuǎn)化大腸桿菌感受態(tài)后，以其質(zhì)粒DNA為模板，用引物Bna-miR1140 Fw和Bna-miR1140 Rv 進(jìn)行了PCR擴(kuò)增，對擴(kuò)增結(jié)果與PCR鑒定克隆載體Bna-miR1140-pEASY-T1結(jié)果一致的質(zhì)粒，用酶NcoⅠ、EcoR Ⅰ/XbaⅠ、SacⅠ/PstⅠ分別進(jìn)行單酶切和雙酶切，酶切結(jié)果見圖3，d～f。NcoⅠ單酶切產(chǎn)生的2個片段大小分別為1 317和698 bp，EcoRⅠ/XbaⅠ雙酶切產(chǎn)生的片段大小462 bp，SacⅠ/PstⅠ雙酶切產(chǎn)生的片段大小1 050 bp，3次酶切片段大小符合理論值。PCR和酶切均鑒定為陽性的重組子35S∷Bna-miR1140經(jīng)測序驗證后，得到的序列與克隆載體pEASY-T1-miR1140測序結(jié)果一致，說明Bna-miR1140基因前體片段連接到表達(dá)載體pPZP212上(圖4)。

紅色堿基為miR1140成熟序列圖1 油菜Bna-miR1140前體二級結(jié)構(gòu)發(fā)卡圖The mature nucleotides of miR1140 are red nucleotidesFig.1 Stem-loop structure of Bna-miR1140 precursors

a. 以油菜DNA為模板擴(kuò)增Bna-miR1140基因片段；b. Bna-miR1140-pEASY - T1的PCR鑒定；c. Nco Ⅰ/Hind Ⅲ 雙酶切鑒定Bna-miR1140-pEASY-T1； d. Sac Ⅰ單酶切鑒定Bna-miR1140-pEASY-T1A.以油菜DNA為模板PCR擴(kuò)增Bna-miR1140基因的前體序列；B.以Bna-miR1140-pEASY-T1的質(zhì)粒為模板PCR擴(kuò)增Bna-miR1140基因的片段；C. Nco Ⅰ/Hind Ⅲ 雙酶切鑒定Bna-miR1140-pEASY-T1；D. Sac Ⅰ單酶切鑒定Bna-miR1140-pEASY-T1；M. DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)；N. 陰性對照圖2 油菜Bna-miR1140基因的克隆和鑒定a. PCR amplification for the precursor fragments of Bna-miR1140 from cDNA of B. napus; b. Identification of Bna-miR1140-pEASY-T1 by PCR; c. Identification of Bna-miR1140-pEASY-T1 by Nco Ⅰ/Hind Ⅲ double enzyme digestion; d. Identification of Bna-miR1140-pEASY-T1 by Sac Ⅰ enzyme digestionA. PCR amplification for the precursor fragments of Bna-miR1140 from cDNA of B. napus; B. PCR amplification for the precursor fragments of Bna-miR1140 from Bna-miR1140-pEASY-T1；C. Identification of Bna-miR1140-pEASY-T1 by Nco Ⅰ/Hind Ⅲ double enzyme digestion; D. Identification of Bna-miR1140-pEASY-T1 by Sac Ⅰ enzyme digestion; M. marker; N. Negative controlFig.2 PCR amplification for the precursor fragments of Bna-miR1140 and identification

a．Sac Ⅰ/Xba Ⅰ對pPZP212和pEASY-T1-miR1140的酶切；b. pPZP212酶切片段的膠回收；c. pEASY-T1-miR1140酶切后膠回收的Bna-miR1140片段；d. Nco Ⅰ單酶切鑒定35S∷Bna-miR1140；e. EcoR Ⅰ/Xba Ⅰ雙酶切鑒定35S∷Bna-miR1140；f. Sac Ⅰ/Pst Ⅰ雙酶切鑒定35S∷Bna-miR1140；A. Sac Ⅰ/Xba Ⅰ對載體pPZP212的酶切產(chǎn)物；B. Sac Ⅰ/Xba Ⅰ對pEASY-T1-miR1140的酶切產(chǎn)物；C. 膠回收酶切pPZP212后的載體片段；D. pEASY-T1-miR1140酶切后膠回收的Bna-miR1140片段； E. Nco Ⅰ酶切鑒定35S∷Bna-miR1140；F. EcoR Ⅰ/Xba Ⅰ雙酶切鑒定35S∷Bna-miR1140；G. Sac Ⅰ/Pst Ⅰ雙酶切鑒定35S∷Bna-miR1140；M. DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)圖3 過表達(dá)載體35S∷Bna-miR1140的構(gòu)建和酶切鑒定a. pPZP212 and pEASY-T1-miR1140 were digested by enzyme Sac I/Xba I; b. Fragment of pPZP212 recovered after enzyme digestion; c. Fragment of Bna-miR1140 recovered from pEASY-T1-miR1140 after enzyme digestion; d. Identification of 35S∷Bna-miR1140 by Nco Ⅰ digestion; e. Identification of 35S∷Bna-miR1140 by EcoR Ⅰ/Xba Ⅰ digestion; f. Identification of 35S∷Bna-miR1140 by Sac Ⅰ/Pst Ⅰ digestionA. pPZP212 was digested by enzyme Sac Ⅰ/Xba Ⅰ；B. pEASY-T1-miR1140 was digested by enzyme Sac Ⅰ/Xba Ⅰ；C. Fragment of pPZP212 recovered after enzyme digestion；D. Fragment of Bna-miR1140 recovered from pEASY-T1-miR1140 after enzyme digestion； E. Identification of 35S∷Bna-miR1140 by Nco Ⅰ digestion；F. Identification of 35S∷Bna-miR1140 by EcoR Ⅰ/Xba Ⅰ digestion； G. Identification of 35S∷Bna-miR1140 by Sac Ⅰ/Pst Ⅰ digestion；M. DNA markerFig.3 Construction of overexpression vector 35S∷Bna-miR1140 and identification by enzyme digestion

2.3 過表達(dá)載體35S∷Bna-miR1140轉(zhuǎn)化油菜和轉(zhuǎn)基因苗篩選

轉(zhuǎn)化了過表達(dá)載體35S∷Bna-miR1140的農(nóng)桿菌LBA4404(OD650 0.5)懸浮液，共計浸染400個附帶2 mm葉柄的油菜子葉，在恢復(fù)培養(yǎng)后，進(jìn)行了愈傷誘導(dǎo)，總共誘導(dǎo)出愈傷388個，出愈率97%。選取無褐化、無污染的愈傷320個，在低濃度25 mg/L kanamycin抗性芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基中生長，誘導(dǎo)出芽107個，芽誘導(dǎo)率 33.4%。挑取生長健壯、無污染和無褐化的99個發(fā)生芽，繼續(xù)在低濃度25 mg/L kanamycin抗性芽生長培養(yǎng)基中生長4周，然后轉(zhuǎn)移至高濃度50 mg/L kanamycin抗性篩選培養(yǎng)基中生長4周(圖5，a、b)，篩選出綠苗數(shù)25個，白化苗39個，壞死和污染的苗35個。將所有綠苗轉(zhuǎn)接到生根培養(yǎng)基上，1月后發(fā)生根的苗數(shù)為24株(圖5，c)，出根率為57.6%。通過高濃度50 mg/L kanamycin抗性篩選后，將初步確定為陽性的24株抗性轉(zhuǎn)化植株苗煉苗后，移栽在花盆中進(jìn)行培養(yǎng)(圖5，d)。

圖4 表達(dá)載體35S∷Bna-miR1140 T-DNA區(qū)結(jié)構(gòu)Fig.4 The structure of T-DNA region in expression vector of 35S∷Bna-miR1140

2.4 轉(zhuǎn)化35S∷Bna-miR1140油菜株的PCR鑒定

以提取的24株轉(zhuǎn)化35S∷Bna-miR1140的油菜苗基因組DAN為模板，利用35S Fw/Bna-miR1140-1140 Rv和35S50/Bna-miR1140-1140 Rv兩對引物，分別對這些DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增，野生型(WT)作為陰性對照，大腸桿菌質(zhì)粒Bna-miR1140-pPZP212作為陽性對照。瓊脂糖凝膠電泳檢測后， 35SFw/Bna-miR1140-1140 Rv有20株擴(kuò)增出目的條帶(圖6，a～c)，35S50/Bna-miR1140-1140 Rv僅14株擴(kuò)增出目的條帶，且與35S FW/Bna-miR1140-1140 Rv的PCR鑒定為陽性的植株均對應(yīng)(圖6，d、e)，并且2對引物分別擴(kuò)增出的片段大小與陽性對照相同，條帶大小分別為511 和253 bp，從而最終確定過表達(dá)Bna-miR1140基因的轉(zhuǎn)基因油菜共14株。

2.5 轉(zhuǎn)化35S∷Bna-miR1140油菜株T0代表型分析

以野生型油菜和轉(zhuǎn)化空載體pPZP212的T0代陽性株作對照，對PCR鑒定呈陽性的過表達(dá)35S∷Bna-miR1140的T0代轉(zhuǎn)化株進(jìn)行表型觀察，結(jié)果顯示，過表達(dá)Bna-miR1140油菜株葉片形態(tài)、花器結(jié)構(gòu)沒有變異，均與對照相同，但其中有5株過表達(dá)Bna-miR1140油菜株株型表現(xiàn)與對照差異較大，過表達(dá)Bna-miR1140油菜株出現(xiàn)雙主序表型，分枝數(shù)較對照明顯增多(圖7)。由表2可見，過表達(dá)Bna-miR1140油菜株的株高、主花序長度、主花序結(jié)角數(shù)和千粒重都與對照相當(dāng)，而分枝部位較對照低，分枝數(shù)增多，致使全株有效角果數(shù)增多，從而使單株生產(chǎn)力較對照高26%。

a、b. 抗性篩選，紅色箭頭標(biāo)注為白化苗；c.根誘導(dǎo)；d. 煉苗圖5 過表達(dá)載體35S∷Bna-miR1140轉(zhuǎn)化油菜及陽性苗抗性篩選a, b. Selection of transgenic shoots with kanamycin, red arrows directed albinoes; c.Root initiation; d. Seedling hardeningFig.5 B. napus transformed with 35S∷Bna-miR1140 and kanamycin screening of positive seedling

a～c. 35SFw/ Bna-miR1140-1140Rv擴(kuò)增；d、e. 35S50/ Bna-miR1140-1140Rv擴(kuò)增；P. 陽性對照；N. 陰性對照；M. DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)；1～24. 轉(zhuǎn)基因油菜T0代株系圖6 過表達(dá)Bna-miR1140的T0代油菜轉(zhuǎn)化株P(guān)CR鑒定a-c. PCR amplification by primers 35SFw and Bna-miR1140-1140Rv; d and e. PCR amplification by primers 35S50 and Bna-miR1140-1140Rv; P. Positive control; N. Negative control；M. Marker; 1-24. Transgenic B. napus T0 linesFig.6 Identification of transgenic B. napus T0 lines with PCR

a. 轉(zhuǎn)化空載體pPZP212 T0代油菜株(CK)；b～f. 過表達(dá)Bna-miR1140的T0代油菜轉(zhuǎn)化株圖7 過表達(dá)Bna-miR1140的T0代油菜轉(zhuǎn)化株成株期表型a. pPZP212 transformed T0 lines(CK); b-f. Bna-miR1140 transformed T0 linesFig.7 Phenotype at adult stage of Bna-miR1140 transgenic T0 lines

株高Plantheight/cm分枝數(shù)Branchnumber主花序長度Lengthof maininflorescence/cm主花序結(jié)角數(shù)Silique mumberof main inflorescence全株有效結(jié)角數(shù)Totalavailable silique角粒數(shù)Seedsper silique角果長度Siliquelength/cm千粒重Grainweight/g單株生產(chǎn)力Yeild per plant/gWT10974833149225.52.59.5pPZP212113643331302462.59Bna-miR11401221246362002562.512

注：表中數(shù)據(jù)為所考單株的平均值

Note: the data are all average in table

表3 轉(zhuǎn)化35S∷Bna-miR1140油菜株T1代田間物候期(日/月)

表4 轉(zhuǎn)化35S∷Bna-miR1140油菜株T1代株型變異株觀測值及卡方檢驗

2.6 轉(zhuǎn)化35S∷Bna-miR1140油菜株T1代田間表型分析

由表3可見，各小區(qū)出苗期一致，但在現(xiàn)蕾期及以后的各時期中，5株過表達(dá)35S∷Bna-miR1140的T1代轉(zhuǎn)化株系生育期整體推遲。經(jīng)方差分析和多重比較，過表達(dá)35S∷Bna-miR1140的T1代轉(zhuǎn)化株系與對照間全生育期差異極顯著，全生育期較對照延長9～14 d。

對過表達(dá)35S∷Bna-miR1140的T1代轉(zhuǎn)化株系小區(qū)中的株型有變異、分枝數(shù)多的株數(shù)進(jìn)行了調(diào)查統(tǒng)計，結(jié)果見表4。經(jīng)卡方檢驗，除株系OE4-Bna-miR1140外，其余4個株系OE1-Bna-miR1140、OE2-Bna-miR1140、OE3-Bna-miR1140和OE5-Bna-miR1140等 T1代均符合3:1的孟德爾分離規(guī)律。

3 討 論

株型育種是作物高產(chǎn)育種的重要內(nèi)容，選育理想的油菜株型一直是油菜育種者追求的重要目標(biāo)之一。關(guān)于油菜理想株型的研究較多，有的研究用無花瓣材料構(gòu)建理想株型[14]，有的用雙主序構(gòu)建理想油菜株型[15]；一些研究還認(rèn)為株高適中、分枝數(shù)適中、株型緊湊型的品種是理想的株型[16]。2000年趙繼獻(xiàn)對4個油研品種的株型結(jié)構(gòu)以及性狀間的相關(guān)性研究表明，分枝角度、分枝長度、分枝粗、節(jié)間長是株型結(jié)構(gòu)的主要特征[6]，這些研究均為油菜理想株型的選育提供了理論依據(jù)。株型性狀一般認(rèn)為屬于多基因控制的數(shù)量性狀，但對于其遺傳效應(yīng)的分析卻了解甚少，大多數(shù)株型性狀與單株產(chǎn)量以及產(chǎn)量構(gòu)成性狀之間均存在顯著或極顯著的遺傳相關(guān)[17]。盡管油菜分枝系統(tǒng)非常復(fù)雜，但對油菜生產(chǎn)具有重要意義，目前對油菜分枝調(diào)控的遺傳規(guī)律和分子機(jī)理還不清楚。

高等植物莖的分枝系統(tǒng)決定了形態(tài)各異的株型結(jié)構(gòu)，植物通過在葉腋中形成新的分生組織產(chǎn)生分枝，分枝的形成受到植株發(fā)育階段、環(huán)境因素和激素的嚴(yán)格調(diào)控[18]。最近大量的研究表明miRNA調(diào)控了植物生長發(fā)育的各個方面，miRNA靶標(biāo)中的50%左右是在發(fā)育模式中起重要作用的轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子[19]。在擬南芥中miR159家族通過負(fù)調(diào)控幾個TCP和MYB轉(zhuǎn)錄因子家族成員，參與葉的發(fā)育[20]，miR160通過對ARF10、ARF16和ARF17轉(zhuǎn)錄本的切割，調(diào)控芽和根的發(fā)育[21]，miR164靶向基因CUC1、CUC2和CUC3能夠調(diào)控腋芽頂端分生組織從而影響抑制植物分枝的發(fā)育[22-23]。我們前期的研究結(jié)果表明Bna-miR1140是蕓薹屬特異miRNA[10]，Bna-miR1140的靶基因為一種糖基轉(zhuǎn)移酶(glycosyltransferase)和響應(yīng)調(diào)節(jié)因子(Arabidopsis response regulator ARR8-like protein)[11]。糖基轉(zhuǎn)移酶能催化糖轉(zhuǎn)變?yōu)楦鞣N受體分子介導(dǎo)植物生長發(fā)育，在植物中是一個超家族基因，在擬南芥中有超過350個糖基轉(zhuǎn)移酶基因[24]。在擬南芥中超表達(dá)西洋參糖基轉(zhuǎn)移酶基因PgUGT72AL1，導(dǎo)致腋下葉分支紋理，植株株型變化[25]；在蘋果中沉默根皮素酚特異的糖基轉(zhuǎn)移酶基因UGT88F1導(dǎo)致了節(jié)間縮短，狹窄葉的株型變化[26]。我們通過降解組測序分析得到油菜Bna-miR1140的靶基因為一種糖基轉(zhuǎn)移酶，在油菜中過表達(dá)油菜Bna-miR1140前體序列，14株T0代油菜陽性株中有5株表現(xiàn)雙主序表型，分枝數(shù)明顯增多，其他9株陽性株均與野生型油菜表型一致；卡方檢驗分枝數(shù)增多、株型有變異的5個株系的T1代表型，結(jié)果發(fā)現(xiàn)其中4株的株型變異遺傳符合3∶1的孟德爾分離規(guī)律，說明油菜Bna-miR1140的確調(diào)控了株型的發(fā)育，但Bna-miR1140如何調(diào)控糖基轉(zhuǎn)移酶基因來影響油菜株型發(fā)育我們不得而知。我們下一步的工作將通過酵母雙雜和CoIP的試驗從分子機(jī)理去揭示Bna-miR1140如何和糖基轉(zhuǎn)移酶相互作用來參與油菜株型發(fā)育。

除了糖基轉(zhuǎn)移酶為油菜Bna-miR1140的靶向基因，我們的研究也發(fā)現(xiàn)擬南芥響應(yīng)基因ARR8-like protein也是Bna-miR1140的調(diào)控靶基因。我們知道生長素的不對稱分布以及生長素合成和轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑調(diào)控的莖向地性也會影響植物株型發(fā)育[4]，而ARR基因的表達(dá)又受到生長素的調(diào)控，像ARR5基因在根和莖頂端分生組織高效表達(dá)，可能和株型發(fā)育相關(guān)[27]。arr345689六突對生長素的調(diào)控極其敏感，而生長素的分布及合成會影響莖的向地性，從而影響株型發(fā)育[28]，ARR家族中ARR4和ARR8也涉及到生長素的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)[29]。這些研究表明ARR通過生長素的調(diào)控參與株型發(fā)育，也間接說明我們對Bna-miR1140的參與調(diào)控株型發(fā)育的靶基因ARR8-like protein的篩選是可信的，后期的研究將從生長素調(diào)解方面對Bna-miR1140參與的株型發(fā)育進(jìn)行深入研究?？傊?，我們在油菜過表達(dá)Bna-miR1140前體序列的研究表明，轉(zhuǎn)基因油菜的株高、主花序長度、主花序結(jié)角數(shù)和千粒重都沒有發(fā)生明顯變化，而分枝部位較對照降低，分枝數(shù)增多，致使全株有效角果數(shù)增多，從而使單株生產(chǎn)力較對照高26%。具體油菜Bna-miR1140如何通過調(diào)控靶向糖基轉(zhuǎn)移酶和ARR8-like protein參與株型發(fā)育的分子機(jī)理我們還不清楚，將來的研究將從這方面闡述Bna-miR1140參與油菜株型調(diào)控的分子機(jī)理。

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