王思威 劉艷萍 王瀟楠 徐能莉 孫海濱

摘要?[目的]建立甲基硫菌靈和多菌靈在荔枝果肉中的高效液相色譜（HPLC）檢測分析方法。[方法]樣品采用甲酸-乙腈作為提取溶劑、乙二胺N-丙基硅烷吸附劑（PSA）進行凈化，高效液相色譜檢測分析荔枝果肉基質(zhì)中的甲基硫菌靈和多菌靈殘留量。[結(jié)果]甲基硫菌靈和多菌靈在為0.01～1.00 mg/kg添加水平下的添加回收率分別為78.9%～97.6%、79.8%～94.6%，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差分別為2.08%～3.95%、3.04%～5.27%;最低檢出量均為0.1 ng，最小檢出濃度均為0.01 mg/kg。[結(jié)論]該前處理方法簡便、有機溶劑用量少，準(zhǔn)確度、精密度等均符合農(nóng)藥殘留檢測分析要求。

關(guān)鍵詞?甲基硫菌靈;多菌靈;荔枝果肉;高效液相色譜法;代謝物;殘留量

中圖分類號?TS207.5+3文獻標(biāo)識碼?A文章編號?0517-6611（2018）35-0174-03

甲基硫菌靈（thiophanatemethyl）是具有高效低毒的廣譜性內(nèi)吸殺菌劑，具有保護和治療作用，廣泛用于糧食、棉花、蔬菜、果樹等多種作物上的病害防治，甲基硫菌靈在作物和土壤中使用后易轉(zhuǎn)化為多菌靈[1-3]，我國規(guī)定甲基硫菌靈殘留定義為甲基硫菌靈和多菌靈之和，以多菌靈表示。多菌靈（carbendazim）屬于廣譜低毒苯并咪唑類殺菌劑，廣泛用于大田作物、蔬菜、果樹和經(jīng)濟作物的子囊菌亞門、擔(dān)子菌亞門和半知菌亞門的許多病害防治。GB 2763—2016（食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 食品中農(nóng)藥最大殘留限量）中甲基硫菌靈僅在蘋果、梨、葡萄和西瓜等4種水果上制定了最大殘留限量標(biāo)準(zhǔn)，暫無荔枝。因此，通過建立甲基硫菌靈和多菌靈在荔枝果肉中的分析方法，為其后續(xù)在作物上的殘留量測定提供方法指導(dǎo)。

目前，有關(guān)甲基硫菌靈和多菌靈的分析方法報道主要有采用HPLC和HPLC-MS方法測定其在番茄、柑橘、黃瓜、芝麻等作物上的殘留[4-15]，而荔枝果肉中的分析方法鮮見報道。筆者通過高效液相色譜技術(shù)建立了甲基硫菌靈和多菌靈在荔枝果肉中的殘留量分析方法，為監(jiān)測市場荔枝產(chǎn)品中2種環(huán)境污染物提供了分析方法參考。

1?材料與方法

1.1?儀器

島津LC-20A高效液相色譜儀（日本島津公司）;勻漿機（IKA-T18型，德國制造）;離心機（GTR-22-1型高速冷凍離心機，北京時代北利離心機有限公司）;氮吹儀（OA-SYS，美國Organomation公司）。

1.2?試劑

甲基硫菌靈和多菌靈標(biāo)準(zhǔn)品，純度分別為99.5%和98.6%，均購自美國Chem Service公司;甲醇、乙腈（色譜純）;甲酸（色譜純，美國Fluka公司）;無水MgSO4和NaCl（國藥集團化學(xué)試劑有限公司）;乙二胺N-丙基硅烷吸附劑（PSA）（上海安譜實驗科技股份有限公司）。

1.3?樣品前處理

1.3.1?樣品預(yù)處理。

1.3.1.1?荔枝樣本采集。隨機在試驗小區(qū)荔枝樹的不同方向及上、中、下、里、外等不同部位用剪刀采集不少于2 kg生長正常、無病害、未噴施過甲基硫菌靈和多菌靈的荔枝空白個體，裝入樣本袋中，貼好標(biāo)簽，盡快送往實驗室。

1.3.1.2?荔枝果肉樣品。所有器具沖洗后，取田間荔枝殘留樣本剝?nèi)ダ笾ζぃ〕龉夂凸?，果核棄去，將果肉切碎混勻，用四分法縮分，分取250 g 樣品2份，裝入樣品容器中，貼好標(biāo)簽，并貯存在-20 ℃低溫冰箱中待用。

1.3.2?添加樣品及檢測。

稱取20.0 g已制備好荔枝果肉樣品于100 mL離心管中，分別從1、10、100 mg/L甲基硫菌靈和多菌靈混合標(biāo)準(zhǔn)溶液中吸取0.2 mL添加到已稱好的果肉樣品中，靜置1 h，再加入40 mL 0.1%甲酸-乙腈提取，勻漿2 min，加入7 g NaCl，渦旋1 min，5 000 r/min離心5 min。取上層乙腈提取液20 mL（相當(dāng)于10 g樣品量）濃縮約50 μL，用乙腈定容至2 mL，待凈化。

將2 mL乙腈提取液轉(zhuǎn)移至加有150 mg無水MgSO4、50 mg PSA的離心管中，用手劇烈振蕩，渦旋10 s，10 000 r/min離心2 min。取上清液過0.22 μm有機濾膜，待HPLC測定。

1.4?色譜條件

島津LC-20A配二極管陣列紫外檢測器，色譜柱為Wondasil C18-WR（250 mm×4.6 mm×5 μm），流動相為水/甲醇/乙腈/0.1%甲酸水溶液（體積比36.4∶3.0∶60.0∶0.6），流速為0.5 mL/min，波長272 nm，進樣量為30 μL。

1.5?標(biāo)準(zhǔn)曲線制作

準(zhǔn)確稱取甲基硫菌靈和多菌靈標(biāo)準(zhǔn)品，用乙腈配成1 000 mg/L的標(biāo)準(zhǔn)溶液，采用系列稀釋法稀釋至所需的質(zhì)量濃度0.01、0.05、0.10、0.50、1.00、2.00、5.00 mg/L，以峰面積（y）對進樣量（x）做圖，建立甲基硫菌靈和多菌靈的標(biāo)準(zhǔn)曲線方程。

1.6?添加回收率測定

取荔枝果肉空白樣品20.0 g，添加水平為0.01～1.00 mg/kg，重復(fù)5次，按照上述提取凈化方法處理之后，用液相色譜儀器進行測定，計算添加回收率。

2?結(jié)果與分析

2.1?儀器條件優(yōu)化

2.1.1?流動相選擇。

比較了Wondasil C18-WR、Thermo batabasic-18和依利特Hypersil ODS2等3種反相色譜柱對甲基硫菌靈和多菌靈2種化合物峰型、保留時間、響應(yīng)強度等的影響。結(jié)果顯示，采用Thermo batabasic-18時，甲基硫菌靈色譜峰有分叉，不對稱，且不能回歸基線，多菌靈基線漂移;依利特Hypersil ODS2色譜柱，甲基硫菌靈峰型不對稱，基線漂移，多菌靈響應(yīng)值減弱;應(yīng)用Wondasil C18-WR色譜柱，2種目標(biāo)農(nóng)藥的峰型對稱，基線穩(wěn)定，響應(yīng)值高，能達到完全分離。

2.1.2?流速選擇。

采用Wondasil C18-WR色譜柱，分別設(shè)置流速為0.4和0.5 mL/min，比較甲基硫菌靈和多菌靈的保留時間、峰型等。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，當(dāng)流速為0.4 mL/min，甲基硫菌靈的峰型不對稱，靈敏度降低;流速為0.5 mL/min，峰型對稱，基線平穩(wěn)，分離度較好，響應(yīng)強度高。

2.2?提取劑選擇

分別比較了丙酮和乙腈2種常用有機溶劑對荔枝果肉基質(zhì)中甲基硫菌靈和多菌靈的提取效率，結(jié)果顯示，當(dāng)丙酮作為提取溶劑時，可將基質(zhì)中的糖類等雜質(zhì)與目標(biāo)農(nóng)藥一并提取，樣品黏稠，加大了凈化難度，并可導(dǎo)致色譜柱、檢測器的污染，此外，丙酮易溶于水，不易達到明顯分層效果，不利于后續(xù)凈化;乙腈中加入少量甲酸作為提取溶劑，可顯著提高甲基硫菌靈和多菌靈在基質(zhì)中的提取效率，且提取液較清澈，兩相界面分層效果明顯，適于作為荔枝果肉基質(zhì)的提取劑。

2.3?凈化條件優(yōu)化

無水MgSO4主要作用是用于除去樣品中的水分，確保目標(biāo)分析物易被有機溶劑完全提取;PSA作為弱陰離子交換填料，能夠有效去除基質(zhì)中糖類、脂肪酸等物質(zhì)。荔枝果肉中含有大量糖分、維生素、氨基酸等物質(zhì)，采用PSA能夠有效去除雜質(zhì)干擾，確保目標(biāo)分析物峰型對稱、無拖尾。

2.4?線性范圍

以甲基硫菌靈和多菌靈的濃度為橫坐標(biāo)，與其對應(yīng)的峰面積為縱坐標(biāo)，在濃度為0.01～2.00 mg/L范圍內(nèi)2種目標(biāo)農(nóng)藥的濃度與其響應(yīng)峰面積呈現(xiàn)良好的正相關(guān)性，線性方程分別為y=231 530x-681.99（r=1.000 0）、y=136 409x+2 419.6（r=0.999 9）。

2.5?準(zhǔn)確度、精密度和靈敏度

從表1可以看出，在添加質(zhì)量濃度為0.01～1.00 mg/kg時，荔枝果肉中甲基硫菌靈的添加回收率為78.9%～97.6%，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差為2.08%～3.95%;多菌靈添加回收率為79.8%～94.6%，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差為3.04%～5.27%。2種農(nóng)藥的準(zhǔn)確度、精密度和重現(xiàn)性均符合回收率在70%～120%、相對標(biāo)準(zhǔn)偏差低于20%的農(nóng)藥殘留分析要求。

在上述前處理分析方法和HPLC儀器條件下，甲基硫菌靈最低檢出量為0.1 ng，最小檢出濃度為0.01 mg/kg;多菌靈的最低檢出量為0.1 ng，最小檢出濃度為0.01 mg/kg。

3?結(jié)論

該研究采用QuEChERS方法結(jié)合高效液相色譜技術(shù)，建立了甲基硫菌靈和多菌靈2種農(nóng)藥在荔枝果肉基質(zhì)中殘留量的前處理方法和液相檢測分析條件，并討論儀器條件、提取溶劑等相關(guān)參數(shù)。結(jié)果表明，該方法操作簡便、快速、有機溶劑用量少，能夠滿足甲基硫菌靈和多菌靈在荔枝果肉基質(zhì)中的殘留檢測分析要求。

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