潘陽，吳丹，吳敬

1 江南大學(xué) 食品科學(xué)與技術(shù)國家重點實驗室，江蘇 無錫 214122

2 江南大學(xué) 生物工程學(xué)院 工業(yè)生物技術(shù)教育部重點實驗室，江蘇 無錫 214122

巴斯德畢赤酵母已成為最廣泛的外源蛋白表達(dá)系統(tǒng)之一，已有上千種蛋白在畢赤酵母系統(tǒng)中得到成功表達(dá)，重組蛋白產(chǎn)品涉及食品、飼料、醫(yī)藥等眾多行業(yè)[1]。用于食品或者飼料行業(yè)的多種酶制劑如植酸酶、脂肪酶、甘露聚糖酶、木聚糖酶、α-葡萄糖苷酶等利用畢赤酵母實現(xiàn)了產(chǎn)業(yè)化規(guī)模的生產(chǎn)[2-3]。近些年，畢赤酵母被美國FDA認(rèn)定為Generally recognized as safe (GRAS) 微生物[4]，使得畢赤酵母在食品領(lǐng)域具備極大的應(yīng)用潛力。畢赤酵母目前常用的表達(dá)質(zhì)粒根據(jù)不同的啟動子分為 pPIC系列甲醇誘導(dǎo)型表達(dá)載體 (如pPIC3.5k、pPIC9K、pPICZ、pAO815等) 和 pGAP系列組成型表達(dá)載體。其中pPIC系列質(zhì)粒含醇氧化酶 (AOX) 啟動子，該啟動子是以甲醇為唯一誘導(dǎo)物并受其嚴(yán)謹(jǐn)控制的強啟動子，由于 AOX表達(dá)是受轉(zhuǎn)錄水平調(diào)控的，其強誘導(dǎo)型啟動子AOX能非常有效地控制外源基因的表達(dá)[5]。但其也有不足之處，畢赤酵母在不受控制的條件下細(xì)胞先生長至高密度，然后通過甲醇誘導(dǎo)啟動外源蛋白表達(dá)，這增加了工程菌的培養(yǎng)時間和工作量。同時在大規(guī)模生產(chǎn)過程中，甲醇的使用也存在諸多弊端，如易揮發(fā)、濃度不易檢測、有潛在的火災(zāi)隱患、具有毒性、不適于藥品和食品蛋白的生產(chǎn)等[6]，因而制約了畢赤酵母表達(dá)系統(tǒng)的大規(guī)模應(yīng)用。pGAP系列質(zhì)粒含 3-磷酸甘油醛脫氫酶(GAP) 啟動子，GAP啟動子受碳源調(diào)控[7]，葡萄糖為碳源時其轉(zhuǎn)錄水平最高，其次是甘油、油酸，甲醇最低[8]。相對于AOX啟動子，雖然GAP啟動子表達(dá)外源蛋白的水平較低，但是該組成型啟動子不需甲醇誘導(dǎo)，發(fā)酵工藝簡單，具有適合于食品規(guī)?；瘧?yīng)用的優(yōu)勢。因此如果能改造 pGAP質(zhì)粒進(jìn)而提高異源蛋白的表達(dá)水平，將極大促進(jìn)畢赤酵母在食品領(lǐng)域的應(yīng)用。

基因拷貝數(shù)是畢赤酵母表達(dá)重組蛋白的一個影響因素。目前基因拷貝數(shù)對表達(dá)量的影響仍然無法預(yù)測，大多數(shù)情況下，外源蛋白的表達(dá)量會隨著拷貝數(shù)的增加而相應(yīng)增加[9]。目前在畢赤酵母系統(tǒng)中多采用在基因組上插入多個外源基因拷貝來增加基因劑量，如通過增加博來霉素濃度來篩選高拷貝外源基因菌株[10]，或者應(yīng)用BglⅡBrick方法將目的基因表達(dá)盒用同尾酶連接在一起，構(gòu)建成含多拷貝表達(dá)盒的重組表達(dá)質(zhì)粒并整合到宿主菌株基因組中，從而得到含高拷貝外源基因的轉(zhuǎn)化子[11]。過去認(rèn)為在畢赤酵母中整合到染色體表達(dá)比游離載體表達(dá)穩(wěn)定，但研究發(fā)現(xiàn)整合區(qū)域都是相鄰近的位點，穩(wěn)定性差，在一定條件下可能通過同源重組而丟失[12]。此外，在酵母基因組上整合外源基因會對細(xì)胞自身生理代謝造成不利影響，整合到基因組中高拷貝重組菌株生長速率和細(xì)胞活性都有降低的現(xiàn)象[13]。而游離型載體能夠在細(xì)胞內(nèi)獨立于宿主細(xì)胞本身的復(fù)制周期而實現(xiàn)擴增，因而可顯著增加外源基因拷貝數(shù)，同時游離載體表達(dá)方式對菌體基因組影響很小。目前用于畢赤酵母的質(zhì)粒均為整合型質(zhì)粒，尚未見到采用游離型表達(dá)質(zhì)粒來進(jìn)行異源蛋白的表達(dá)。

木聚糖酶分布廣泛，主要來自自然界中一些真菌、細(xì)菌、無脊椎動物體內(nèi)以及植物組織等[14]。人們研究比較多的是微生物生產(chǎn)木聚糖酶，已經(jīng)報道的產(chǎn)木聚糖酶菌株有各種霉菌和鏈霉菌以及芽孢桿菌等[15-16]。木聚糖酶是糖苷水解酶 (EC 3.2.1.x)，糖苷水解酶分成若干家族，木聚糖酶主要分布在第10家族 (F10) 和11家族 (G11) 兩大家族[17-18]。一般來講F10木聚糖酶分子質(zhì)量一般大于30 kDa，結(jié)構(gòu)復(fù)雜，含有多個結(jié)構(gòu)域；而G11木聚糖酶多為單一結(jié)構(gòu)域，相對分子質(zhì)量一般小于30 kDa[19-21]。木聚糖酶能將木聚糖水解為低聚木糖以及木糖單糖[22]，在造紙、面制品、低聚木糖制備、果蔬生產(chǎn)、飼料等行業(yè)中有很好的應(yīng)用價值。目前木聚糖酶異源表達(dá)大多以畢赤酵母為宿主并在甲醇誘導(dǎo)下實現(xiàn)，如在本實驗室前期研究當(dāng)中，從鏈霉菌Streptomycessp. FA1中分離純化出一種第10家族 (GH10) 的木聚糖酶 (XynA)，通過構(gòu)建畢赤酵母重組菌株在甲醇的誘導(dǎo)下實現(xiàn)較高水平分泌表達(dá)，搖瓶水平達(dá)到130 U/mL[23]；張慧敏等將一種11家族極端耐熱木聚糖酶的密碼子優(yōu)化基因Syxyn11克隆到畢赤酵母表達(dá)載體pPIC9K中，轉(zhuǎn)化酵母后用甲醇誘導(dǎo)酶活可達(dá)到17.74 U/mL[24]。為了消除甲醇在重組木聚糖酶生產(chǎn)中的應(yīng)用風(fēng)險，本研究通過選用來源于酵母自身的自我復(fù)制序列 (PARS)改造 pGAP表達(dá)質(zhì)粒，使之成為自主復(fù)制的游離型表達(dá)載體，不僅可以獲得高拷貝數(shù)菌株，同時還可以穩(wěn)定傳代。進(jìn)而比較單獨利用游離載體、游離載體與基因整合聯(lián)用等多種表達(dá)組合體來研究進(jìn)一步提高木聚糖酶的表達(dá)水平。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株和質(zhì)粒

大腸桿菌Escherichia coliJM109由本實驗室保存；載體pMD19T-Simple購于大連寶生物公司。畢赤酵母 KM71和表達(dá)質(zhì)粒 pGAPZαA購自Invitrogen公司。

1.1.2 培養(yǎng)基

YPD液體培養(yǎng)基：酵母粉 5.0 g/L，胰蛋白胨10.0 g/L，葡萄糖10.0 g/L。YPD固體培養(yǎng)基：在YPD液體培養(yǎng)基的基礎(chǔ)配方上，添加1.0%?2.0% (M/V) 的瓊脂。BMGY培養(yǎng)基：酵母粉5.0 g/L，胰蛋白胨10.0 g/L，YNB 13.4 g/L，生物素 4×10–4g/L，甘油10.0 g/L。發(fā)酵種子培養(yǎng)基：酵母粉10.0 g/L，胰蛋白胨20.0 g/L，YNB 13.4 g/L，甘油30.0 g/L。BSM培養(yǎng)基：85%磷酸26.7 mL/L，CaSO40.93 g/L，K2SO418.2 g/L，MgSO4·7H2O 14.9 g/L，KOH 4.13 g/L，甘油40.0 g/L，微量元素鹽溶液4.35 mL/L，組氨酸2.0 g/L。

1.1.3 試劑

rTaq酶、限制性內(nèi)切酶、T4 DNA連接酶、Primer StarTMHS DNA聚合酶、DL-10000 DNA Marker均購于TaKaRa有限公司；Endo Hf內(nèi)切酶購于NEB (北京) 有限公司；瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒、PCR純化試劑盒和質(zhì)粒提取試劑盒均購自天根生化科技有限公司；中分子量標(biāo)準(zhǔn)蛋白、聚丙烯酰胺凝膠電泳 (SDS-PAGE) 試劑盒均購于碧云天生物技術(shù)有限公司 (上海)；博來霉素(Zeocin) 購自 Invitrogen公司；分子級的胰蛋白胨和酵母粉購自英國Oxoid公司；所有質(zhì)粒測序均由上海睿迪生物技術(shù)有限公司提供支持；無特殊說明，其他試劑均屬于國產(chǎn)分析純。

1.2 方法

1.2.1 表達(dá)載體的構(gòu)建

自主復(fù)制序列 PARS來源于乳酸克魯維酵母Kluyveromyces lactis[25]并由人工合成，同時合成的2對引物序列如表1所示。以PARS序列為模板用上游引物F1和下游引物R1，擴增并回收片段，將該片段與pGAPZαA質(zhì)粒通過infusion酶進(jìn)行融合連接，構(gòu)建載體 pGAPZαA-PARS。設(shè)計上游引物 F2和下游引物R2，并分別引入EcoRⅠ和NotⅠ限制性酶切位點 (劃線部分)。擴增xynA后，將載體pGAPZαA-PARS和目的基因xynA經(jīng)EcoRⅠ、NotⅠ雙酶切，通過T4 DNA聚合酶連接處理構(gòu)建重組質(zhì)粒 pGAPZαA-PARS-XynA，擴增質(zhì)粒測序正確后用于轉(zhuǎn)化畢赤酵母。載體pGAPZαA和目的基因xynA經(jīng)EcoRⅠ、NotⅠ雙酶切，通過T4 DNA聚合酶連接處理構(gòu)建重組質(zhì)粒pGAPZαA-xynA，擴增質(zhì)粒測序正確后轉(zhuǎn)化畢赤酵母。

表1 引物序列Table 1 Primer sequence

1.2.2 質(zhì)粒 pGAPZαA-PARS-xynA、pGAPZαA-xynA轉(zhuǎn)化畢赤酵母KM71

將測序正確的重組游離質(zhì)粒 pGAPZαAPARS-xynA直接電轉(zhuǎn)化畢赤酵母KM71感受態(tài)細(xì)胞；整合型質(zhì)粒pGAPZαA-xynA和空載pGAPZαA用AvrⅡ線性化，將線性化后的質(zhì)粒分別電轉(zhuǎn)化至畢赤酵母KM71感受態(tài)細(xì)胞，加入1 mL 1 mol/L預(yù)冷的山梨醇，吹打均勻，將其轉(zhuǎn)入1.5 mL EP管中，30 ℃、200 r/min 搖床培養(yǎng) 2 h，然后吸取 200 μL涂布于YPD平板上，30 ℃恒溫條件下培養(yǎng)至長出單菌落，利用菌落PCR鑒定陽性克隆，實驗以轉(zhuǎn)化空載體pGAPZαA的酵母菌作為負(fù)對照。

1.2.3 重組畢赤酵母轉(zhuǎn)化子的搖瓶表達(dá)

將游離型質(zhì)粒 pGAPZαA-PARS-xynA、整合型質(zhì)粒pGAPZαA-xynA轉(zhuǎn)化酵母后產(chǎn)生的轉(zhuǎn)化子中各挑選10個轉(zhuǎn)化子進(jìn)行搖瓶誘導(dǎo)表達(dá)，比較各轉(zhuǎn)化子表達(dá)產(chǎn)物的酶活情況，以篩選酶活較高的轉(zhuǎn)化子。將轉(zhuǎn)化子接種于10 mL YPD培養(yǎng)基中，于30 ℃、200 r/min恒溫?fù)u床培養(yǎng)24 h后轉(zhuǎn)接2.5 mL于50 mL BMGY培養(yǎng)基中，200 r/min、30 ℃培養(yǎng)24 h后離心收集菌體，再轉(zhuǎn)入100 mL YPD培養(yǎng)基中進(jìn)行表達(dá)，表達(dá)4 d后測酶活。所用到的各種培養(yǎng)基配方參照 Invitrogen公司畢赤酵母操作手冊。

1.2.4 酶活力的測定

將0.5 g的木聚糖 (櫸木來源) 溶于100 mL 50 mmol/L的磷酸緩沖液 (pH 5.5)，充分混勻。取1 mL底物，在50 ℃預(yù)熱10 min，加入1 mL稀釋一定倍數(shù)的酶液，反應(yīng)10 min后加入3 mL 3,5-二硝基水楊酸溶液，煮沸10 min迅速冷卻，加蒸餾水定容至20 mL，540 nm下測吸光度 (以滅活的酶液為催化劑同樣操作作為空白對照)。

在上述條件下，將每分鐘水解木聚糖生成1 μmol的木糖所需酶量定義為木聚糖酶的一個單位的酶活力 (U)。

1.2.5 發(fā)酵罐上罐發(fā)酵

從–80 ℃保藏甘油管中吸取200 μL接到100 mL種子搖瓶培養(yǎng)基中，30 ℃、200 r/min條件下培養(yǎng)24 h后，將100 mL種子接入3.6 L發(fā)酵罐中進(jìn)行發(fā)酵。發(fā)酵初始培養(yǎng)基為BSM培養(yǎng)基，發(fā)酵罐發(fā)酵分為甘油生長階段、甘油補料培養(yǎng)和不同碳源補料培養(yǎng)3個階段。甘油生長階段中通過攪拌和通風(fēng)量控制DO在30%，溫度控制在30 ℃，流加氨水控制發(fā)酵液在pH 5.0左右，培養(yǎng)大約20 h左右DO值迅速上升時，進(jìn)入甘油補料培養(yǎng)階段，此時流加50%的甘油 (含組氨酸 5 g/L) 補料，當(dāng)酵母生長到OD600約為100時停止甘油補料，DO值再次迅速上升時，根據(jù)不同的碳源分別進(jìn)行第三階段補料流加培養(yǎng)，碳源分別有甘油、葡萄糖、蔗糖和混合碳源 (甘油︰蔗糖為 1︰2，1︰1，2︰1)，各種碳源均配成 50%的濃度 (含組氨酸 5.0 g/L)進(jìn)行流加。所用到的各種培養(yǎng)基配方參照 Invitrogen公司畢赤酵母操作手冊。

1.2.6 Endo Hf處理外源蛋白

取20 μL發(fā)酵上清液，加入2 μL的10×糖蛋白變性緩沖液，100 ℃煮沸10 min。將煮好的樣品冷卻至室溫，加入2 μL 10×G5緩沖液，3 μL Endo Hf內(nèi)切酶，在37 ℃酶切1 h。將處理好的樣品進(jìn)行SDS-PAGE分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 表 達(dá) 載 體pGAPZαA-PARS-xynA 、pGAPZαA-xynA的構(gòu)建

將 PCR擴增后的 PARS片段通過 In-Fusion試劑盒整合進(jìn)質(zhì)粒pGAPZαA中，構(gòu)建pGAPZαAPARS質(zhì)粒，將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌JM109后擴增質(zhì)粒，擴增質(zhì)粒經(jīng)NcoⅠ和NotⅠ酶切，得到大小約為900 bp和2 600 bp的片段，為正確質(zhì)粒(圖1A)，質(zhì)粒經(jīng)上海睿迪生物技術(shù)有限公司測序，結(jié)果正確。將質(zhì)粒pGAPZαA-PARS和pGAPZαA經(jīng)雙酶切后和同樣雙酶切的木聚糖酶基因xynA構(gòu)建重組表達(dá)質(zhì)粒 pGAPZαA-PARS-xynA和pGAPZαA-xynA，將構(gòu)建好的重組質(zhì)粒用EcoRⅠ、NotⅠ雙酶切，條帶大小分別約為3 600和1 300 bp(PGAPZαA-PARS-xynA)、3 100和1 300 bp (pGAPZαA-xynA) 為正確重組質(zhì)粒 (圖1B)，質(zhì)粒經(jīng)上海睿迪生物技術(shù)有限公司測序，結(jié)果正確。

圖1 重組質(zhì)粒的酶切鑒定Fig. 1 Identification of recombinant plasmids with enzyme digestion. (A) M: DNA marker; 1:pGAPZαA-PARS digested with EcoRⅠand NotⅠ. (B)M: DNA marker; 1?2: pGAPZαA-PARS-xynA digested with EcoRⅠand NotⅠ; 3: pGAPZαA-xynA digested with EcoRⅠand NotⅠ.

2.2 搖瓶發(fā)酵

以 pGAPZαA-PARS-xynA、pGAPZαA-xynA分別代表其所轉(zhuǎn)化感受態(tài)酵母細(xì)胞 KM71，每種重組畢赤酵母篩選了10個重組子，在YPD培養(yǎng)基中培養(yǎng)6 d后離心取上清液測木聚糖酶活力，如表2所示，所挑出的兩種不同菌株轉(zhuǎn)化子均能檢測到酶活，說明兩種質(zhì)粒都成功轉(zhuǎn)化到了畢赤酵母中并表達(dá)。重組菌 pGAPZαA-PARS-xynA木聚糖酶活力顯然高于 pGAPZαA-xynA，前者酶活最高達(dá)到29.6 U/mL，后者最高為16.0 U/mL，前者提高了85%。分別取兩株產(chǎn)量最高的重組菌用于后續(xù)發(fā)酵罐水平研究。

表2 不同表達(dá)類型的木聚糖酶活力Table 2 Activity of recombinant xylanase expressed by P. p astoris containing episomal or an integrated plasmid

2.3 發(fā)酵罐優(yōu)化

2.3.1 甘油為碳源進(jìn)行pGAPZαA-PARS-xynA、pGAPZαA-xynA發(fā)酵研究

發(fā)酵罐高密度培養(yǎng)和搖瓶培養(yǎng)差別巨大，為了進(jìn)一步研究發(fā)酵罐水平下游離型菌株和整合型菌株的產(chǎn)酶水平，以甘油為碳源進(jìn)行兩種菌株的對比培養(yǎng)。圖 2A顯示游離載體菌株 pGAPZαAPARS-xynA生長都較整合型菌株 pGAPZαA-xynA稍高，到最后二者生物量接近。圖2B說明pGAPZαAPARS-xynA分泌量要顯著高于pGAPZαA-xynA，前者最高酶活達(dá)到 343 U/mL，相對于后者最高235 U/mL酶活提高45.9%。單位OD菌株分泌木聚糖酶能力比較，前者為0.71和0.53 IU/OD600，游離型菌株生產(chǎn)木聚糖酶的能力顯著強于整合型菌株。圖 2C顯示發(fā)酵罐上清液蛋白質(zhì)表達(dá)量出現(xiàn)一個奇怪的現(xiàn)象，即培養(yǎng) 60 h后 pGAPZαAPARS-xynA菌株上清液蛋白質(zhì)含量顯著少于pGAPZαA-xynA菌株，前者最高含量達(dá)到2.1 g/L，后者則達(dá)到2.7 g/L，說明上清液中可能有較多的雜蛋白分泌出來，或者木聚糖酶被酵母分泌的蛋白酶降解而降低了酶活。

圖2 游離型菌株和整合型菌株的上罐比較Fig. 2 Fermentation comparison of episomal and integrated strains. (A) Time course of biomass of strains with episomal or integrated plasmid. (B) The activity of xylanase produced by strains with episomal or integrated plasimid. (C) The expression level of protein in strains with episomal or integrated plasmid.

為了進(jìn)一步探究pGAPZαA-xynA菌株發(fā)酵罐上清液中木聚糖酶酶活降低的原因，分別對兩種菌株不同培養(yǎng)時間的上清液進(jìn)行 SDS-PAGE分析。pGAPZαA-PARS-xynA菌株上清液 (圖 3A) 中含一條清晰的XynA目的條帶，相比之下pGAPZaA-xynA菌株上清液在目的條帶位置有兩條相鄰很近的條帶 (圖 3B)，說明 pGAPZαA-xynA菌株培養(yǎng)上清液中出現(xiàn)了除XynA之外的特異性雜帶，推測有可能是畢赤酵母表達(dá)外源蛋白過程中糖基化造成的。糖基化通常使外源蛋白分子量比實際偏大，我們通過Endo Hf內(nèi)切酶處理pGAPZαA-xynA整合型菌株發(fā)酵上清液 (圖 3C) 進(jìn)行去糖基化分析，結(jié)果顯示存在糖基化。糖基化的出現(xiàn)，直接導(dǎo)致了pGAPZαA-xynA菌株上清液蛋白中XynA的比活降低。pGAPZαA-PARS-xynA菌株產(chǎn)酶比活達(dá)到16 333 U/g，相對pGAPZαA-xynA的87 037 U/g提高了81.2%。

2.3.2 不同碳源下游離型菌株的上罐發(fā)酵

發(fā)酵過程中培養(yǎng)基對微生物生長、目的產(chǎn)物生成起著至關(guān)重要的作用，培養(yǎng)基的優(yōu)劣直接決定發(fā)酵的成敗。GAP組成型啟動子最大優(yōu)勢是不需要甲醇誘導(dǎo)，因而相對于 AOX啟動子在食品行業(yè)具有天然的優(yōu)勢。含組成型啟動子的重組菌其表達(dá)功能可以伴隨著菌體生長而一直持續(xù)進(jìn)行，因此在有碳源提供的條件下可一直連續(xù)培養(yǎng)表達(dá)。組成型啟動子GAP可應(yīng)用多種碳源進(jìn)行生長表達(dá)。本研究采用常見的碳源甘油、葡萄糖，同時采用較為廉價的工業(yè)蔗糖為碳源，并且嘗試采用甘油和蔗糖的混合碳源對游離型pGAP菌株進(jìn)行培養(yǎng)，以降低重組木聚糖酶的制備成本。其中蔗糖和甘油混合流加已經(jīng)做過1︰1，1︰2和2︰1三種不同碳源混合流加，因1︰2的比例獲得表達(dá)水平最高，故本研究中采用1︰2比例混合碳源的數(shù)據(jù)進(jìn)行分析。從圖2及圖4中可以看出，對以甘油、葡萄糖、蔗糖和混合碳源流加4種培養(yǎng)方式，酶活最高分別為350、304、205、281 U/mL，以甘油為碳源時木聚糖酶的表達(dá)量最高，以蔗糖為碳源時表達(dá)量最低，其中混合碳源和以葡萄糖為碳源的培養(yǎng)結(jié)果大致接近。以單位生物量產(chǎn)酶水平比較，分別為 0.71、0.65、0.74、0.66 IU/OD600，可見不同碳源培養(yǎng)時菌株產(chǎn)酶能力大體接近，菌株生長能力對產(chǎn)酶水平影響顯著。

圖3 pGAPZαA-PARS-xynA和pGAPZαA-xynA菌株發(fā)酵上清中XynA的SDS-PAGE分析Fig. 3 SDS-PAGE analysis of XynA in the fermentation supernatant of pGAPZαA-PARS-xynA and pGAPZαA-xynA. (A) Fermentation supernatant of pGAPZαAPARS-xynA. M: marker; 1: 48 h; 2: 60 h; 3: 72 h; 4: 84 h; 5:96 h; 6: 108 h. (B) Fermentation supernatant of pGAPZαA-xynA. M: marker; 1: 24 h; 2: 48 h; 3: 60 h; 4:72 h; 5: 84 h; 6: 96 h; 7: 108 h. (C) Deglycosylation of XynA in pGAPZαA-xynA fermentation supernatant. M:marker; 1: XynA in fermentation supernatant of pGAPZαA-xynA; 2: deglycosylation of XynA in pGAPZαA-xynA fermentation supernatant digested with Endo Hf.

3 討論

在搖瓶發(fā)酵中，pGAPZαA-PARS-xynA菌株產(chǎn)酶水平比pGAPZαA-xynA高85%，發(fā)酵罐水平高 45.9%。另外，發(fā)酵罐培養(yǎng)過程中單位菌體量的產(chǎn)酶水平對比也是前者高出后者 33.9%，由此可見，游離型的載體表達(dá)木聚糖酶的能力顯著高于整合型載體。由于 GAP啟動子不需要甲醇誘導(dǎo)，因此構(gòu)建游離的pGAP載體強化外源蛋白的表達(dá)將大大拓展畢赤酵母在食品工業(yè)中的應(yīng)用。游離型載體產(chǎn)酶水平高于整合型表達(dá)，這可能是由于游離型的載體具有較高的拷貝數(shù)所導(dǎo)致。過去一般認(rèn)為與游離狀態(tài)相比載體整合到染色體中是很穩(wěn)定的，但研究表明無論是體內(nèi)法還是體外法載體都是整合在相鄰近的位點，這種方式是不穩(wěn)定的，在一定條件下可能通過同源重組而丟失[12]，導(dǎo)致在增加拷貝數(shù)上存在限制。

在分泌蛋白修飾中，糖基化是一種重要修飾方式，影響蛋白的結(jié)構(gòu)與功能。在pGAPZαA-xynA菌株中上清液出現(xiàn)了明顯的糖基化XynA蛋白，導(dǎo)致XynA的酶活力降低。同一種酶在酵母中因為表達(dá)方式的不同而產(chǎn)生不同的糖基化是一個很奇怪的現(xiàn)象。這可能是外源基因整合進(jìn)基因組表達(dá)和游離載體表達(dá)的異源蛋白質(zhì)加工過程存在差異，從而產(chǎn)生了不同的糖基化修飾，具體機理還有待進(jìn)一步研究。

圖4 不同碳源培養(yǎng)的游離型菌株的生物量和酶活Fig. 4 Biomass and enzyme activity of strains with episomal vectors cultured with different carbon sources.(A) Biomass and enzymatic activity of strains with episomal vectors cultured with glucose as carbon source.(B) Biomass and enzymatic activity of strains with episomal vectors cultured with sucrose as carbon source.(C) Biomass and enzymatic activity of strains with episomal vectors cultured with mixed carbon sources.

GAP是組成型啟動子，因此能讓畢赤酵母生長的碳源均能促使酵母產(chǎn)酶。本研究顯示不同的碳源培養(yǎng)時單位生物量產(chǎn)酶的水平接近，因而菌株的生長能力對產(chǎn)酶水平有重要影響。一般認(rèn)為畢赤酵母基因組中缺少蔗糖酶基因，因此無法利用蔗糖[26]。但從本研究看，畢赤酵母在純蔗糖培養(yǎng)基中生長良好，但是相對于甘油和葡萄糖要緩慢得多，產(chǎn)酶水平也屬最低。原因可能源于甘油進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)通過磷酸化和脫氫兩步后直接進(jìn)入三羧酸循環(huán)途徑從而被快速利用[27]，但是蔗糖經(jīng)過轉(zhuǎn)運進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)還需要經(jīng)過蔗糖酶分解為葡萄糖和果糖后再加以利用，這種分解過程限制了蔗糖的快速利用?？紤]到純蔗糖不利于菌體生長，因此流加一定比例的甘油 (蔗糖︰甘油=1︰2) 以促進(jìn)菌株生長，此時酶活接近采用純葡萄糖為碳源時的產(chǎn)酶水平。根據(jù)工業(yè)級的甘油4 500元/t、葡萄糖2 600元/t、蔗糖2 300元/t的價格計算，以葡萄糖為碳源的生產(chǎn)成本最低。

[1]?elik E, ?al?k P. Production of recombinant proteins by yeast cells. Biotechnol Adv, 2012, 30(5):1108–1118.

[2]Rabert C, Weinacker D, Pessoa Jr A, et al.Recombinants proteins for industrial uses: utilization ofPichia pastorisexpression system. Braz J Microbiol, 2013, 44(2): 351–356.

[3]Chen DL, Tong X, Chen SW, et al. Heterologous expression and biochemical characterization of α-glucosidase fromAspergillus nigerbyPichia pastroris. J Agric Food Chem, 2010, 58(8):4819–4824.

[4]Zhu TC, Li Y. Recent development ofPichia pastorissystem: current status and future perspective. Chin J Biotech, 2015, 31(6): 929?938(in Chinese).朱泰承, 李寅. 畢赤酵母表達(dá)系統(tǒng)發(fā)展概況及趨勢. 生物工程學(xué)報, 2015, 31(6): 929?938.

[5]Xie JL, Zhou QW, Du P, et al. Use of different carbon sources in cultivation of recombinantPichia pastorisfor angiostatin production. Enzym Microb Technol, 2005, 36(2/3): 210–216.

[6]Lu YC, Jiang L. The strategies for efficient expression of recombinant protein inPichia pastoris.Prog Microbiol Immunol, 2013, 41(1): 70–76 (in Chinese).陸永超. 畢赤酵母高效表達(dá)策略概述. 微生物學(xué)免疫學(xué)進(jìn)展, 2013, 41(1): 70–76.

[7]Waterham HR, Digan ME, Koutz PJ, et al. Isolation of thePichia pastoris, glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase gene and regulation and use of its promoter. Gene, 1997, 186(1): 37–44 .

[8]Jin XM, Ma YB. Advances inPichia pastorispromoters used for heterogeneous gene expression. J Microbiol, 2015(3): 71–74 (in Chinese).金曉媚, 馬雁冰. 用于異源基因表達(dá)的畢赤酵母啟動子研究進(jìn)展. 微生物學(xué)雜志, 2015(3): 71–74.

[9]Clare JJ, Rayment FB, Ballantine SP, et al.High-level expression of tetanus toxin fragment C inPichia pastorisstrains containing multiple tandem integrations of the gene. Bio/Technology, 1991, 9(5):455–460.

[10]Marx H, Mecklenbr?uker A, Gasser B, et al. Directed gene copy number amplification inPichia pastoris,by vector integration into the ribosomal DNA locus.FEMS Yeast Res, 2009, 9(8): 1260–1270.

[11]Lee TS, Krupa RA, Zhang FZ, et al. BglBrick vectors and datasheets: a synthetic biology platform for gene expression. J Biolog Eng, 2011, 5(1): 12.

[12]Zhu TC, Guo MJ, Sun C, et al. A systematical investigation on the genetic stability of multi-copyPichia pastorisstrains. Biotechnol Lett, 2009, 31(5):679–684.

[13]Zhu T, Guo M, Tang Z, et al. Efficient generation of multi-copy strains for optimizing secretory expression of porcine insulin precursor in yeastPichia pastoris. J Appl Microbiol, 2009, 107(3):954–963.

[14]Dekker RFH, Richards GN. Hemicellulases: their occurrence, purification, properties, and mode of action. Adv Carbohyd Chem Biochem, 1976, 32:277–352.

[15]Lu P. Construction, optimization and characterization of bifunctional β-glucanase-xyanase and β-glucanase-phytase fusions[D]. Hangzhou:Zhejiang University, 2008 (in Chinese).陸平. 雙功能β-葡聚糖酶-木聚糖酶與β-葡聚糖酶-植酸酶融合酶的優(yōu)化構(gòu)建及其酶學(xué)特性分析[D].杭州: 浙江大學(xué), 2008.

[16]Badhan AK, Chadha BS, Kaur J, et al. Production of multiple xylanolytic and cellulolytic enzymes by thermophilic fungusMyceliophthorasp. IMI 387099.Bio Technol, 2007, 98(3): 504–510.

[17]Collins T, Gerday C, Feller G. Xylanases, xylanase families and extremophilic xylanases. FEMS Microbiol Rev, 2005, 29(1): 3–23.

[18]Henrissat B, Bairoch A. New families in the classification of glycosyl hydrolases based on amino acid sequence similarities. Biochem J, 1993, 293(3):781–788.

[19]Zhang QL. The application of neutral xylanase in food[D]. Wuxi: Jiangnan University, 2005 (in Chinese).張勤良. 中性木聚糖酶在食品中的應(yīng)用研究[D].無錫: 江南大學(xué), 2005.

[20]Beg Q, Kapoor M, Mahajan L, et al. Microbial xylanases and their industrial applications: a review.Applied Microbiol Biotechnol, 2001, 56(3/4):326–338.

[21]Gilkes NR, Henrissat B, Kilburn DG, et al. Domains in microbial beta-1,4-glycanases: sequence conservation, function, and enzyme families.Microbiol Rev, 1991, 55(2): 303–315.

[22]Petit-Benvengnen MD, Saulnier L, Rouau X.Solubilization of arabinoxylans from isolated water-unextractable pentosans and wheat flour doughs by cell-wall-degrading enzymes. Cereal Chem, 1998, 75(4): 551–556.

[23]Xu Y, Wu J, Zheng KX, et al. A xylanase fromStreptomycessp. FA1: heterologous expression,characterization, and its application in Chinese steamed bread. J Indust Microbiol Biotechnol, 2016,43(5): 663–670.

[24]Zhang HM, Li JF, Wu MC, et al. Expression of a thermostable xylanase gene inPichia pastorisand its enzymatic characterization. J Food Sci Biotechnol,2013, 32(2): 124–128 (in Chinese).張慧敏, 李劍芳, 鄔敏辰, 等. 耐熱木聚糖酶基因在畢赤酵母中的表達(dá)及酶學(xué)性質(zhì). 食品與生物技術(shù)學(xué)報, 2013, 32(2): 124–128.

[25]Camattari A, Goh A, Lian YY, et al. Characterization of a panARS-based episomal vector in the methylotrophic yeastPichia pastoris, for recombinant protein production and synthetic biology applications. Microb Cell Facto, 2016, 15(1):139.

[26]Huang ZW, Yi XM, Zeng LQ, et al. Construction of an engineeringPichia pastorisstrain that utilizes sucrose. Sugar Canes, 2012(3): 53–55 (in Chinese).黃曾慰, 蟻細(xì)苗, 曾練強, 等. 蔗糖利用型畢赤酵母工程菌的構(gòu)建. 甘蔗糖業(yè), 2012(3): 53–55.

[27]Chen XZ, Wang ZX, Zhuge J. Progress in glycerol metabolism and its physiological function in yeast cells. China Biotechnol, 2010, 30(5): 140–148 (in Chinese).陳獻(xiàn)忠, 王正祥, 諸葛健. 酵母細(xì)胞甘油代謝與生理功能研究進(jìn)展. 中國生物工程雜志, 2010, 30(5):140–148.