吳琪，吳倩，周曉紅，吳玲慧（1.湖北中醫(yī)藥大學(xué)臨床技能實(shí)訓(xùn)中心，武漢0061；.上海市東方醫(yī)院南院血液透析室，上海 001；.湖北中醫(yī)藥大學(xué)針灸骨傷學(xué)院，武漢 0061；.咸寧市婦幼保健院兒童保健中心計(jì)劃免疫科，湖北咸寧 7000）

強(qiáng)直性脊柱炎（Ankylosing spondylitis，AS）是以骶髂關(guān)節(jié)和脊柱慢性炎癥為主的全身性疾病[1]，最終病變發(fā)展為中樞關(guān)節(jié)的纖維化和骨性強(qiáng)直[2]，并由此引起腰背僵硬或疼痛、脊柱強(qiáng)直、畸形愈合等臨床癥狀[3]。據(jù)統(tǒng)計(jì)，我國(guó)AS患病率為0.3%，且好發(fā)于青、中年男性[4]，具有較高的致殘率和至畸率，目前已成為國(guó)內(nèi)外人口與健康研究領(lǐng)域的研究重點(diǎn)[5]。病理形成骨是AS患者致殘的主要原因，AS治療最終必須解決正常韌帶及滑膜骨化強(qiáng)直問題[6]。成骨過程受多種因素、多個(gè)信號(hào)路徑的調(diào)節(jié)，經(jīng)典的分泌型糖蛋白（Wnt）和骨形態(tài)發(fā)生蛋白（BMP）信號(hào)通路在調(diào)節(jié)成骨細(xì)胞功能及骨形成中發(fā)揮重要的協(xié)同作用[7-8]。研究表明，腫瘤壞死因子α（TNF-α）是觸發(fā)AS“炎癥因子風(fēng)暴”級(jí)聯(lián)瀑效應(yīng)的關(guān)鍵因子之一，其與AS韌帶骨化具有密切的聯(lián)系[9]。

丹皮酚（Paeonol）為蘿藦科植物徐長(zhǎng)卿的主要藥理成分，具有與非甾體類抗炎藥相似的藥理作用，包括解熱鎮(zhèn)痛、抗炎、抗氧化、調(diào)節(jié)細(xì)胞免疫、誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡以及抗輻射等，且不良反應(yīng)少，具有治療慢性炎癥風(fēng)濕性疾病的潛力[10-12]。目前，關(guān)于丹皮酚抑制多種腫瘤作用的研究報(bào)道較多，而關(guān)于其對(duì)AS病理性骨化相關(guān)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的影響尚未見報(bào)道。故本研究以蛋白聚糖（PG）誘導(dǎo)的AS小鼠為模型，通過觀察骶髂關(guān)節(jié)滑膜細(xì)胞超微病理結(jié)構(gòu)變化，檢測(cè)血清中炎癥相關(guān)細(xì)胞因子TNF-α和Wnt信號(hào)通路病理性骨化相關(guān)因子（DKK-1）的含量，研究丹皮酚對(duì)滑膜細(xì)胞BMP-2、Smad1及Cbfα1 mRNA表達(dá)的影響，探討其對(duì)Wnt和BMP/Smad病理性骨化相關(guān)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的調(diào)控作用，為丹皮酚臨床治療AS以及闡明其作用機(jī)制提供依據(jù)。

1 材料

1.1 儀器

HT-770型透射電鏡（日本日立高新技術(shù)公司）；C2500-R-230V微型高速離心機(jī)（美國(guó)Labnet公司）；ICV-450型電熱恒溫培養(yǎng)箱（日本Asone科學(xué)儀器公司）；Multiskan MK3型全自動(dòng)酶標(biāo)儀（美國(guó)Thermo公司）；DHG 9203A型實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR）儀（美國(guó)Iiiumina生物科技公司）；Nano-100型微量分光光度計(jì)（杭州奧盛儀器有限公司）。

1.2 藥品與試劑

丹皮酚片（廣西億康藥業(yè)股份有限公司，批號(hào)：H45021119，規(guī)格：40 mg/片）；柳氮磺吡啶腸溶片（上海信誼天平藥業(yè)有限公司，批號(hào)：H31020557，規(guī)格：0.25 g/片）；PG（美國(guó)Sigma公司，批號(hào)：D-8428，純度：＞99%）；完全弗氏佐劑（美國(guó)MP Bio公司，批號(hào)：642857，純度：＞99%）；小鼠TNF-α酶聯(lián)免疫吸附（ELISA）試劑盒（批號(hào)：E-EL-M0049c）、小鼠DKK-1 ELISA試劑盒（批號(hào)：E-EL-M0024c）均購自武漢伊萊瑞特生物科技有限公司；總RNA提取試劑盒（Trizol，北京艾德萊生物科技有限公司，批號(hào)：252250AX）；Hiscript逆轉(zhuǎn)錄酶（南京諾唯贊生物科技有限公司，批號(hào)：R101-01/02）；Taq Plus DNA Polymerase聚合酶、DL2000 DNA Marker（北京天根生化科技有限公司，批號(hào)：ET105-01、D114-02）；PCR引物由北京擎科生物技術(shù)公司合成；其余試劑均為分析純。

1.3 動(dòng)物

清潔級(jí)BALB/c小鼠40只，♂，鼠齡（16±4）周，體質(zhì)量（20±3）g，由武漢大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào)：SCXK（鄂）2008-0004。實(shí)驗(yàn)過程中對(duì)動(dòng)物的處置符合科學(xué)技術(shù)部頒發(fā)的《關(guān)于善待實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的指導(dǎo)性意見》的要求。

2 方法

2.1 分組與造模

將小鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后隨機(jī)分為正常組、模型組、柳氮磺吡啶組和丹皮酚組，每組10只。除正常組外，其余3組小鼠均復(fù)制AS模型，具體操作如下：將完全弗氏佐劑100 μL、PG 100 μL混合，分別在第0、3、6周注入小鼠腹腔[13]。

2.2 給藥與取材

參照臨床用藥劑量，丹皮酚的小鼠給藥劑量為3 mg/kg（臨用前用蒸餾水溶解后配成0.3 mg/mL的溶液），柳氮磺吡啶的小鼠給藥劑量為9 mg/kg（臨用前用蒸餾水溶解后配成0.9 mg/mL的溶液），正常組和模型組小鼠灌胃等體積蒸餾水。從造模成功后的第1天開始，各組小鼠分別灌胃相應(yīng)藥物，每日1次，連續(xù)用藥20 d。末次給藥后，摘除小鼠眼球，通過眼底靜脈叢采血800～1 000 μL，以離心半徑為6 cm、3 000 r/min離心10 min，留取血清，－20℃冰箱保存；并于小鼠骶髂關(guān)節(jié)切取滑膜組織置于凍存管中，－80℃冰箱保存。

2.3 血清中TNF-α、DKK-1含量測(cè)定

采用ELISA法測(cè)定小鼠血清中TNF-α、DKK-1含量，具體操作按照相應(yīng)試劑盒說明進(jìn)行，通過酶標(biāo)儀讀取吸光度（A）值，并計(jì)算其含量。

2.4 骶髂關(guān)節(jié)滑膜細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)觀察

取小鼠雙側(cè)骶髂關(guān)節(jié)面約2 mm厚的滑膜組織標(biāo)本，4%戊二醛0.1 mol/L酸緩沖液前固定，1%鋨酸后固定，梯度酒精逐級(jí)脫水，環(huán)氧樹脂包埋劑EPON812逐級(jí)浸泡、包埋，定位后行超薄切片，透射電鏡觀察滑膜細(xì)胞內(nèi)細(xì)胞器形態(tài)變化。

2.5 滑膜組織中BMP-2、Smad1和Cbfα1 mRNA表達(dá)測(cè)定

采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR法測(cè)定小鼠滑膜組織中BMP-2、Smad1和Cbfα1 mRNA表達(dá)。取100 mg滑膜組織，勻漿后，按照Trizol法提取總RNA。取溶解后的總RNA 2 μL，用微量分光光度計(jì)測(cè)定樣本的濃度和純度。取總RNA按照逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)體系逆轉(zhuǎn)錄成cDNA，反應(yīng)條件為25℃、5 min；50 ℃、15 min，85 ℃、5 min，4 ℃、10 min。將cDNA作10倍稀釋后進(jìn)行PCR擴(kuò)增，引物序列：β-肌動(dòng)蛋白（β-actin）上游序列為5′-CACGATGGAGGGGCCGGACTCATC-3′，下游序列為5′-TAAAGACCTCTATGCCAACACAGT-3′，擴(kuò)增產(chǎn)物長(zhǎng)度為 240 bp；BMP-2上游序列為5′-TGTGAGGATTAGCAGGTCTTTG-3′，下游序列為5′-TCTCGTTTGTGGAGCGGATG-3′，擴(kuò)增產(chǎn)物長(zhǎng)度為111 bp；Smad1上游序列為5′-GGCGACATATTGGGAAAGGA-3′，下 游 序 列 為 5′-TGAAAGCCGTGGTGGTAGTT-3′，擴(kuò)增產(chǎn)物長(zhǎng)度為121 bp；Cbfα1 上游序列為 5′-GGACGAGGCAAGAGTTTCA-3′，下 游 序 列 為 5′-TGGTGCAGAGTTCAGGGAG-3′，擴(kuò)增產(chǎn)物長(zhǎng)度為249 bp。擴(kuò)增條件：95℃、10 min ；95 ℃、15 s，60 ℃、1 min，72 ℃、40 s，共循環(huán)40次。反應(yīng)體系：cDNA（10倍稀釋）4 μL，上、下游引物（100 μmol/L）各0.4 μL，SYBR Green Master Mix預(yù)混液10 μL，50×ROX Reference Dye預(yù)混液0.2 μL，水5 μL。保存熒光定量PCR擴(kuò)增BMP-2、Cbfα1、Smad1、β-actin基因的擴(kuò)增曲線及解鏈曲線。以β-actin為內(nèi)參，采用2－ΔΔct法計(jì)算各目的基因的相對(duì)表達(dá)量。

2.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 17.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。數(shù)據(jù)以±s表示，多組間比較采用單因素方差分析，兩組間比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)。P＜0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 結(jié)果

3.1 血清中TNF-α、DKK-1含量測(cè)定結(jié)果

與正常組比較，模型組小鼠血清中TNF-α含量明顯增加（P＜0.01），DKK-1含量明顯減少（P＜0.01）。與模型組比較，柳氮磺吡啶組和丹皮酚組小鼠血清中TNF-α含量均明顯減少（P＜0.05或P＜0.01），丹皮酚組小鼠血清中DKK-1含量明顯增加（P＜0.05），結(jié)果見表1。

表1 各組小鼠血清中TNF-α、DKK-1含量測(cè)定結(jié)果（±s，n＝10，ng/mL）Tab 1 Serum contents of TNF-α and DKK-1 of mice in each group（±s，n＝10，ng/mL）

表1 各組小鼠血清中TNF-α、DKK-1含量測(cè)定結(jié)果（±s，n＝10，ng/mL）Tab 1 Serum contents of TNF-α and DKK-1 of mice in each group（±s，n＝10，ng/mL）

注：與正常組比較，＊＊P＜0.01；與模型組比較，#P＜0.05，##P＜0.01Note：vs.normal group，＊＊P＜0.01；vs.model group，#P＜0.05，##P＜0.01

組別正常組模型組柳氮磺吡啶組丹皮酚組DKK-1 2 650.744±53.761 1 487.615±64.902＊＊1 862.794±25.958 2 174.349±20.327#劑量，mg/kg 9 3 TNF-α 92.463±2.146 251.142±6.213＊＊192.286±4.694#137.352±6.541##

3.2 骶髂關(guān)節(jié)滑膜細(xì)胞超微病理結(jié)構(gòu)觀察結(jié)果

正常組：滑膜細(xì)胞疏松平行排列，滑膜層由細(xì)胞層和內(nèi)膜下層構(gòu)成，可見絨毛，內(nèi)含膠原性纖維；滑膜細(xì)胞有A、B兩型，均無異常；巨噬細(xì)胞樣A型細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)內(nèi)含豐富的線粒體、囊泡和溶酶體；成纖維細(xì)胞樣B型細(xì)胞含有高濃度的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)，少量線粒體和空泡。模型組：滑膜細(xì)胞排列紊亂，細(xì)胞內(nèi)膜明顯增厚，細(xì)胞質(zhì)內(nèi)細(xì)胞器變形，胞核內(nèi)染色質(zhì)分布不均。柳氮磺吡啶組：滑膜層細(xì)胞性內(nèi)膜增生，B型細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)內(nèi)線粒體腫脹，粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)擴(kuò)張，有大量空泡形成，胞核凹陷。丹皮酚組：滑膜細(xì)胞層輕度增厚，排列均勻，A型細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)內(nèi)線粒體輕度腫脹，初級(jí)溶酶體多見；B型細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)內(nèi)粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)豐富，胞核內(nèi)染色質(zhì)分布均勻。各組小鼠骶髂關(guān)節(jié)滑膜細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)觀察結(jié)果見圖1。

3.3 滑膜組織中BMP-2、Smad1和Cbfα1 mRNA表達(dá)測(cè)定結(jié)果

與正常組比較，模型組小鼠滑膜組織中BMP-2、Cbfα1、Smad1 mRNA表達(dá)水平均顯著升高（P＜0.01）。與模型組比較，丹皮酚組小鼠滑膜組織中BMP-2、Cbfα1和Smad1 mRNA表達(dá)水平均不同程度降低（P＜0.05），而柳氮磺吡啶組小鼠滑膜組織中BMP-2、Cbfα1、Smad1 mRNA表達(dá)水平差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），結(jié)果見表2。

圖1 各組小鼠骶髂關(guān)節(jié)滑膜細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)觀察的透射電鏡圖（×5 000）Fig 1 Transmission electron microscopy of ultramicrostructure of synovial cells of mice in each group（×5 000）

表2 各組小鼠滑膜細(xì)胞中BMP-2、Cbfα1和Smad1 mRNA表達(dá)測(cè)定結(jié)果（±s，n＝10）Tab 2 Determination of BMP-2，Cbfα1 and Smad1 mRNA in synovial cells of mice in each group（±s，n＝10）

表2 各組小鼠滑膜細(xì)胞中BMP-2、Cbfα1和Smad1 mRNA表達(dá)測(cè)定結(jié)果（±s，n＝10）Tab 2 Determination of BMP-2，Cbfα1 and Smad1 mRNA in synovial cells of mice in each group（±s，n＝10）

注：與正常組比較，＊＊P＜0.01；與模型組比較，#P＜0.05Note：vs.normal group，＊＊P＜0.01；vs.model group，#P＜0.05

組別正常組模型組柳氮磺胺吡啶組丹皮酚組2－ΔΔct值Smad1 mRNA 1 1.762±0.163＊＊1.597±0.214 1.224±0.115#BMP-2 mRNA 1 3.141±0.295＊＊2.596±0.331 1.628±0.207#Cbfα1 mRNA 1 2.342±0.283＊＊1.961±0.305 1.428±0.146#

4 討論

滑膜組織內(nèi)A、B型滑膜細(xì)胞是AS骨破壞和病理性骨化的效應(yīng)細(xì)胞。本研究結(jié)果顯示，模型組小鼠滑膜細(xì)胞增生，排列紊亂，細(xì)胞間隙增寬；丹皮酚組小鼠滑膜細(xì)胞細(xì)胞質(zhì)中線粒體、溶酶體、粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的形態(tài)明顯改善，表明丹皮酚可減輕滑膜細(xì)胞變性和損傷。

AS炎癥反應(yīng)與新骨形成都是由眾多細(xì)胞因子和信號(hào)通路組成的錯(cuò)綜復(fù)雜的調(diào)控機(jī)制網(wǎng)絡(luò)。在骨形成的早期階段主要由BMP信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路調(diào)控，在成骨晚期階段主要由Wnt信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路為成骨細(xì)胞的發(fā)生和新骨形成傳遞信號(hào)，是骨重塑的重要調(diào)控者[14]。其中DKK-1是Wnt/β-連環(huán)蛋白（β-catenin）信號(hào)通路最主要的抑制因子。研究證實(shí)，在AS患者中DKK-1出現(xiàn)功能失調(diào)而出現(xiàn)Wnt信號(hào)通路活化，導(dǎo)致新骨形成[15]。炎癥與新骨形成之間有一定關(guān)聯(lián)，而TNF-α是炎癥細(xì)胞因子網(wǎng)絡(luò)的關(guān)鍵因子[15]。BMP是多功能生長(zhǎng)因子，除BMP-1外均屬于轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β（TGF-β）超家族，BMP能通過Smad途徑上調(diào)成骨轉(zhuǎn)錄因子Osx的表達(dá)而介導(dǎo)成骨基因轉(zhuǎn)錄發(fā)揮作用[16]。因此，TNF-α、Wnt信號(hào)通路以及BMP信號(hào)通路之間平衡的變化決定著新骨的形成。傳統(tǒng)的一線抗風(fēng)濕藥物（如柳氮磺吡啶）在延緩AS進(jìn)行性結(jié)構(gòu)破壞的療效上并不確切。本研究通過ELISA檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，與模型組比較，丹皮酚在降低血清中TNF-α含量和增加血清中DKK-1含量方面優(yōu)于柳氮磺吡啶。這說明丹皮酚可以通過降低血清中TNF-α含量，增加血清中DKK-1含量，從而抑制Wnt信號(hào)通路傳導(dǎo)和延緩病理性骨形成。通過實(shí)時(shí)熒光定量PCR結(jié)果顯示，丹皮酚可明顯下調(diào)模型小鼠滑膜組織中BMP-2、Cbfα1和Smad1 mRNA表達(dá)，從而阻斷成骨細(xì)胞通路靶基因表達(dá)，這與電鏡顯示丹皮酚干預(yù)后滑膜細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)形態(tài)改善相符。

綜上所述，丹皮酚可通過協(xié)同抑制Wnt和BMP/Smad骨化相關(guān)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路逆轉(zhuǎn)滑膜細(xì)胞成骨分化，從而發(fā)揮其對(duì)AS的防治作用。下一步筆者將深入探討丹皮酚不同濃度和不同給藥時(shí)間對(duì)早期AS模型病理性骨化的影響。

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