馬建蘋，魏永威，李善家，郭濤，晉玲

1蘭州理工大學(xué)生命科學(xué)與工程學(xué)院，蘭州730050；2甘肅省中藏藥篩選評價及深加工重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，蘭州理工大學(xué)，蘭州 730050；3甘肅中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，蘭州730000

基金項目：甘肅省自然科學(xué)基金（No.1606RJZA207）

藿香（Agastache rugosa）唇形科藿香屬多年生草本植物，是我國常用的芳香化濕類中藥，全草入藥，有止嘔吐，治霍亂腹痛，驅(qū)逐腸胃充氣，清暑等功效；果可作香料，葉與莖均富含揮發(fā)性芳香油，有濃郁的香味，是芳香化濕類中藥[1]?，F(xiàn)代藥理學(xué)研究表明藿香具有抗炎、抗菌等作用[2]。藿香全草中所含有的揮發(fā)油成分能夠促進(jìn)胃腸道蠕動，分泌胃液，促進(jìn)人體對食物的吸收。還有擴(kuò)張血管，促進(jìn)排汗，能夠有效緩解因排汗不利所引起的慢性疾病。近年來，藥用植物內(nèi)生真菌的研究已逐漸受到人們的廣泛關(guān)注，藿香主要是利用栽培技術(shù)提供藥用資源，目前國內(nèi)外關(guān)于藿香內(nèi)生菌的研究鮮見報道，本實(shí)驗(yàn)以藿香的內(nèi)生真菌進(jìn)行了研究。通過對藿香莖部位內(nèi)生真菌的分離純化，確定莖部位內(nèi)生真菌的種類和數(shù)目，用形態(tài)學(xué)手段對所分離的菌株進(jìn)行初步鑒定。并且對分離得到的所有內(nèi)生真菌進(jìn)行發(fā)酵，所得發(fā)酵產(chǎn)物進(jìn)行進(jìn)一步抗氧化活性測定，篩選出活性較好的菌株，為開發(fā)潛在的抗氧化劑提供理論基礎(chǔ)。

1.材料及儀器

1.1 材料與儀器

植物采集于甘肅省蘭州市石佛溝，經(jīng)甘肅中醫(yī)藥大學(xué)晉玲教授鑒定為藿香Agastache rugosa 。超凈工作臺、光學(xué)顯微鏡、恒溫振蕩培養(yǎng)箱、高壓滅菌鍋等常用儀器；實(shí)驗(yàn)所用藥品試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.2培養(yǎng)基配制 馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基(PDA)：去皮馬鈴薯200g，煮沸30min，8層紗布過濾，加入葡萄糖20g，定容至1000mL，然后加入1.5 % ～ 2 %的瓊脂。

馬鈴薯葡萄糖培養(yǎng)基(PDB)：去皮馬鈴薯200g，煮沸30min，8層紗布過濾，加入葡萄糖20g，定容至1000mL，121℃滅菌30min，待冷卻以后分別加入200μL 100μg/mL的青霉素和硫酸鏈霉素。

2.方法

2.1 內(nèi)生真菌的分離

組織分離法：取干燥洗凈的藿香莖，用解剖刀將藿香莖切成0.5cm×0.5cm×0.5cm小塊。在無菌條件下用75%乙醇、0.1%升汞消毒，每次用消毒劑消毒后都用無菌水沖洗3次，放在無菌的濾紙上吸干。用無菌的鑷子將材料的橫切面接入PDA培養(yǎng)基，以最后1次表面消毒沖洗后的無菌水作為參照，28℃恒溫培養(yǎng)3～7d。待內(nèi)生真菌長出后，觀察菌落形態(tài)特征，重復(fù)畫線純化[3]。

2.2 內(nèi)生真菌的初步鑒定

插片法：將內(nèi)生真菌接種到平板上，插上滅菌的蓋玻片，28℃培養(yǎng)，生長完全后放于載玻片上經(jīng)過棉蘭染色后，在光學(xué)顯微鏡下觀察菌落、菌絲體、孢子形態(tài)[4]。根據(jù)《真菌鑒定手冊》 初步鑒定。

2.3 內(nèi)生真菌次級代謝產(chǎn)物DPPH·自由基清除活性測定

將純化好的內(nèi)生真菌適量接種于PDB培養(yǎng)基，28℃、120rpm培養(yǎng)7d。分離菌絲體和發(fā)酵液，發(fā)酵液用乙酸乙酯和正丁醇分別萃取3次，合并、減壓蒸干，得到乙酸乙酯和正丁醇萃取部位；菌絲體冷凍干燥后用乙醇加熱回流提取2h，減壓蒸干，得到菌絲體乙醇提取部位。

在試管中分別加入2mL 0.025mg/mL 的DPPH·乙醇溶液和2mL 0.1mg/mL樣品溶液，避光反應(yīng)30min，用無水乙醇做參比溶液，在517nm處測定吸光度A樣品。為了排除乙醇和水對實(shí)驗(yàn)結(jié)果的影響，用水和乙醇作為陰性對照，Vc水溶液作為陽性對照[8-9]。每個樣品平行做兩次，計算平均值。

式中：A樣品-加入樣液后DPPH·乙醇溶液的吸光度；A對照-無水乙醇和樣液混合后的吸光度；A空白-未加樣液的DPPH·乙醇溶液的吸光度。

3.結(jié)果

3.1 內(nèi)生真菌的分離和初步鑒定

從藿香莖中共分離出8株內(nèi)生真菌，初步鑒定出7株，分別是HX-J1為短梗霉屬(Aureobasidium sp.)，HXJ3、HX-J4為交鏈孢菌屬(Alternaria sp.)，HX-J2為葡柄霉屬(Stemphyliumsp.)，HX-J6、HX-J7為刺盤孢菌屬(Colletotrichumsp.)，HX-J8為棒孢霉屬(Corynesporasp.)其中HX-J5未鑒定出結(jié)果。

表1 內(nèi)生真菌菌株編號及初步形態(tài)學(xué)觀察

3.2 內(nèi)生真菌次級代謝產(chǎn)物對DPPH·自由基的清除能力

DPPH· (2,2-二苯代苦味肼基) 是一種穩(wěn)定的自由基，能與乙醇結(jié)合形成深紫色溶液，在517 nm處有強(qiáng)吸收，如果有電子配對，則吸收減弱或消失，其褪色程度與電子數(shù)成量化關(guān)系，因此用分光光度計進(jìn)行定量分析。吸光度值越小，清除率越大，樣品DPPH·自由基清除活性越強(qiáng)[6]。

通過測定DPPH·自由基的清除活性，結(jié)果表明：樣品對DPPH·自由基均有不同程度的清除活性，清除率超過80%的有HX-J5、HX-J6、HX-J7的乙酸乙酯部位，其中HX-J7的乙酸乙酯部位對DPPH·自由基清除活性較強(qiáng)，達(dá)到97.44%，與陽性對照Vc（97.80%）的活性相當(dāng)；HX-J3的正丁醇部位對DPPH·自由基清除活性達(dá)到54.50%；乙醇提取部位以及水部位清除率均低于50%，因此活性較低。

圖1.藿香內(nèi)生真菌次級代謝產(chǎn)物清除DPPH·自由基活性測定結(jié)果

4.結(jié)論與討論

本實(shí)驗(yàn)從藿香植物的莖中根據(jù)菌落形態(tài)特征的不同共分離得到8株內(nèi)生真菌，經(jīng)過形態(tài)學(xué)初步鑒定7株屬于2綱、2目、4科、5屬，分別是HX-J1為短梗霉屬(Aureobasidiumsp.)、HX-J3、HX-J4為交鏈孢菌屬(Alternariasp.)、 HX-J2為葡柄霉屬(Stemphyliumsp.)、HX-J6、HX-J7為刺盤孢菌屬(Colletotrichumsp.)、HX-J8為棒孢霉屬(Corynesporasp.)其中HX-J5未鑒定出結(jié)果。藿香內(nèi)生真菌種類豐富，各類群的數(shù)量繁多，主要以擬莖點(diǎn)霉屬 、刺盤孢屬和鐮刀菌屬為優(yōu)勢菌株，但同時也分離出彎孢屬、黑孢屬、曲霉素等具有代表性菌屬。因此人們在尋找不同培養(yǎng)基的同時優(yōu)化分離技術(shù)，不斷完善研究方法。實(shí)驗(yàn)由于只運(yùn)用馬鈴薯葡萄糖培養(yǎng)基，所以得到的內(nèi)生真菌數(shù)量與種類有限，組織中分離的菌株種屬比較局限，為分離出更加豐富的內(nèi)生真菌種類，顯示植物內(nèi)生真菌的多樣性，后期將繼續(xù)完善內(nèi)生真菌分離技術(shù)，輔以其他真菌培養(yǎng)基和消毒方法，以期獲得更多的內(nèi)生真菌。

本研究采用DPPH·自由基清除活性試驗(yàn)測定藿香內(nèi)生真菌次級代謝產(chǎn)物的抗氧化活性，結(jié)果表明次級代謝產(chǎn)物中乙酸乙酯部位表現(xiàn)出相對較好的活性，尤其HX-J7的清除活性優(yōu)于其他菌株。為進(jìn)一步分離純化活性次生代謝產(chǎn)物及其生物活性評價提供參考和幫助。