麥麥提依明·托合提　文國道　唐超　李俊漾　胡躍兵　馬馳原*

(1新疆維吾爾自治區(qū)人民醫(yī)院神經(jīng)外科，新疆 烏魯木齊 830001; 2南京大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬金陵醫(yī)院神經(jīng)外科, 江蘇 南京 210002)

垂體腺瘤(pituitary adenomas, PAs)是最常見的顱腦腫瘤之一，約占全部顱腦腫瘤的10%[1]。絕大多數(shù)垂體瘤被認為是良性腫瘤，然而部分腫瘤可以侵襲鄰近結(jié)構(gòu)如蝶竇、海綿竇，甚至是腦組織，不但引起相應(yīng)的臨床表現(xiàn)，更使垂體腺瘤的外科治療加倍困難，故垂體腺瘤的早期診治極其重要。本部分實驗主要研究人類前提度蛋白2(anterior gradient 2, AGR2)在垂體腺瘤組織中的表達和分布；評價AGR2與垂體腺瘤侵襲性的關(guān)系。

材料與方法

一、病例資料的收集

收集2013年5月至2014年7月在我院神經(jīng)外科經(jīng)手術(shù)切除的垂體腺瘤新鮮標本。所有標本均經(jīng)過本院病理科確診為垂體腺瘤。標本分成兩份，一份浸泡在4%多聚甲醛中，另一份經(jīng)生理鹽水沖洗后立即放入-80 ℃超低溫冰箱保存。

腫瘤標本入選標準：①病理確診為垂體腺瘤者；②發(fā)病后隨訪時間超過兩年者；③影像學(xué)能明確侵襲性或非侵襲性者；④單一分泌類型的垂體腺瘤者。腫瘤標本排除標準：①垂體腺瘤卒中或者囊變者；②發(fā)病后隨訪時間低于兩年者；③影像學(xué)不能明確侵襲性或非侵襲性者；④診斷為混合型垂體腺瘤者；⑤標本較小無法進行檢測者。

所收集垂體腺瘤組織標本共117例。其中無功能性(non-functioning, NF)腺瘤組織56例，生長激素(growth hormone, GH)腺瘤組織24例，泌乳素(prolactin, PRL)腺瘤組織24例，促性腺激素(follicle stimulating hormone, FSH)腺瘤組織8例，促腎上腺皮質(zhì)激(adenocorticotropic hormone, ACTH)腺瘤組織5例。根據(jù)垂體腺瘤Hardy分類法和Knosp分類法將垂體腺瘤分為侵襲性垂體腺瘤和非侵襲性垂體腺瘤[2]。其中侵襲性垂體腺瘤70例，非侵襲性垂體腺瘤47例。

二、方法與試劑

1.免疫組化染色：將新鮮腫瘤組織常規(guī)石蠟包埋后用切片機連續(xù)切片，厚度為5 μm，并按免疫組織化學(xué)染色步驟對其進行染色，免疫組化用常規(guī)的SABC法，抗AGR2抗體(稀釋比例為1/400)來自美國CST公司。染色強度分為0(陰性)，1(弱陽性)，2(中度陽性)，3(強陽性)。根據(jù)陽性范圍占整個切片的百分比將染色范圍分為0(0%)，1(1%～25%)，2(26%～50%)，3(51%～75%)，4(76%～100%)。每張切片染色強度的分值加染色范圍的分值為該張切片的總分(0～7分)?？偡执笥?分被認為是陽性，其中2～3分為低表達，大于3分為高表達。

2.免疫熒光染色：將新鮮組織常規(guī)石蠟包埋后用切片機連續(xù)切片，厚度為5 μm，并按免疫熒光染色步驟對其進行染色，其中抗AGR2抗體(稀釋比例為1/400)來自美國CST公司。最后用熒光顯微鏡鏡檢拍照并采集圖像。

3.免疫印跡試驗(Western blot)檢測法：將按照Western blot分離膠和濃縮膠的配置方案(上海碧云天)配置分離膠和濃縮膠，其中分離膠濃度為12%，濃縮膠的濃度為5%，將按照蛋白提取試劑盒(上海碧云天)說明書提取的蛋白放入加樣孔并按說明書依次完成相關(guān)步驟，最后采用Image J圖像分析軟件分析條帶上目標分子的平均灰度值。

三、統(tǒng)計學(xué)分析

采用SPSS 18.0軟件進行統(tǒng)計學(xué)分析。用卡方檢驗比較AGR2在侵襲與非侵襲性垂體腺瘤的表達差異。AGR2表達與臨床參數(shù)的關(guān)系使用卡方檢驗或Fisher精確檢驗法。P<0.05時認為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

圖1垂體腺瘤組織免疫組化染色(×200)

Fig 1Expression of AGR2 in PAs(×200)

A: High expression of AGR2 (++); B: Low expression of AGR2 (+); C: AGR2 negative. AGR2 was mainly located in the membrane and cytoplasm. The results showed that AGR2 expression could be highly expressed in the non-invasive PAs (A) and it was hardly observed in the invasive PAs (C).

Bar=10 μm.

結(jié)　　果

一、AGR2在垂體腺瘤組織中的表達

垂體腺瘤組織AGR2免疫組化染色結(jié)果如圖1所示。在117例組織標本中，共60例組織標本AGR2表達陽性，陽性率為51.3%。不同分泌類型的垂體腺瘤中ACTH腺瘤陽性率最高，為80.0%(4例)，其次分別為FSH腺瘤(75.0% 6例)、GH腺瘤(62.5% 15例)、NF腺瘤(44.6% 25例)，陽性率最低為PRL腺瘤(41.7% 10例)。AGR2在垂體腺瘤不同分泌類型中的表達無顯著統(tǒng)計學(xué)差異(χ2=6.537,P=0.162>0.05)。

圖2顯示對垂體腺瘤不同亞型的Western blot結(jié)果。在垂體腺瘤不同亞型中AGR2蛋白表達陽性率無顯著差異，在不同分泌類型的垂體腺瘤組織中均有不同水平AGR2蛋白表達。

二、AGR2在垂體腺瘤組織細胞中的分布

圖3顯示垂體腺瘤免疫熒光染色結(jié)果。結(jié)果提示：在垂體腺瘤組織AGR2免疫熒光染色中，AGR2(綠色)與4', 6-二脒基-2-苯基吲哚(4', 6-diamidino- 2-phenylindole DAPI)(藍色)幾乎無重疊，表明在垂體腺瘤細胞中，AGR2蛋白定位胞漿和胞膜中，與免疫組化染色結(jié)果相一致。

圖2垂體腺瘤組織不同亞型的AGR2的表達

Fig 2The expression of AGR2 in different PAs subtypes detected by Western blot

PRL: Prolactin-secreting PAs; GH: Growth hormone secreting PAs; ACTH: Adenocorticotropic hormone secreting PAs; FSH: Follicle stimulating hormone secreting PAs; NF: Non-functioning PAs.

β-actin was served as loading control. S1 represents Sample 1 and S2 represents Sample 2.

三、垂體腺瘤中AGR2的表達與其臨床特征的關(guān)系

垂體腺瘤組織中AGR2的表達與各臨床因素的關(guān)系如表1所示。結(jié)果所示，垂體腺瘤中AGR2的表達水平高低僅與腫瘤的侵襲性有顯著相關(guān)(P<0.001)，與患者性別、年齡、腫瘤是否復(fù)發(fā)及腫瘤的大小無顯著相關(guān)(P>0.05)，在大多數(shù)侵襲性垂體腺瘤組織中AGR2表達陰性，而在大多數(shù)非侵襲性垂體腺瘤組織中AGR2表達陽性。垂體腺瘤中AGR2的表達水平高低與。對垂體腺瘤組織的Western blot結(jié)果也驗證了這一結(jié)果(圖4)。

表1垂體腺瘤患者臨床病例特征與AGR2表達的關(guān)系 [n(%)]

Tab 1Association between AGR2 expression and clinical pathological characteristics from patients with PAs [n(%)]

ParameternAGR2-+ Cases11757(48.7)60(51.3) Male65(55.5)32(27.4)33(28.1) Female52(44.5)25(21.4)27(23.1) Age (years) ≤5067(57.3)30(25.6)37(31.7) >5050(42.7)27(23.1)23(19.6) Invasive Yes70(59.8)46(39.3)24(20.5)a No47(40.2)11(9.4)36(30.8) Recurrence Yes12(10.3)7(6.0)5(4.3) No105(89.7)50(42.7)55(47.0) Tumor size ≤10 mm13(11.1)4(3.4)9(7.7) >10 mm104(88.9)53(45.3)51(43.6)

aP<0.001,vsnon-invasive PAs group.

圖3垂體腺瘤組織免疫熒光染色(×400)

Fig 3Immunohistofluorescence staining for expression and distribution of AGR2 in PAs (×400)

A1, B1：Immunohistofluorescent staining of AGR2 (green); A2, B2: The counterstained images of nucleus with DAPI (blue); A3, B3: The merged images of AGR2 (green) and DAPI (blue).

AGR2 was mainly located in the membrane and cytoplasm. The number of AGR2-positive cells was expressed as percentage of total cells. It showed that AGR2 expression could be highly expressed in the non-invasive PAs (A1～A3), and it was hardly observed in the invasive PAs (B1～B3).

Bar=20 μm.

圖4垂體腺瘤組織AGR2的表達與腫瘤侵襲性的關(guān)系

Fig 4The expression of AGR2 in invasive or non-invasive PAs

討　　論

垂體腺瘤以其腫瘤生物學(xué)特性可分為非侵襲性垂體腺瘤、侵襲性垂體腺瘤以及垂體腺癌。其中，非侵襲性微腺瘤由于腫瘤體積小、缺乏特異性臨床表現(xiàn)，早期難以發(fā)現(xiàn)。侵襲性垂體腺瘤約占垂體腺瘤30%～55%，它具有高增殖活性、高侵襲能力、術(shù)后易復(fù)發(fā)、臨床治愈率低等特點[3]。侵襲性垂體腺瘤被發(fā)現(xiàn)時腫瘤體積多已巨大，并常侵犯海綿竇等多個腫瘤周圍重要結(jié)構(gòu)，因此外科手術(shù)切除率和病情緩解率遠低于非侵襲性垂體腺瘤[4]。因此，垂體腺瘤的早發(fā)現(xiàn)、早診斷、早治療至關(guān)重要。

AGR2是源于非洲爪蟾蛋白XAG2(Xenopus anterior gradient 2)的人型同系物，它在爪蟾胚胎的生理發(fā)育生長過程中發(fā)揮了重要的作用[5]。目前，關(guān)于AGR2在對人體的生理作用尚不清楚。AGR2 主要和激素依賴性腫瘤相關(guān)，例如乳腺癌、胰腺癌、肺癌、前列腺癌等。AGR2 在一些腫瘤中表現(xiàn)出了明顯的致癌基因的相關(guān)特征，例如促進細胞增殖，促進腫瘤耐藥等，它還能促進腫瘤細胞的遷移[6-8]。然而，在肝癌、結(jié)直腸癌以及鼻咽癌中，AGR2 表達下降被認為與患者較差的預(yù)后有密切的關(guān)系[9-11]。所以AGR2 在不同的腫瘤中的表達有很大的差異，其在不同腫瘤發(fā)生發(fā)展的過程中的作用也有很大的差異。

文獻報道，AGR2的表達缺失在腸息肉患者腸組織異常增生到癌變進展過程中起重要作用[10]。Riener等發(fā)現(xiàn)AGR2在結(jié)腸癌細胞系以及結(jié)腸癌組織標本中的低表達可能與腫瘤低分化及轉(zhuǎn)移密切相關(guān)[11]。亦有人認為AGR2可能是原發(fā)性結(jié)直腸癌預(yù)后判斷的獨立指標之一。在本研結(jié)果表明，在117例不同分泌類型的垂體腺瘤組織中，AGR2陽性率僅為51.3%。雖然不同分泌類型垂體腺瘤組織中AGR2的表達略有不同，其表達率從高到低分別為ACTH腺瘤(80.0%)，F(xiàn)SH腺瘤(75.0%)，GH腺瘤(62.5%)，NF腺瘤(44.6%)以及PRL腺瘤(41.7%)，AGR2在不同分泌類型的垂體腺瘤組織中的表達在統(tǒng)計學(xué)上無顯著差異(P>0.05)。我們還分析了垂體腺瘤相關(guān)臨床特征與腫瘤組織中AGR2表達水平的關(guān)系，結(jié)果表明腫瘤侵襲性與AGR2的表達水平顯著相關(guān)(P<0.001)。在大多數(shù)侵襲性垂體腺瘤組織中AGR2表達陰性，而在大多數(shù)非侵襲性垂體腺瘤組織中AGR2的表達陽性，這與Riener等人的實驗結(jié)果一致的。關(guān)于AGR2在垂體腺瘤組織致侵襲性或者癌變中的作用機制可能需要更多的體外和體內(nèi)實驗來揭示。

本研究中，我們檢測了117例垂體腺瘤組織標中AGR2蛋白表達水平。結(jié)果表明，AGR2在非侵襲性垂體腺瘤組織中的表達水平顯著高于侵襲性者。AGR2不僅能作為研究垂體腺瘤侵襲性的靶標，還能作為垂體腺瘤診斷和預(yù)后評價的潛在生物學(xué)標志物。