劉爽，劉桐，苑帥，司南，任大勇，畢云楓，陳萍

（吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，吉林長春 130118）

菌落總數(shù)是衡量食品衛(wèi)生質(zhì)量的重要指標(biāo)之一，為食品樣品的衛(wèi)生學(xué)評(píng)價(jià)提供科學(xué)依據(jù)[1]。微生物菌落計(jì)數(shù)測試片檢測法是一種新型檢測方法，它是以凝膠、無紡布和濾紙3種主流載體代替瓊脂作為培養(yǎng)基載體培養(yǎng)微生物的一種檢測新技術(shù)[2]。測試片作為在傳統(tǒng)瓊脂平板計(jì)數(shù)法基礎(chǔ)上，經(jīng)過簡化和改進(jìn)而形成的一種新型檢測方法，它以凝膠，無紡布，濾紙代替瓊脂作為培養(yǎng)基載體將冷水可溶性凝膠與無紡布復(fù)合使用稱為未來微生物測試片發(fā)展的趨勢(shì)[3]。

無紡布是以紡織纖維為原料經(jīng)過粘合、熔合和化學(xué)、機(jī)械方法加工而成的紡織品。這種紡織品不經(jīng)傳統(tǒng)的紡紗、機(jī)織或針織的工藝過程加工。分薄型和厚型兩大類，可用于制成透氣和加速擴(kuò)散等特殊用途的材料[4]。德國拜發(fā)公司的微生物菌落計(jì)數(shù)板選用的載體為硝酸纖維素型無紡布[5]?？琢珠_展了對(duì)無紡布為載體菌落總數(shù)測試片的研究，研究表明整個(gè)培養(yǎng)區(qū)菌落擴(kuò)散呈大片紅色，菌落顯色不清晰或連成片，有的需要借助壓板固定菌落生長區(qū)域等缺點(diǎn)[6]。陳春田等[9]將市售國產(chǎn)生產(chǎn)的快速檢測紙片與國標(biāo)需氧菌平板計(jì)數(shù)法比較，在規(guī)定時(shí)間內(nèi)有菌落生長，但菌落計(jì)數(shù)顯著低于傳統(tǒng)方法。為此，無紡布應(yīng)用于細(xì)菌培養(yǎng)基測試片需進(jìn)一步改善，研發(fā)適合用作微生物測試片的無紡布，具有良好的應(yīng)用價(jià)值。

本實(shí)驗(yàn)研究以無紡布為載體菌落總數(shù)測試片的研究，以5種常見需氧菌為實(shí)驗(yàn)菌株，對(duì)無紡布的種類，加工工藝，培養(yǎng)基凝膠配比及質(zhì)構(gòu)特性進(jìn)行研究，并調(diào)節(jié)冷水可溶性凝膠與培養(yǎng)基的配比，解決無紡布生長的暈圈和連成片的現(xiàn)象。

1 材料和方法

1.1 試驗(yàn)材料

TTC、營養(yǎng)瓊脂、酵母浸粉、蛋白胨等分別購自阿拉丁試劑（上海）有限公司；聚丙烯酸鈉、瓜爾膠、卡拉膠、結(jié)冷膠分別購于西亞生化試劑發(fā)展有限公司和拉丁試劑（上海）有限公司；無紡布購自佛山市嘉達(dá)無紡布有限公司；上述材料均滅菌后使用，原泰奇氣式粉碎機(jī)。

1.2 試驗(yàn)菌株

大腸埃希氏菌(Escherichia coli)CICC23657、金黃色葡萄球菌(Staphylococcus aureus subsp.aureus)CICC21600、銅綠假單胞菌(Enterococcus faecalis)CICC21636等從中國工業(yè)微生物菌種保藏管理中心購買、鼠傷寒沙門氏菌(Salmonella typhimurium)ATCC10376、蠟樣芽孢桿菌（Bacillus cereus）ATCC11778等標(biāo)準(zhǔn)菌株從美國典型培養(yǎng)物保藏中心購買。

1.3 菌懸液制備

菌懸液的制備：分別挑取大腸桿菌、沙門氏菌、蠟樣芽胞桿菌、金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌培養(yǎng)的單菌落接種于100 mL LB液體培養(yǎng)基中，放入恒溫培養(yǎng)箱中36±1 ℃培養(yǎng)。取25 mL菌液加入225 mL無菌生理鹽水混勻，制成1:10的稀釋液。取1:10的稀釋液1 mL加入到9 mL生理鹽水中，充分混勻，重復(fù)以上操作將菌液稀釋至10-7備用。

1.4 測試片制備

1.4.1 測試片制備

測試片上層膜為透明度高、無毒、無刺激性氣味、防水透氣的PET透明硅膠膜；中層支撐材料，為透明度高，硬度較好，帶有鏤空區(qū)域的聚丙烯（PP）透明塑料板[7]，厚度為 0.18 mm；底板為防水防滲透的白色銅版紙。

將上、中、下三種材質(zhì)剪裁成長度10.5 cm，寬度9 cm，采用無毒無味的聚丙烯酸樹脂壓敏膠進(jìn)行粘合，粘合寬度為5 mm；中層支撐材料PET透明膠片與底板構(gòu)成半徑為3.0 cm的培養(yǎng)區(qū)域。將培養(yǎng)基均勻的加入到中間鏤空區(qū)域。菌落總數(shù)測試片的培養(yǎng)基每1000 mL成分為胰蛋白胨20 g、酵母浸粉15 g、氯化鈉15 g、TTC 0.3 g。滅菌方法采用環(huán)氧乙烷滅菌法[8]。

1.4.2 凝膠配制

通過使用原泰奇氣式粉碎機(jī)粉碎成粉末，過 120目標(biāo)準(zhǔn)篩[9]，分別稱取粒徑為 0.125 mm凝膠劑瓜爾膠、聚丙烯酸鈉、卡拉膠、結(jié)冷膠按照6:2:1:1比例混合后加適量去離子水，將其置于25 ℃恒溫磁力攪拌水浴鍋中150 r/min，攪拌混勻，配制膠體溶液，4 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.5 無紡布測試片工藝優(yōu)化

1.5.1 無紡布種類

針刺無紡布，是利用刺針的穿刺作用，將蓬松的纖網(wǎng)加固成布；水刺無紡布，是將高壓微細(xì)水流噴射到一層或多層纖維網(wǎng)上，使纖維相互纏結(jié)在一起增強(qiáng)纖網(wǎng)牢固的工藝；濕法無紡布，是將置于水介質(zhì)中的纖維原料開松成單纖維，然后將不同纖維原料混合制成纖維懸浮漿輸送到成網(wǎng)機(jī)構(gòu)，纖維在濕態(tài)下成網(wǎng)再加固成布；縫編無紡布，是利用經(jīng)編線圈結(jié)構(gòu)對(duì)塑料薄片、塑料薄金屬箔、紗線層、纖網(wǎng)等材料進(jìn)行組合加固制成的無紡布；熱合無紡布，是指在纖網(wǎng)中加入粉狀或纖維狀熱熔粘合經(jīng)過加熱熔、冷卻最終加固材料成布；熔噴無紡布，是將聚合物喂入，然后熔融擠出直到纖維形成、冷卻、成網(wǎng)、加固成布；紡粘無紡布，是將聚合物在被擠出、拉伸而形成的連續(xù)長絲鋪設(shè)成纖網(wǎng)，再經(jīng)過自身粘合、熱粘合、化學(xué)粘合或機(jī)械加固使纖網(wǎng)變成無紡布；漿粕氣流成網(wǎng)無紡布，是采用氣流成網(wǎng)技術(shù)將木漿纖維板開松成單纖維狀態(tài)，然后用氣流方法使纖維凝集在成網(wǎng)簾上成布[10]。無紡布的種類，厚度培養(yǎng)基與凝膠配比進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，是改善無紡布型測試片缺點(diǎn)的重要影響因素，對(duì)于其他的指標(biāo)對(duì)無紡布型測試片的研究影響較小。

1.5.2 培養(yǎng)基加入方式

將培養(yǎng)基添加到測試片中采用兩種方式：（1）浸入培養(yǎng)基式[11]：將無紡布浸入滅菌后的液體培養(yǎng)基中，35 ℃烘干待用；（2）直接加入到無紡布：將配制好的培養(yǎng)基粉末0.3 g直接涂布于無紡布上，待用。

1.5.3 質(zhì)構(gòu)特性對(duì)培養(yǎng)基凝膠的影響

配制1.0%不同比例的凝膠與培養(yǎng)基混合溶液，復(fù)配比例分別為凝膠與培養(yǎng)基1:9、2:8、3:7、4:6、5:5。參考D Ren[12]的方法測定硬度、脆性、粘度、彈性、內(nèi)聚性、黏性、回彈性，將培養(yǎng)基與凝膠混合物裝入2 cm為半徑的鋁盒中，使用質(zhì)構(gòu)儀（BROOKFIELD LFRA-4500）測定，同時(shí)測定1.0%瓊脂作為對(duì)照。質(zhì)構(gòu)儀的參數(shù)設(shè)置如下：采用 P/0.5探頭，測試速度：5.0 mm/s，觸發(fā)力：5 g，壓縮比：50%。

1.5.4 無紡布厚度篩選

將直徑為6 cm的40 g/m2、50 g/m2、60 g/m2、70 g/m2、80 g/m2、100 g/m2、120 g/m2的無紡布加入測試片培養(yǎng)基中，加入適當(dāng)稀釋度的混合菌液 1 mL于37 ℃進(jìn)行培養(yǎng)和菌落計(jì)數(shù)，篩選出適合菌落生長的無紡布厚度。

1.6 無紡布測試片檢測性能評(píng)價(jià)

1.6.1 靈敏度檢測

將制備好的5種試驗(yàn)菌株的混合菌懸液，以生理鹽水進(jìn)行10倍梯度稀釋到10-2~10-6，使用測試片法和國標(biāo)平板計(jì)數(shù)瓊脂法進(jìn)行菌落計(jì)數(shù)，培養(yǎng)后計(jì)數(shù)紅色菌落。

試驗(yàn)重復(fù)三次，結(jié)果取平均值，以最低稀釋度的檢測結(jié)果作為最低檢測限，以最低檢測限作為測試片靈敏度的檢測標(biāo)準(zhǔn)。檢測結(jié)果大于最低檢測限的為陽性，檢測結(jié)果小于最低檢測限的為陰性，靈敏度=陽性/(陽性+陰性)[13,14]。

1.6.2 準(zhǔn)確度檢測

將制備好的5種試驗(yàn)菌株的混合菌懸液，以無菌生理鹽水稀釋至102CFU/mL，菌懸液接種于菌落總數(shù)測試片上.

以國標(biāo)平板計(jì)數(shù)瓊脂法作為對(duì)照，培養(yǎng)后進(jìn)行菌落計(jì)數(shù)，將試驗(yàn)結(jié)果轉(zhuǎn)換為log10的值，以垂直y軸作為菌落總數(shù)測試片法的檢測結(jié)果，水平x軸作為國標(biāo)平板計(jì)數(shù)瓊脂法的檢測結(jié)果，繪制曲線，根據(jù)相關(guān)系數(shù)判斷準(zhǔn)確度使用測試片法和國標(biāo)需氧菌平板計(jì)數(shù)法進(jìn)行菌落計(jì)數(shù)，建立菌落總數(shù)測試片法和國標(biāo)法檢測結(jié)果的標(biāo)準(zhǔn)曲線，以確定測試片的準(zhǔn)確度。

1.7 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)和分析

試驗(yàn)數(shù)據(jù)使用Origin 19.0和IBS SPSS 20.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，各組數(shù)據(jù)均采用單因素ANOVA方差分析，顯著水平被設(shè)定為p<0.05，各組試驗(yàn)重復(fù)三次，取平均值。結(jié)果用平均值±標(biāo)準(zhǔn)差(SD)表示。

2 結(jié)果與分析

2.1 無紡布種類篩選

對(duì)針刺無紡布、水刺無紡布、濕法無紡布、縫編無紡布、熱合無紡布、熔噴無紡布、紡粘無紡布、氣流成網(wǎng)無紡布8種60 g/m2無紡布進(jìn)行試驗(yàn)，通過培養(yǎng)后的混合菌的菌落總數(shù)和直徑大小進(jìn)行篩選得到如圖1。

圖1 8種無紡布與國標(biāo)菌落生長情況比較Fig.1 Comparison of growth of eight non-woven fabrics with national standard

實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明：紡粘無紡布生長的菌落不清楚且連成片；針刺無紡布，可以生長出單一的菌落，但是菌落生長的小且不適合計(jì)數(shù)；熱合無紡布生長的菌落較大且清晰，但是菌落會(huì)在多面生長，影響計(jì)數(shù)；氣流成網(wǎng)無紡布生長出來的菌落顏色較深，有較好的辨識(shí)度，但菌落有連成片的現(xiàn)象；縫編無紡布由于無紡布有一定的空隙，對(duì)菌落生長提供了氧氣，菌落呈現(xiàn)單一且清晰，但有一定的暈圈，計(jì)數(shù)較困難；濕法無紡布由于加樣，吸收菌液較比其他幾種差，所以生長菌落?。蝗蹏姛o紡布由于有一定的空隙，生長的菌落部分出現(xiàn)連成片的現(xiàn)象，因此均不適合作為測試片。水刺無紡布，菌落呈單一，顏色深，計(jì)數(shù)清晰，因此水刺無紡布是菌落總數(shù)測試片的良好載體。

2.2 制備無紡布型測試片工藝優(yōu)化

圖2 兩種加入方式菌落生長情況對(duì)比Fig.2 Comparison of colony growth of two ways

2.2.1 培養(yǎng)基加入方式浸入式和直接加入。將1 mL的菌液加到含有培養(yǎng)基的60 g/m2水刺無紡布測試片上，對(duì)比菌落數(shù)和直徑大小。通過菌落生長情況，菌落數(shù)，直徑大小的綜合對(duì)比，浸入式生長的菌落顏色較深，可以清晰的看到單一的菌落，菌落直徑較大，所以采用浸入式與國標(biāo)需氧菌平板計(jì)數(shù)相比，無明顯差異。

表1 兩種加入方式菌落數(shù)和直徑大小對(duì)比Table 1 Compared with two ways of colony count and colony diameter

2.2.2 冷水可溶性凝膠與培養(yǎng)基混合比例及質(zhì)構(gòu)特性

由于無紡布的擴(kuò)散速度過快，未能快速吸收樣液，加樣后蓋上上層膜容易使樣液溢出片外，所以在培養(yǎng)基中加入一定比例的冷水可溶性凝膠可以解決這一問題，不同比例的凝膠和培養(yǎng)基混合，當(dāng)比例為3:7時(shí)，樣液的擴(kuò)散度為1.9 s。

由表2顯示，當(dāng)冷水可溶性凝膠與培養(yǎng)基配比為3:7時(shí)，擴(kuò)散速度為1.9 s。通過測定硬度，脆性，粘著性，彈性，內(nèi)聚性，膠著性，回彈性與1.0%的瓊脂對(duì)比，無明顯差異(p>0.05)，在一定的凝膠質(zhì)構(gòu)特性的條件下，可達(dá)到適合菌落生長及培養(yǎng)的凝膠環(huán)境，所以當(dāng)凝膠與培養(yǎng)基的配比為3:7時(shí)，是以無紡布為載體的菌落測試片的最佳培養(yǎng)基配比。

2.2.3 無紡布厚度篩選

圖3 不同厚度無紡布菌落生長情況Fig.3 Different thickness of non-woven colony growth

選取 40 g/m2、50 g/m2、60 g/m2、80 g/m2、100 g/m2和120 g/m2的無紡布以浸入式進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，通過對(duì)比菌落生長情況。由于40 g/m2、50 g/m2的無紡布較薄，所吸收的培養(yǎng)基較少，菌落生長需要的營養(yǎng)物質(zhì)供應(yīng)不足，使得菌落生長較小；80 g/m2、100 g/m2、120 g/m2的無紡布過厚，且擴(kuò)散速度較慢，不能兩面數(shù)菌，部分菌落夾到無紡布中間，顏色過淺，易遺漏，影響計(jì)數(shù)。因此，60 g/m2生長的菌落清晰，呈單一菌落，計(jì)數(shù)方便。

2.3 無紡布測試片性能檢測

2.3.1 靈敏度檢測

采用菌落總數(shù)測試片和國標(biāo)瓊脂平板培養(yǎng)法作對(duì)比試驗(yàn)，檢測限為2 CFU/mL，以最低檢測限作為測試片靈敏度的檢測標(biāo)準(zhǔn)。兩種方法可以達(dá)到相同水平的檢測限。對(duì)30~300之間的菌落數(shù)進(jìn)行分析，t=0.095，p=0.5>0.05，表明測試片和國標(biāo)瓊脂培養(yǎng)法生長的菌落總數(shù)結(jié)果無差異顯著性，結(jié)果如表3。

2.3.2 準(zhǔn)確度檢測

圖4 兩種方法的線性相關(guān)曲線Fig.4 Linear correlation curve between two methods

采用菌落總數(shù)測試片和國標(biāo)瓊脂法進(jìn)行對(duì)比，各試驗(yàn)菌株菌落總數(shù)結(jié)果如表 4，對(duì)結(jié)果進(jìn)行樣本獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，t=-0.025，p=0.8>0.05，由圖4兩種檢測方法的線性相關(guān)曲線可知，R2達(dá)到 0.996，具有非常好的線性關(guān)系，表明兩種方法對(duì)5種菌的菌落計(jì)數(shù)無差異顯著性。線性曲線如圖4。

表3 測試片靈敏度測定Table 3 Sensitivity of petrifilm plate

表4 兩種方法檢測結(jié)果Table 4 Testing results by two methods

3 結(jié)論

3.1 本文利用無紡布型測試片對(duì)5種食品中常見食源性致病菌為實(shí)驗(yàn)菌株進(jìn)行檢測與分析，通過篩選不同類型的無紡布對(duì)菌落生長情況和直徑大小，選取水刺無紡布，菌落呈單一，顏色深，計(jì)數(shù)清晰，因此水刺無紡布是菌落總數(shù)測試片的良好載體。

3.2 在篩選無紡布類型的分析過程中發(fā)現(xiàn)，培養(yǎng)基的加入方式對(duì)菌落生長情況有明顯的的影響，其中浸入式，生長的菌落顏色較深，可以清晰的看到單一的菌落，菌落直徑較大。由于無紡布的擴(kuò)散速度過快，未能快速吸收樣液，加樣后蓋上上層膜容易使樣液溢出片外，凝膠與培養(yǎng)基的配比的質(zhì)構(gòu)可以改善無紡布型測試片的缺點(diǎn)，當(dāng)冷水可溶性凝膠與培養(yǎng)基配比為3:7時(shí)，擴(kuò)散速度為1.9 s，通過測定硬度，脆性，粘著性，彈性，內(nèi)聚性，膠著性，回彈性與1.0%的瓊脂對(duì)比，無明顯差異，所以當(dāng)凝膠與培養(yǎng)基比例為3:7是采用浸入式與國標(biāo)需氧菌平板計(jì)數(shù)相比，無明顯差異。

3.3 結(jié)合無紡布類型及加工工藝的分析，發(fā)現(xiàn)無紡布的厚度對(duì)菌落生長也有顯著性的影響，但厚度的不同與菌落生長結(jié)果不同，分析原因?yàn)闊o紡布較薄，所吸收的培養(yǎng)基較少，菌落生長需要的營養(yǎng)物質(zhì)供應(yīng)不足，使得菌落生長較小，無紡布過厚，且擴(kuò)散速度較慢，不能兩面數(shù)菌，部分菌落夾到無紡布中間，顏色過淺，易遺漏，影響計(jì)數(shù)。因此，60 g/m2的無紡布生長的菌落清晰，呈單一菌落，計(jì)數(shù)方便。

3.4 無紡布型菌落總數(shù)測試片的檢出限為 2 CFU/mL，對(duì)結(jié)果進(jìn)行樣本獨(dú)立樣本 t檢驗(yàn)，t=-0.025，p=0.8>0.05，兩種檢測方法的線性相關(guān)曲線可知，R2達(dá)到 0.996，測試片和國標(biāo)瓊脂培養(yǎng)法生長的菌落總數(shù)結(jié)果無差異顯著性。

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