祝瑩，羅遠(yuǎn)平，白娟，張易，肖香，董英

（江蘇大學(xué)食品與生物工程學(xué)院，江蘇鎮(zhèn)江 212013）

隨著人類生活方式的改變，以肥胖為核心的代謝綜合征已成為影響人類健康最主要的非傳染性慢性疾病之一。而肥胖可誘導(dǎo)機(jī)體胰島素抵抗（Insulin resistance，IR）的發(fā)生，繼而產(chǎn)生葡萄糖耐受不良、血脂紊亂等癥狀[1]。胰島素抵抗是指組織（肝臟、骨骼肌和脂肪等）對(duì)胰島素敏感性下降，機(jī)體代償性的分泌過(guò)多胰島素產(chǎn)生高胰島素血癥，以維持血糖的穩(wěn)定。因此，長(zhǎng)期胰島素抵抗引起的糖脂代謝紊亂最終會(huì)導(dǎo)致2型糖尿病、非酒精性脂肪肝等疾病的發(fā)生[2]。

肝臟是胰島素作用的靶組織，是胰島素抵抗產(chǎn)生的主要部位。HepG2細(xì)胞是一種表型與肝細(xì)胞極為相似的肝胚胎瘤細(xì)胞株，經(jīng)誘導(dǎo)劑的刺激可使表面胰島素受體數(shù)目下降，從而使細(xì)胞呈現(xiàn)胰島素抵抗?fàn)顟B(tài)[3]。已有研究表明胰島素抵抗與過(guò)量攝入高脂飲食密切相關(guān)。血液中過(guò)量的游離脂肪酸會(huì)對(duì)肝臟產(chǎn)生脂毒性，削弱胰島素受體的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)，從而降低胰島素敏感性[4]。棕櫚酸是飲食和血清中最常見(jiàn)的飽和脂肪酸，因此，通過(guò)棕櫚酸誘導(dǎo)建立 HepG2胰島素抵抗細(xì)胞模型，是體外研究功能活性成分改善胰島素抵抗作用途徑的良好試驗(yàn)?zāi)Ｐ蚚5]。

苦瓜（Momordica charantia L.）富含多糖、皂苷、多酚和多肽等多種活性成分，長(zhǎng)期以來(lái)被用于預(yù)防和改善肥胖、糖尿病，本課題組前期通過(guò)動(dòng)物試驗(yàn)證實(shí)苦瓜具有改善胰島素抵抗、調(diào)節(jié)糖脂代謝的作用[6,7]。目前研究發(fā)現(xiàn)苦瓜中活性成分調(diào)脂降糖途徑主要有通過(guò)修復(fù)胰島β細(xì)胞來(lái)調(diào)節(jié)胰島素釋放；或是通過(guò)改善葡萄糖代謝促進(jìn)葡萄糖轉(zhuǎn)化，刺激糖原的貯存；或是發(fā)揮胰島素類似物的作用，促進(jìn)外周組織的葡萄糖攝取[8]，但仍存爭(zhēng)議?？喙献鳛樘烊皇称罚鋸?fù)雜的成分必然導(dǎo)致其作用的多樣性，對(duì)于其不同組分對(duì)胰島素抵抗作用的異同點(diǎn)還有待進(jìn)一步研究。

本文通過(guò)棕櫚酸誘導(dǎo)建立了 HepG2胰島素抵抗（HepG2-IR）細(xì)胞模型，從糖脂代謝途徑研究苦瓜水提物和醇提物對(duì)胰島素抵抗調(diào)節(jié)作用的異同點(diǎn)，為揭示苦瓜改善胰島素抵抗的機(jī)制提供試驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料與儀器設(shè)備

1.1.1 試驗(yàn)材料與試劑

HepG2細(xì)胞購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院上海生命科學(xué)院生物化學(xué)與細(xì)胞生物研究所；苦瓜購(gòu)自揚(yáng)中綠健苦瓜種植基地。

DMEM（Dulbecco's Modified Eagle Medium）高糖培養(yǎng)液、胎牛血清，美國(guó)Gibco公司；葡萄糖測(cè)定試劑盒、糖原測(cè)定試劑盒、甘油三酯（TG）測(cè)定試劑盒、BCA（Bicinchoninic Acid）法蛋白濃度測(cè)定試劑盒、ATP測(cè)定試劑盒，南京建成生物工程研究所；四甲基偶氮唑鹽（MTT）、棕櫚酸、牛血清白蛋白、二甲雙胍，美國(guó)Sigma公司；熒光定量PCR引物，上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司；熒光定量PCR相關(guān)試劑，Takara公司；其他生化試劑均為分析純，購(gòu)自國(guó)藥集團(tuán)上海化學(xué)試劑有限公司。

1.1.2 儀器與設(shè)備

UV-9600紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)，北京瑞麗分析儀器公司；CO2恒溫培養(yǎng)箱，芬蘭Thermo公司；Leica DM2500倒置熒光顯微鏡，德國(guó)萊卡有限公司；熒光定量PCR，美國(guó)Bio-Rad公司；B040234全自動(dòng)酶標(biāo)儀，美國(guó)Thermo公司；96孔板、25 cm2培養(yǎng)瓶，美國(guó)Corning公司。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 苦瓜水提物和醇提物的制備

鮮苦瓜去籽切片凍干后，在江蘇大學(xué)食品與生物工程學(xué)院中心實(shí)驗(yàn)室制備苦瓜粉。稱取100 g苦瓜粉，加入1000 mL水室溫浸提12 h，過(guò)濾后上清液凍干即為苦瓜水提物（BMWE）。稱取 100 g苦瓜粉，加入500 mL石油醚回流脫脂，過(guò)濾后將殘?jiān)?0 ℃烘干，加入1000 mL的乙醇，室溫?cái)嚢?2 h后離心，上清液旋蒸揮掉乙醇后凍干得到苦瓜醇提物（BMEE）。

1.2.2 苦瓜水提物和醇提物的成分測(cè)定

苦瓜提取物中多糖含量的測(cè)定采用苯酚-硫酸法；苦瓜提取物中皂苷含量的測(cè)定采用徐斌等[9]采用的方法；苦瓜提取物中多酚含量的測(cè)定采用FoLin-CiocaLteu法；苦瓜提取物中蛋白含量的測(cè)定采用考馬斯亮藍(lán)法。

1.2.3 細(xì)胞培養(yǎng)

HepG2細(xì)胞用含10%胎牛血清、100 U/mL青霉素和100 U/mL鏈霉素的DMEM高糖培養(yǎng)液于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)。

1.2.4 胰島素抵抗HepG2細(xì)胞模型的建立

將HepG2細(xì)胞接種于96板中，37 ℃培養(yǎng)24 h后，棄去上清液，換成不含血清的DMEM 高糖培養(yǎng)液饑餓12 h，棄去上清液，用PBS洗2次，再加入含有棕櫚酸的無(wú)血清培養(yǎng)液（棕櫚酸終濃度為0.25 mM）[10]誘導(dǎo)12 h后，即為HepG2-IR細(xì)胞模型。

1.2.5 細(xì)胞存活率的測(cè)定

以2×104個(gè)/mL的接種密度將HepG2細(xì)胞接種于96孔板，分為正常組、陰性組和苦瓜提取物組，每組6個(gè)平行。細(xì)胞饑餓12 h后，正常組加入無(wú)血清DMEM培養(yǎng)液，陰性組和苦瓜提取物組采用1.2.4的方法建立胰島素抵抗HepG2細(xì)胞模型，其中苦瓜提取物組的棕櫚酸誘導(dǎo)液同時(shí)分別加入50、100、250、500、750、1000、2000 μg/mL的BMWE和BMEE（濃度為培養(yǎng)液中的終濃度），12 h后，棄去上清，用PBS洗2次，加入無(wú)酚紅培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)12 h。最后每孔加入20 μL MTT（終濃度為0.5 mg/mL）培養(yǎng)4 h，棄去上清液，每孔加200 μL DMSO溶解結(jié)晶顆粒（另設(shè)6個(gè)空白孔），于570 nm波長(zhǎng)處測(cè)定OD值。細(xì)胞存活率(%)=(試驗(yàn)組 OD 值-空白 OD 值)/(正常組 OD 值-空白 OD值)×100%。

1.2.6 葡萄糖消耗量的測(cè)定

HepG2細(xì)胞接種于96孔板，試驗(yàn)分為空白組（不含細(xì)胞）、正常組、陰性組、苦瓜提取物組和二甲雙胍組（Met），除空白組、正常組外，其他各組按照1.2.4的方法建立HepG2-IR細(xì)胞模型。二甲雙胍組和苦瓜提取物組在模型建立期間分別加入含有2 mM二甲雙胍（前期試驗(yàn)已經(jīng)證明其對(duì)細(xì)胞存活率無(wú)影響）和不同濃度的苦瓜提取物（選取1.2.5試驗(yàn)篩選出的濃度）的培養(yǎng)液，作用12 h后繼續(xù)采用無(wú)酚紅培養(yǎng)液培養(yǎng)12 h。采用葡萄糖測(cè)定試劑盒檢測(cè)培養(yǎng)液中的葡萄糖含量，同時(shí)采用 MTT法測(cè)定細(xì)胞存活率，葡萄糖消耗量相對(duì)含量(%)=[(空白組葡萄糖含量-試驗(yàn)組葡萄糖含量)/試驗(yàn)組MTT值]/[(空白組葡萄糖含量-正常組葡萄糖含量)/正常組MTT值]×100%。

1.2.7 胞內(nèi)糖原、甘油三酯及ATP含量的測(cè)定

取HepG2細(xì)胞以2.5×105個(gè)/孔接種于6孔板，試驗(yàn)分為正常組、陰性組和苦瓜提取物組（選取 1.2.6試驗(yàn)篩選出的濃度），在模型建立過(guò)程中加藥物培養(yǎng)12 h。

糖原和蛋白含量采用試劑盒測(cè)定。糖原相對(duì)含量(%)=(試驗(yàn)組糖原含量/試驗(yàn)組蛋白濃度)/(正常組糖原含量/正常組蛋白濃度)×100%。

甘油三酯（TG）和蛋白濃度采用試劑盒測(cè)定。TG相對(duì)含量(%)=(試驗(yàn)組 TG 含量/試驗(yàn)組蛋白濃度)/(正常組TG含量/正常組蛋白濃度)×100%。

ATP和蛋白含量采用試劑盒測(cè)定。ATP相對(duì)含量(%)=(試驗(yàn)組ATP含量/試驗(yàn)組蛋白濃度)/(正常組ATP含量/正常組蛋白濃度)×100%。

1.2.8 胰島素抵抗信號(hào)通路相關(guān)基因轉(zhuǎn)錄水平的測(cè)定

HepG2細(xì)胞接種于6孔板，試驗(yàn)分為正常組、陰性組、BMWE500組（選取上述試驗(yàn)篩選出的最佳濃度500 μg/mL）和BMEE250組（選取上述試驗(yàn)篩選出的最佳濃度250 μg/mL）。

采用RNA提取試劑盒提取總RNA，反轉(zhuǎn)錄試劑盒制備cDNA，用Real-time PCR法檢測(cè)IRS1（胰島素受體1）、PI3K（磷脂酰肌醇-3-激酶）、AKT（蛋白激酶B）、AMPK（腺苷酸活化蛋白激酶）、ACC2（乙酰輔酶A羥化酶2）、CPT1（肉毒堿棕櫚酰轉(zhuǎn)移酶1）的基因表達(dá)水平，并選取GAPDH（甘油醛-3-磷酸脫氫酶）為內(nèi)參基因，采用Primer Express 3.0軟件設(shè)計(jì)引物，并由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成。引物序列如表1所示。擴(kuò)增條件為：95 ℃預(yù)變性5 min，95 ℃變性 30 s、60 ℃退火 30 s、72 ℃延伸 1 min，共進(jìn)行35個(gè)循環(huán)，72 ℃延伸10 min。擴(kuò)增反應(yīng)完成后測(cè)定吸光值，采用2-ΔΔCt方法計(jì)算mRNA相對(duì)表達(dá)量。

表1 引物列表Table 1 Primer sequence

1.2.9 統(tǒng)計(jì)處理

各組數(shù)據(jù)以±SD 表示，采用 SPSS 18.0中ANOVA模塊對(duì)試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行方差分析。

2 結(jié)果與討論

2.1 BMEE和BMWE中成分分析

由表2可以看出，BMEE和BMWE中主要活性成分多糖和皂苷的含量具有較大差異。BMWE中多糖含量顯著高于BMEE（p＜0.05），說(shuō)明苦瓜中多糖主要為水溶性；而BMEE中皂苷的含量顯著高于BMWE（19.24% vs. 4.84%），這是由于皂苷屬于醇溶性物質(zhì)，因此BMEE中皂苷顯著高于BMWE。

表2 BMWE和BMEE中多糖、皂苷、多酚和蛋白質(zhì)含量Table 2 The content of polysaccharide, sapnins, phenolics and protein in BMWE and BMEE

此外，BMEE和BMWE的多酚含量分別為3.34%和 2.56%，無(wú)顯著差異；蛋白含量分別為 0.85%和1.77%，具有顯著差異，說(shuō)明蛋白水溶性比醇溶性多。

2.2 BMWE和BMEE對(duì)HepG2-IR細(xì)胞活性的影響

圖1 不同濃度BMWE和BMEE對(duì)HepG2細(xì)胞存活率的影響Fig.1 Effects of different concentrations of BMWE and BMEE on the survival rate of HepG2 cells

圖1顯示了不同濃度BMWE和BMEE作用12 h對(duì)HepG2細(xì)胞存活率的影響。

從圖1a可以看出，采用BMWE作用HepG2細(xì)胞12 h，50～2000 μg/mL BMWE對(duì)細(xì)胞活力皆無(wú)顯著影響，試驗(yàn)組細(xì)胞與正常組細(xì)胞存活率相當(dāng)（p＞0.05）。因此，確定50～2000 μg/mL為試驗(yàn)中BMWE濃度。從圖1b可以看出，當(dāng)BMEE的濃度由50增加至250 μg/mL時(shí)，對(duì)細(xì)胞活力無(wú)顯著影響（p＞0.05），而當(dāng)作用濃度為500、750、1000、2000 μg/mL時(shí)，細(xì)胞存活率隨著濃度的增加顯著減小，分別為84.67%、71.69%、65.12%和 55.00%，與正常組（100%）具有顯著差異（p＜0.05），表明BMEE濃度大于500 μg/mL時(shí)會(huì)對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)產(chǎn)生明顯的抑制作用。因此，BMEE的濃度范圍確定為 50～250 μg/mL。

2.3 BMWE和BMEE對(duì)HepG2-IR細(xì)胞葡萄糖消耗量的影響

圖2 不同濃度BMWE和BMEE對(duì)HepG2細(xì)胞葡萄糖消耗量的影響Fig.2 Effects of different concentrations of BMWE and BMEE on the glucose consumption of HepG2 cells

不同濃度BMWE和BMEE對(duì)HepG2細(xì)胞葡萄糖消耗量的影響如圖2所示。從圖2a和圖2b中均可以看出，經(jīng)棕櫚酸誘導(dǎo)后，陰性組細(xì)胞葡萄糖消耗量顯著低于正常組（78.58%、78.51% vs. 100.00%）（p＜0.05），說(shuō)明 HepG2-IR細(xì)胞模型建模成功。從圖2a還可發(fā)現(xiàn)，50、100、2000 μg/mL BMWE組細(xì)胞的葡萄糖消耗量與陰性組無(wú)顯著性差異（p＞0.05），而250、500、750、1000 μg/mL BMWE能顯著增加HepG2胰島素抵抗細(xì)胞的葡萄糖消耗量（分別為84.65%、94.90%、89.59%和90.01%）（p＜0.05），其中 500 μg/mL BMWE效果最優(yōu)。如圖 2b所示，BMEE作用濃度為100和250 μg/mL時(shí)均能顯著增加HepG2胰島素抵抗細(xì)胞葡萄糖消耗量（分別為86.99%和91.38%）（p＜0.05），且BMEE濃度越高其細(xì)胞的葡萄糖消耗量越高，呈現(xiàn)一定的量效關(guān)系。二甲雙胍也可增加IR細(xì)胞的葡萄糖消耗量（分別為96.03%和96.13%），主要是由于二甲雙胍可促進(jìn)細(xì)胞的葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)。

BMWE和BMEE均對(duì)IR細(xì)胞葡萄糖消耗量有一定的作用效果，但作用濃度有一定的差異，這可能是由于BMWE和BMEE中含有的活性成分的種類與數(shù)量均不同導(dǎo)致的。Roffey等[11]發(fā)現(xiàn)苦瓜水提物能增加3T3-L1脂肪細(xì)胞的葡萄糖消耗量，這可能與細(xì)胞中脂聯(lián)素的分泌量增加有關(guān)。BMEE中皂苷含量較高，而前人的研究表明[12]苦瓜皂苷能刺激 GLUT4（葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白 4）轉(zhuǎn)移到細(xì)胞膜上，從而促進(jìn)葡萄糖進(jìn)入細(xì)胞。因此BMWE和BMEE均能有效改善HepG2模型細(xì)胞的胰島素抵抗，增加葡萄糖消耗量。

2.4 BMWE和BMEE對(duì)HepG2-IR細(xì)胞糖原含量的影響

圖3 BMWE和BMEE對(duì)胰島素抵抗HepG2細(xì)胞糖原和TG含量的影響Fig.3 Effects of BMWE and BMEE on the glycogen and TG content of HepG2-IR cells

肝臟是機(jī)體調(diào)節(jié)血糖的主要部位，肝臟可通過(guò)糖異生和肝糖原的合成與分解來(lái)調(diào)節(jié)血糖濃度。如圖3a所示，經(jīng)棕櫚酸誘導(dǎo)12 h后，與正常組相比，HepG2-IR細(xì)胞中糖原的含量顯著降低（70.47% vs. 100.00%）（p＜0.05），說(shuō)明肝細(xì)胞的糖代謝發(fā)生紊亂；而 500 μg/mL的BMWE和250 μg/mL的BMEE可顯著增加IR細(xì)胞的糖原含量（88.15%、86.09%），與陰性組具有顯著差異（p＜0.05）。說(shuō)明BMWE和BMEE均可以通過(guò)抑制糖異生、促進(jìn)肝糖原的合成來(lái)調(diào)節(jié)HepG2-IR細(xì)胞的糖代謝。

2.5 BMWE和BMEE對(duì)HepG2-IR細(xì)胞甘油三酯含量的影響

糖脂代謝紊亂會(huì)導(dǎo)致輸送至肝細(xì)胞的游離脂肪酸量增加，并在胞內(nèi)積累生成甘油三酯，使肝細(xì)胞出現(xiàn)小泡性脂變，進(jìn)一步降低肝細(xì)胞對(duì)胰島素的敏感性。由圖3b數(shù)據(jù)可知，經(jīng)棕櫚酸誘導(dǎo)后，肝細(xì)胞內(nèi)TG過(guò)度積累，與正常組相比，HepG2-IR細(xì)胞中TG含量可達(dá)132.97%；而BMWE和BMEE均能降低HepG2-IR細(xì)胞中TG含量，但僅BMEE250組與陰性組具有顯著差異（112.08% vs. 132.97%）（p＜0.05），說(shuō)明BMEE對(duì)IR細(xì)胞TG含量的影響優(yōu)于BMWE?？喙洗继嵛镏兄饕械幕钚猿煞钟腥圃碥疹?，Popovich等研究發(fā)現(xiàn)苦瓜三萜皂苷可顯著減少前脂肪細(xì)胞分化為脂肪細(xì)胞過(guò)程中的脂質(zhì)積累，同時(shí)降低胞內(nèi)甘油三酯含量，因此BMEE能顯著降低HepG2-IR細(xì)胞的TG含量[13]。

2.6 BMWE和BMEE對(duì)HepG2-IR細(xì)胞ATP含量的影響

圖4 BMWE和BMEE對(duì)胰島素抵抗HepG2細(xì)胞ATP含量的影響Fig.4 Effects of BMWE and BMEE on the ATP content of HepG2-IR cells

ATP是一種高能磷酸化合物，在細(xì)胞中，它與ADP的相互轉(zhuǎn)化實(shí)現(xiàn)貯能和放能，從而保證細(xì)胞各項(xiàng)生命活動(dòng)的能量供應(yīng)。ATP含量反映了細(xì)胞能量代謝水平，棕櫚酸會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞線粒體呼吸鏈的解偶聯(lián)，降低細(xì)胞內(nèi)ATP含量，使氧化磷酸化進(jìn)入空轉(zhuǎn)狀態(tài)，造成肝細(xì)胞能量代謝紊亂[14]。圖4顯示的是BMWE和BMEE對(duì)胰島素抵抗HepG2細(xì)胞ATP含量的影響。經(jīng)棕櫚酸誘導(dǎo)后，與正常組相比，陰性組細(xì)胞中ATP含量顯著降低（48.44% vs. 100.00%）（p＜0.05）；100和250 μg/mL的BMEE可顯著增加細(xì)胞中ATP含量（分別為66.46%和80.62%），與陰性組具有顯著差異（p＜0.05），而BMWE500和BMWE750未能顯著增加 IR 細(xì)胞內(nèi) ATP含量（p＞0.05）。BMEE能提高IR-HepG2細(xì)胞中ATP水平可能是由于BMEE能抑制線粒體呼吸鏈的解偶聯(lián)，從而促進(jìn)ATP的正常產(chǎn)生，具體機(jī)制還需進(jìn)一步研究。而BMWE對(duì)HepG2-IR細(xì)胞中ATP水平無(wú)顯著作用，說(shuō)明BMEE和BMWE對(duì)IR細(xì)胞ATP含量的作用具有顯著差異。

2.7 BMWE和BMEE對(duì)HepG2-IR細(xì)胞IRS1、PI3K、AKT、AMPK、ACC2和CPT1 mRNA表達(dá)水平的影響

圖5 BMEE對(duì)胰島素抵抗HepG2細(xì)胞IRS1、PI3K、AKT、AMPK、ACC2、CPT1 mRNA表達(dá)水平的影響Fig.5 Effects of BMEE on the IRS1, PI3K, AKT, AMPK, ACC2 and CPT1 mRNA levels of HepG2-IR cells

IRS1-PI3K-AKT信號(hào)通路的阻斷是胰島素抵抗的重要特征[15]。胰島素經(jīng)β細(xì)胞分泌后作用于細(xì)胞表面的胰島素受體，胰島素受體激活后磷酸化 IRS1，進(jìn)而激活PI3K，PI3K可活化AKT，活化的AKT可通過(guò)促進(jìn)葡萄糖的代謝。由圖5數(shù)據(jù)可知，與正常組相比，陰性組細(xì)胞中IRS1 mRNA表達(dá)水平顯著降低（0.87 vs. 1.0）（p＜0.05），而經(jīng)BMWE和BMEE作用模型細(xì)胞12 h后，BMEE可將HepG2-IR細(xì)胞的IRS1 mRNA表達(dá)水平上調(diào)到與正常組無(wú)顯著性差異（p＞0.05），而BMWE則更能顯著提高IRS1 mRNA表達(dá)水平（1.25 vs. 0.87）。陰性組細(xì)胞中PI3K mRNA表達(dá)水平顯著低于正常組（0.81 vs. 1.0）（p＜0.05），而BMWE500、BMEE250組細(xì)胞中PI3K mRNA表達(dá)水平均顯著增加（分別為1.31和1.15），且BMWE500組的效果更優(yōu)。陰性組細(xì)胞的AKT mRNA表達(dá)水平顯著低于正常組（0.83 vs. 1.0），BMWE能顯著增加細(xì)胞中 AKT mRNA表達(dá)水平（1.27 vs. 0.83）（p＜0.05），而BMEE雖也能增加AKT mRNA的表達(dá)水平（0.87），但與陰性組無(wú)顯著差異（p＞0.05）。因此，BMWE可通過(guò)調(diào)節(jié)IRS1-PI3K-AKT通路增加葡萄糖消耗量和糖原含量，抑制糖異生；BMEE也能部分調(diào)節(jié) IRS1-PI3K-AKT通路的表達(dá)水平，但其效果弱于BMWE。

AMPK-ACC2-CPT1通路是葡萄糖攝取和脂肪酸氧化的關(guān)鍵途徑。AMPK是影響脂肪酸代謝平衡的重要靶點(diǎn)，可減少糖異生、促進(jìn)葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)及脂肪酸脂解和氧化；ACC2是丙二酰輔酶A合成的限速酶，而丙二酰輔酶A可促進(jìn)脂肪酸合成[16]；CPT1為線粒體脂肪酸β氧化的主要酶，ACC2能抑制CPT1的表達(dá)。AMPK能夠磷酸化ACC2使其失活，進(jìn)而促進(jìn)了CPT1調(diào)節(jié)的脂肪酸β氧化，并減少脂質(zhì)在外周組織的沉積[17]。BMWE和 BMEE對(duì) HepG2-IR細(xì)胞AMPK、ACC2、CPT1 mRNA表達(dá)水平的影響如圖5所示。陰性組細(xì)胞的AMPK mRNA表達(dá)水平顯著低于正常組（0.87 vs. 1.0）（p＜0.05），BMWE和BMEE均能顯著增加AMPK mRNA表達(dá)量（分別為1.10和1.48），且BMEE效果更好。與正常組相比，陰性組ACC2 mRNA表達(dá)水平顯著增加（1.86 vs. 1.0）（p＜0.05），BMWE和 BMEE能顯著降低 ACC2 mRNA表達(dá)水平（分別為1.20和0.99）。陰性組細(xì)胞CPT1 mRNA表達(dá)水平顯著低于正常組（0.68 vs. 1.0）（p＜0.05），BMWE500和 BMEE250均能顯著增加CPT1 mRNA表達(dá)水平（分別為0.82和1.40）。結(jié)果表明，BMWE和BMEE均能調(diào)節(jié)AMPK-ACC2-CPT1通路，從而增加線粒體中脂肪酸氧化，減少脂質(zhì)積累，改善 IR細(xì)胞的糖脂代謝，且 BMEE的效果更優(yōu)。

3 結(jié)論

苦瓜水提物和醇提物均能顯著增加HepG2-IR細(xì)胞的葡萄糖消耗量及糖原含量，并提高IRS1、PI3K、AMPK和 CPT1 mRNA的表達(dá)水平，降低 ACC2 mRNA的表達(dá)水平；同時(shí)苦瓜水提物可增加胞內(nèi)AKT mRNA的表達(dá)水平，苦瓜醇提物能降低HepG2-IR細(xì)胞TG含量，增加ATP水平。因此BMWE主要通過(guò)激活胰島素抵抗細(xì)胞的 IRS1-PI3K-AKT信號(hào)通路促進(jìn)細(xì)胞攝取葡萄糖及抑制糖異生，從而改善細(xì)胞胰島素抵抗?fàn)顟B(tài)；而 BMEE則主要通過(guò)調(diào)節(jié)AMPK-ACC2-CPT1信號(hào)通路促進(jìn)線粒體的脂肪酸氧化、減少TG積累，改善胰島素抵抗細(xì)胞的糖脂代謝，二者的作用途徑有所不同。

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