金　晶，馬　歡，王　晶，李風(fēng)森

(新疆醫(yī)科大學(xué)1中醫(yī)學(xué)院，烏魯木齊　830011；2第一附屬醫(yī)院中醫(yī)內(nèi)科，烏魯木齊　830054；3附屬中醫(yī)醫(yī)院肺病科，烏魯木齊　830000；4新疆維吾爾自治區(qū)呼吸病研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，烏魯木齊　830002)

·中醫(yī)中藥·

益氣固表丸對(duì)COPD模型大鼠水通道蛋白mRNA表達(dá)的影響

金晶1,2，馬歡3，王晶4，李風(fēng)森3

(新疆醫(yī)科大學(xué)1中醫(yī)學(xué)院，烏魯木齊830011；2第一附屬醫(yī)院中醫(yī)內(nèi)科，烏魯木齊830054；3附屬中醫(yī)醫(yī)院肺病科，烏魯木齊830000；4新疆維吾爾自治區(qū)呼吸病研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，烏魯木齊830002)

摘要：目的研究益氣固表丸對(duì)慢性阻塞性肺病(Chronic Obstructive Pulmonary Disease，COPD)模型大鼠肺組織中水通道蛋白(Aquaporin,AQP)1、4、5mRNA表達(dá)的影響。方法采用煙熏+脂多糖(LPS)氣管內(nèi)滴注方法建立COPD模型大鼠，造模成功后，將60只鼠齡為8 w的SPF級(jí)雄性Wistar大鼠隨機(jī)分為3組，分別為：空白組、對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)(益氣固表丸)組,每組20只，空白組和對(duì)照組大鼠給予生理鹽水灌胃，實(shí)驗(yàn)組大鼠給予益氣固表丸相應(yīng)劑量的水溶液灌胃，2次/d，連續(xù)12 w。采用Buxco系統(tǒng)檢測(cè)各組大鼠肺功能吸氣峰流速( Peak Inspiratory Flow，PIF)、呼氣峰流量( Peak Ex-piratory Flow，PEF)及每分鐘通氣量( Minute Volume，MV)，采用蘇木素-伊紅(Hematoxylin-Eosin HE)染色法觀察大鼠肺組織形態(tài)學(xué)改變，RT-PCR方法檢測(cè)大鼠肺組織中水通道蛋白(Aquaporin,AQP)1、4、5mRNA表達(dá)的變化。結(jié)果與空白組比較，對(duì)照組大鼠肺功能PIF、PEF和MV下降，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)；與對(duì)照組比較，實(shí)驗(yàn)組大鼠HE染色的炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)情況減輕，支氣管管腔直徑變寬，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)；與空白組比較，對(duì)照組大鼠肺組織 AQP-1、AQP-4、AQP-5mRNA 表達(dá)下降，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)；與對(duì)照組比較，實(shí)驗(yàn)組大鼠肺功能PIF、PEF及MV均升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)；與空白組比較，實(shí)驗(yàn)組大鼠肺組織AQP-1、AQP-4、AQP-5mRNA表達(dá)升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。結(jié)論益氣固表丸能夠改善 COPD模型大鼠的肺通氣功能，升高大鼠肺組織中 AQ P-1、AQP-4和AQP -5蛋白表達(dá)。

關(guān)鍵詞：益氣固表丸；COPD模型大鼠；水通道蛋白

中圖分類號(hào)：R965

文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A

文章編號(hào)：1009-5551(2018)05-0649-04

要探索建立普通學(xué)生普及性地參與校園足球的強(qiáng)制機(jī)制，這是輸送專業(yè)足球人材和提高整體學(xué)生身體素質(zhì)的最基礎(chǔ)性的保證。如進(jìn)一步細(xì)化、完善足球課的教學(xué)大綱，讓學(xué)生主動(dòng)參與學(xué)習(xí)和訓(xùn)練；進(jìn)一步地完善足球課堂傷害事故的預(yù)防和善后工作，制定相關(guān)保險(xiǎn)法律和法規(guī)；制定并推廣實(shí)行校園內(nèi)部級(jí)別的適合普通學(xué)生的足球等級(jí)制度(健身型的)，大力推廣班級(jí)、校際的各種、各級(jí)足球聯(lián)賽；制定各種相關(guān)的獎(jiǎng)勵(lì)制度來(lái)引導(dǎo)和鼓勵(lì)學(xué)生及家長(zhǎng)對(duì)校園足球的參與和支持。簡(jiǎn)單地說(shuō)，就是把校園足球和學(xué)校體育的各項(xiàng)活動(dòng)完美的結(jié)合起來(lái)，互相促進(jìn)，最終形成系列、完整的，由廣大學(xué)生積極參與的，成效顯著的制度和政策。

回歸分析是將非確定性變量之間的關(guān)系用能夠確定的函數(shù)關(guān)系表達(dá)出來(lái)。應(yīng)用SPSS對(duì)體系中具體的7個(gè)影響因素進(jìn)行相關(guān)性分析，通過(guò)相關(guān)性分析結(jié)果進(jìn)行回歸分析，明確網(wǎng)購(gòu)客戶物流配送滿意度的3個(gè)顯著影響因素，證明研究的有效性。

doi:10.3969/j.issn.1009-5551.2018.05.027

基金項(xiàng)目：新疆維吾爾自治區(qū)自然科學(xué)基金青年科學(xué)基金(2015211C157)

作者簡(jiǎn)介：金晶(1981-)，女，在讀博士，主治醫(yī)師，研究方向：呼吸病的中醫(yī)臨床診治。

通信作者：李風(fēng)森，男，博士，主任醫(yī)師，教授，博士生導(dǎo)師，研究方向：中西醫(yī)結(jié)合呼吸病研究，E-mail:fengsen602@163.com。

本文引用：金晶，馬歡，王晶,等.益氣固表丸對(duì)COPD模型大鼠水通道蛋白mRNA表達(dá)的影響[J].新疆醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào),2018,41(5):649-652.doi:10.3969/j.issn.1009-5551.2018.05.027

EffectsofYiqigubiaopillonexpressionofaquaporinmRNAinCOPDrats

JINJing1,2，MAHuan3，WANGJing4，LIFengsen3

(1CollegeofTraditionalChineseMedicine,XinjiangMedicalUniversity,Urumqi830011,China;2InternalMedicineDepartmentofTCM,FirstAffiliatedHospitalofXinjiangMedicalUniversity,Urumqi, 830054,China;3PulmonaryDepartment,theAffiliatedTraditionalChineseMedicineHospital,XinjiangMedicalUniversity,Urumqi830000,China；4XinjiangUygurAutonomousRegionKeyLaboratoryofRespiratoryDiseaseResearch,Urumqi830002,China)

Abstract：ObjectiveTo study the effect of Yiqi gubiao pill on expression of Aquaporin(AQP)1,4and 5 mRNA in Chronic obstructive pulmonary disease(COPD)rat model.MethodsCOPD was induced by LPS injection and CS inhalation,60 SPF male Wistar rats at 8 weeks old were divided randomly into 3 groups:Blank group,Control group and Treatment(Yiqi biao pill)group(n=20 for every group).Blank group and Control group rats were fed saline lavage twice a day.Trail group rats were fed with Yiqigubiao solution twice a day as well.After 12 weeks,Wistar rat pulmonary function testing Buxco analysis system was used to examine lung function,such as Peak Inspiratory Flow(PIF),Peak Expiratory Flow(PEF),and Minute Volume(MV).HE staining was used to observe lung tissue pathology morphology,and RT-PCR method was used to detect expression of Aquaporin(AQP)1,4,5 mRNA in the lung tissue of rats.ResultsCompared with the Blank group,PIF,PEF and MV in the Control group were all decreased,and the difference was statistically significant(P<0.01).Compared with the Blank group,the expression of AQP-1,AQP-4and AQP-5 mRNA in lung tissues of rats decreased in the Control group,and the difference was statistically significant(P<0.01),Compared with the Control group,lung function indicators:PIF,PEF and MV in the Treatment group were all increased,and the differences were statistically significant(P<0.01).HE staining showed that the infiltration of inflammatory cells in Treatment group was significantly less than the Control group.The narrowing of the bronchial lumen was significantly improved,the diameter of the lumen was significantly wider.Compared with Model group,the expression of AQP-1,AQP-4and AQP-5 mRNA in the Treatment group was increased,and the difference was statistically significant(P<0.05).ConclusionYiqi gubiao pill can improve the pulmonary ventilation function in rats of COPD,and escalate protein expression of AQP-1,AQP-4and AQP-5 in lung tissues of mice.

Keywords:Yiqi gubiao pills;chronic obstructive pulmonary disease(COPD)rat model;aquaporin

氣道黏液高分泌狀態(tài)是慢性阻塞性肺疾病(Chronic Obstructive Pulmonary Disease，COPD)發(fā)病過(guò)程中的一個(gè)關(guān)鍵環(huán)節(jié)，高黏蛋白含量增多，致使痰液黏稠，不易咳出，導(dǎo)致反復(fù)感染[1]。水通道蛋白(Aquaporin,AQP)是細(xì)胞膜轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白，廣泛存在于生物組織的內(nèi)皮細(xì)胞和表皮細(xì)胞膜上，與肺泡液體的轉(zhuǎn)運(yùn)、氣道表面液體的調(diào)整、氣道濕化及鼻咽部分泌物的產(chǎn)生有關(guān)，AQP代謝失常是氣道黏液高分泌狀態(tài)的主要因素[2-3]，糾正AQP代謝失調(diào)對(duì)氣道高反應(yīng)的影響，成為研究COPD預(yù)防和治療的切入點(diǎn)[4-5]。益氣固表丸是以“培土生金”為治則治療COPD的常用中成藥，由黨參、炒白術(shù)、茯苓、陳皮、法半夏、生薏苡仁、浮小麥、紫蘇子、蜜款冬花、黃芩、伊貝母、蜜枇杷葉、防風(fēng)共13味中藥組成，取“益氣為健運(yùn)脾氣、固表為補(bǔ)益肺氣”之意，能夠有效改善證屬肺脾氣虛證COPD患者咳嗽痰多等呼吸道癥狀[6-7]，方中黨參為君藥，合白術(shù)、茯苓、半夏及陳皮以行 “二陳湯”之理氣和中燥濕之功效，輔以貝母止咳化痰，薏苡仁淡滲利濕，浮小麥及黃芩以滋陰斂汗而清肺之虛熱，紫蘇以祛風(fēng)勝濕固表，余藥以清利肺氣，諸藥共參，以行補(bǔ)肺氣、化痰濕之效。本研究探究益氣固表丸對(duì)COPD模型大鼠呼吸道黏液分泌的影響，檢測(cè)大鼠肺組織中水通道蛋白(Aquaporin,AQP)1、4及5mRNA表達(dá)，為益氣固表丸的進(jìn)一步臨床應(yīng)用和開(kāi)發(fā)提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)，現(xiàn)報(bào)道如下。

1　材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物取SPF級(jí)鼠齡8 w的雄性Wistar大鼠60只，由新疆醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供[動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào)：SCXK(新)2011-0004，實(shí)驗(yàn)單位使用許可證號(hào)SCXK(新)2011-0001]。飼養(yǎng)環(huán)境模擬自然晝夜條件，溫度(21±2)℃，濕度40%～50%，自由飲水，體質(zhì)量(200±50)g。

1.2試藥益氣固表丸購(gòu)自新疆醫(yī)科大學(xué)附屬中醫(yī)醫(yī)院中心藥房(新疆制藥廠，批號(hào)20121212)，脂多糖(Lipopolysaccharide LPS，美國(guó)Signa公司)，雪蓮過(guò)濾嘴香煙(新疆卷煙廠，烤煙型，焦油量13mg，煙氣煙堿量1.1mg，煙氣一氧化碳量13mg)，Platinum SYBR Green qPCR SuperMix-UDG試劑盒(美國(guó)Invitrogen公司，批號(hào) C11733-038)，Trizol試劑(美國(guó)Invitrogen公司，批號(hào) 15596-026)，M-MLV First-Strand Synthesis Kit反轉(zhuǎn)錄試劑盒(美國(guó)Invitrogen公司，批號(hào) C28025-032)，RT-PCR引物由上海生工生物工程有限公司合成。

1.3儀器自制動(dòng)物熏吸箱(60cm×50cm×40cm)，PLY3211型Wistar大鼠全身暴露型無(wú)創(chuàng)肺功能檢測(cè)分析系統(tǒng)(美國(guó)Buxco Electronics公司)，U-CMAD3 型顯微鏡(日本Olympus公司)，GX51型全自動(dòng)圖像分析系統(tǒng)(日本Olympus公司)，YP102N型電子天平(上海天平儀器廠)，Milli-Q型純水處理儀(美國(guó) Millipore公司)，-80℃低溫冰箱(德國(guó) Thermo公司)，5418/5418R型高速臺(tái)式離心機(jī)(德國(guó) Eppendorf公司)，Thermal cycler C1000型深孔PCR 儀(美國(guó)BIO-RAD公司)。

1.4COPD動(dòng)物模型的建立及評(píng)價(jià)方法采用煙熏(CS)聯(lián)合彈性蛋白酶(LPS)氣管內(nèi)滴注方式建立COPD大鼠模型[8]，將大鼠放置于自制動(dòng)物熏吸箱，煙霧濃度 450～500bpm進(jìn)行熏煙，每次30min，每次間隔3h，每12小時(shí)更換煙盒1次，并于大鼠氣管內(nèi)滴注LPS 0.2mg /kg體質(zhì)量，連續(xù)12 w。造模第一天和最后一天(第84天)，分別稱取大鼠體質(zhì)量后放入檢測(cè)室(傳感器)，采用Wistar大鼠肺功能檢測(cè)Buxco系統(tǒng)檢測(cè)大鼠肺功能吸氣峰流速(Peak Inspiratory Flow，PIF)、呼氣峰流量(Peak Ex-piratory Flow，PEF)和每分鐘通氣量(Minute Volume，MV)，與空白組大鼠比較，以上指標(biāo)下降幅度>30%即為COPD模型成功。按照隨機(jī)數(shù)字表法將大鼠分為空白組大鼠(n=20)、對(duì)照組(n=20)、實(shí)驗(yàn)(益氣固表丸)組(n=20)。按照人與動(dòng)物間體表面積折算等效劑量公式[9]折算相應(yīng)劑量，實(shí)驗(yàn)組大鼠每日灌藥量為513mg/kg體質(zhì)量，空白組和對(duì)照組大鼠每天灌胃0.9%生理鹽水6.6mL，實(shí)驗(yàn)組大鼠灌胃益氣固表丸水溶液6.6mL，每天2次，所有大鼠在給藥期間正常喂食,灌胃12 w后處死，取出肺組織，備用。

1.5病理標(biāo)本的制作取每組大鼠左肺組織，在垂直于支氣管的肺矢狀面最大周徑處取材，取厚約5mm的肺組織，剪成面積為1.5cm2左右的小塊，浸入2mL的4%多聚甲醛溶液中固定，用PBS緩沖液洗滌，并浸泡在固定劑24h后，石蠟包埋，將標(biāo)本切成3～4μm并加工用于HE染色。

1.6肺組織AQPmRNA的檢測(cè)取每組大鼠右肺組織100mg，依據(jù)Trizol試劑說(shuō)明書(shū)提取組織總RNA，PCR試劑盒反轉(zhuǎn)錄合成cDNA并擴(kuò)增目的基因，引物由上海生工生物技術(shù)有限公司合成。反應(yīng)總體系為25μL。PCR產(chǎn)物經(jīng)1.2%瓊脂糖凝膠電泳確定其完整性，拍照并讀取灰度值，分析AQP1、AQP4、AQP5 mRNA轉(zhuǎn)錄水平變化情況，見(jiàn)表1。

表1　AQP1、AQP4、AQP5 引物序列表

2　結(jié)果

2.1大鼠肺組織形態(tài)學(xué)觀察空白組大鼠支氣管結(jié)構(gòu)及肺泡結(jié)構(gòu)清晰，支氣管未見(jiàn)明顯收縮，未見(jiàn)明確炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)，氣道上皮排列整齊，管腔規(guī)則。對(duì)照組大鼠支氣管及肺泡組織結(jié)構(gòu)紊亂，部分結(jié)構(gòu)消失，支氣管黏膜可見(jiàn)大量炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)，支氣管出現(xiàn)收縮的現(xiàn)象，管腔變窄，氣道上皮排列不整齊，甚至出現(xiàn)斷裂的情況。實(shí)驗(yàn)組較對(duì)照組大鼠支氣管炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)情況減輕，支氣管收縮好轉(zhuǎn)，管腔變窄情況改善，管腔直徑變寬，見(jiàn)圖1。

圖1　大鼠肺組織HE染色結(jié)果(×200)

2.2各組大鼠肺功能比較與空白組比較，對(duì)照組大鼠PIF、PEF 和 MV降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)；與對(duì)照組比較，實(shí)驗(yàn)組大鼠PIF、PEF、MV升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)，見(jiàn)表2。

2.3各組大鼠肺組織中AQP-1、AQP-4、AQP-5的mRNA表達(dá)比較與空白組比較，對(duì)照組大鼠肺組織中AQP-1、AQP-4、AQP-5 mRNA表達(dá)降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)；與對(duì)照組比較，實(shí)驗(yàn)組大鼠肺組織中AQP-1、AQP-5 mRNA表達(dá)升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)，AQP-4mRNA無(wú)變化，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05),見(jiàn)表3。

2.4AQP-1、AQP-4和AQP-5mRNA表達(dá)與肺功能的相關(guān)性分析各組大鼠肺組織中 AQP-1、AQP-5 蛋白表達(dá)與大鼠PIF、PEF和MV指標(biāo)均呈負(fù)相關(guān)(r分別為-0.835 4、-0.7642、-0.7524)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。各組大鼠肺組織中AQP-4mRNA表達(dá)與大鼠 PIF、PEF 和 MV 均呈負(fù)相關(guān)(r分別為-0.245 5、-0.368 8、-0.376 8)，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。

表2　各組大鼠肺功能指標(biāo)的比較

注:與空白組比較，*P<0.01;與對(duì)照組比較，△P<0.01。

表3　各組大鼠肺組織中AQP-1、AQP-4、AQP-5表達(dá)的影響

注:與空白組比較，*P<0.01;與對(duì)照組比較，△P<0.01。

3　討論

COPD證屬中醫(yī)學(xué)“肺脹”范疇，“痰飲蘊(yùn)肺”是在“肺脹”發(fā)展過(guò)程的重要證候[10]?，F(xiàn)代中醫(yī)學(xué)者將“整體觀”、“辨證觀” 與多種組學(xué)信息相結(jié)合，建立系統(tǒng)生物學(xué)與中醫(yī)證候相結(jié)合的“系統(tǒng)-系統(tǒng)”的研究[11]。有學(xué)者[12-13]認(rèn)為高分泌是“痰飲”的物質(zhì)基礎(chǔ)，使用健脾益肺化痰方，通過(guò)抑制“ILl3-pSTAT6-MUC5AC”信號(hào)通路改善 COPD大鼠氣道黏液高分泌狀態(tài)。詹少鋒等[14]發(fā)現(xiàn)益氣化痰方能夠抑制COPD模型小鼠Muc5ac和 AQP -5的蛋白表達(dá)，認(rèn)為“肺主通調(diào)水道”與現(xiàn)代研究對(duì) COPD在細(xì)胞免疫、炎癥及黏液高分泌狀態(tài)的病理本質(zhì)認(rèn)知是相一致的。祝小惠等[15]應(yīng)用“從腸論治”法促進(jìn)COPD模型大鼠肺組織AQP s mRNA的表達(dá)，改善氣道炎癥及表面液體的調(diào)節(jié)功能。尚立芝等[16]應(yīng)用愛(ài)羅咳喘寧方上調(diào)COPD模型大鼠支氣管組織AQP5、抑制MUC5AC 基因表達(dá)，改善局部氣道濕化作用。

本研究探討慢性氣道炎癥環(huán)境下“痰飲”的物質(zhì)基礎(chǔ)，發(fā)現(xiàn)COPD模型大鼠肺功能下降的同時(shí)肺組織中AQP-1、AQP-4及AQP-5mRNA表達(dá)降低，說(shuō)明AQP-1、 AQP- 5mRNA表達(dá)降低可能引起的氣道內(nèi)水轉(zhuǎn)運(yùn)功能下降，在炎性因素的刺激下容易導(dǎo)致氣道黏液分泌過(guò)多，產(chǎn)生氣道阻塞。益氣固表丸能夠使AQP-1、AQP-5mRNA表達(dá)升高，促進(jìn)呼吸道水轉(zhuǎn)運(yùn)功能，調(diào)節(jié)呼吸道液體轉(zhuǎn)運(yùn)，減少痰液產(chǎn)生，減輕氣道高分泌狀態(tài)，減少氣道阻塞，從而起到降低氣流受限的作用。

[收稿日期：2017-11-10]

(本文編輯施洋)