，，，， ，，*

(1.南華大學(xué)附屬南華醫(yī)院消化內(nèi)科，湖南 衡陽(yáng)421001；2.南華大學(xué)醫(yī)學(xué)院轉(zhuǎn)化醫(yī)學(xué)研究室；3.南華大學(xué)附屬南華醫(yī)院腫瘤內(nèi)科)

肝癌是全球最常見(jiàn)的惡性腫瘤之一，發(fā)病率和死亡率均高，因此如何提高肝癌患者的早期診治率成為近年來(lái)研究的熱點(diǎn)和難點(diǎn)。MicroRNA是一種長(zhǎng)度約為19～23個(gè)核苷酸的單鏈RNA，參與人體的生理病理過(guò)程[1]，在惡性腫瘤的發(fā)展中扮演著抑癌基因或致癌基因的角色，有助于癌癥的診斷。目前有許多關(guān)于研究microRNA在各領(lǐng)域方面的報(bào)道[2-4]。例如microRNA-423可增強(qiáng)肝癌細(xì)胞的侵襲力，在肝癌細(xì)胞中與BRSM1的表達(dá)呈負(fù)相關(guān)，有可能作為肝癌藥物治療的潛在靶點(diǎn)[5]。但是目前關(guān)于肝癌與miR-4270的關(guān)系報(bào)道幾乎沒(méi)有，本文主要先通過(guò)基因芯片初篩選取miR-4270作為研究對(duì)象，以血漿及組織標(biāo)本為生物樣本，檢測(cè)miR-4270表達(dá)量，并分析其與肝癌診斷的相關(guān)性，從而為miR-4270可能成為潛在的腫瘤生物學(xué)標(biāo)志物提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 資料與方法

1.1病例選擇血漿樣本選取2015年6月～2016年12月在南華大學(xué)附屬第一醫(yī)院及附屬南華醫(yī)院住院治療的肝癌患者30例及門(mén)診健康體檢者30例。組織標(biāo)本選擇2014年1月～2016年12月在中南大學(xué)湘雅二醫(yī)院確診的肝癌患者癌組織40例及癌旁組織20例。選擇標(biāo)準(zhǔn)：①經(jīng)過(guò)彩超、腹部增強(qiáng)CT、AFP等臨床資料，結(jié)合患者病史和癥狀，并經(jīng)過(guò)病理組織切片結(jié)果確診為肝癌，且原發(fā)灶為肝臟，排除其他部位惡性腫瘤所導(dǎo)致的轉(zhuǎn)移性肝癌。②正常人血清為門(mén)診體檢患者，排除其他心、肺、腦、內(nèi)分泌等方面的疾病。③癌旁組織為通過(guò)組織活檢確診為肝癌患者的遠(yuǎn)癌旁組織切片。肝癌的癌組織及癌旁組織標(biāo)本于術(shù)中離體后1 h內(nèi)取樣，取樣后組織經(jīng)脫水、滲透，最后進(jìn)行石蠟包埋。④實(shí)驗(yàn)前均取得所有試驗(yàn)對(duì)象的知情同意。

1.2方法

1.2.1 血漿中總RNA的提取 離心血漿樣本，取上層液體200 μL，并加入1 000 μL的裂解液，嚴(yán)格按照miRNeasy Plasma試劑盒操作流程提取RNA。

1.2.2 血漿中cDNA的合成 將提取的血漿RNA取3 μL做模板，參照miScript II RT Kit試劑盒上操作流程，加入5×miScript HiSpec Buffer 4 μL、10×miScript Nucleics Mix 2 μL、RNase-free water 9 μL、miScript Reverse Transcriptase Mix 2 μL，組成20 μL的反應(yīng)體系，逆轉(zhuǎn)錄得到cDNA。向完成逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)體系中，加入200 μL的RNase-free water(無(wú)酶水)稀釋?zhuān)簳r(shí)冷保存于-20 ℃中。

1.2.3 組織樣本總RNA的提取 溶解石蠟組織，利用miRNeasy FFPE kit(50)試劑，并嚴(yán)格按照試劑操作流程提取RNA。

1.2.4 組織樣本cDNA的合成 利用提取的組織RNA取3 μL做模板，參照miScript II RT Kit試劑盒上操作流程，加入試劑組成20 μL的反應(yīng)體系，逆轉(zhuǎn)錄得到cDNA，最后加入100 μL的RNase-free water(無(wú)酶水)稀釋?zhuān)簳r(shí)冷保存于-20 ℃中。

1.2.5 實(shí)時(shí)熒光定量PCR分析 利用逆轉(zhuǎn)錄得到的cDNA,使用熒光定量檢測(cè)儀試劑盒，嚴(yán)格按照操作流程，每個(gè)樣本做3個(gè)平行對(duì)照孔，行PCR檢測(cè)，每個(gè)樣本取平行孔的平均值進(jìn)行計(jì)算。本實(shí)驗(yàn)采用2-Δct表示目的基因的相對(duì)表達(dá)量，同時(shí)利用內(nèi)參進(jìn)行數(shù)據(jù)的標(biāo)準(zhǔn)化對(duì)照。

1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)分析統(tǒng)計(jì)學(xué)分析采用SPSS 18.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行。其中數(shù)據(jù)分析以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差，使用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)。可信區(qū)間為95%，P<0.05表示差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。兩個(gè)樣本之間的相關(guān)性比較先檢驗(yàn)是否服從正態(tài)分布，服從正態(tài)分布使用T檢驗(yàn)，不服從正態(tài)分布的兩組樣本采用非參數(shù)相關(guān)系數(shù)分析(Spearman Correlation),|r|<1，r>0為正相關(guān)，r<0負(fù)相關(guān)，r=0為零相關(guān)，P<0.05表示差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。應(yīng)用GraphPad Prism繪制柱狀圖和生存曲線(xiàn)圖。

2 結(jié) 果

2.1 miR-4270在血漿中的表達(dá)量30例肝癌患者血漿中的相對(duì)表達(dá)量為6.1±6.5，正常人血漿中miRNA-4270的相對(duì)表達(dá)量是2.7±1.7。miRNA-4270在肝癌患者血清中的表達(dá)量明顯高于正常人(P<0.05)。見(jiàn)圖1。

圖1 microRNA-4270在正常人和肝癌患者的血漿表達(dá)量與正常人比較，*P<0.05

2.2 miR-4270在組織中的表達(dá)量40例肝癌患者癌組織切片中的相對(duì)表達(dá)量為11.7±18.7，癌旁組織中miRNA-4270的相對(duì)表達(dá)量是1.0±1.2。miRNA-4270在肝癌患者組織中的表達(dá)量明顯高于癌旁組織(P<0.05)。見(jiàn)圖2。

圖2 miR-4270在肝癌組織及癌旁對(duì)照組織中的表達(dá)量與癌旁組織比較，*P<0.05

2.3 miR-4270表達(dá)量對(duì)原發(fā)性肝癌的診斷意義通過(guò)繪制ROC曲線(xiàn)(圖3、圖4)，可以得出，在血漿中，ROC曲線(xiàn)下面積為0.652，95%可信區(qū)間為0.508～0.796(P<0.05)，此時(shí)靈敏度和特異度均一般，靈敏度為63.3%，特異度為63.3%。在肝癌組織標(biāo)本中，ROC曲線(xiàn)下面積為0.828，95%可信區(qū)間為0.723～0.932(P<0.05)，此時(shí)靈敏度及特異度均稍高，靈敏度為80%，特異度為80%。提示miR-4270的檢測(cè)對(duì)肝癌的初步診斷具有重要的價(jià)值。

圖3 血漿中miRNA-4270相對(duì)表達(dá)量的ROC曲線(xiàn)分析

圖4 組織中miRNA-4270相對(duì)表達(dá)量的ROC曲線(xiàn)分析

2.4 miR-4270表達(dá)水平與臨床相關(guān)因素的關(guān)系分析通過(guò)統(tǒng)計(jì)分析發(fā)現(xiàn)，在年齡、性別、腫塊大小、腫瘤分期、AFP水平及病毒定量因素中，肝癌患者的miR-4270的相對(duì)表達(dá)量與患者臨床資料之間無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見(jiàn)表1、表2。

2.5 miR-4270表達(dá)水平與AFP的相關(guān)性分析根據(jù)SPSS 18.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析，miR-4270表達(dá)量與AFP含量不服從正態(tài)分布，故使用spearman相關(guān)分析，在血漿中，rs=0.64，P=0.736，在組織標(biāo)本中，rs=0.104，P=0.530，此時(shí)P值均大于0.05，說(shuō)明microRNA-4270表達(dá)量與AFP水平?jīng)]有相關(guān)性，可作為診斷肝癌的獨(dú)立診斷標(biāo)準(zhǔn)。

根據(jù)SPSS 18.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析，將肝癌患者AFP水平分為大于400 μg/L與小于400 μg/L,把AFP<400μg/L的患者與正常人患者相對(duì)比，AFP<400 μg/L的肝癌患者表達(dá)量高于正常人(P<0.05)。見(jiàn)表3、表4。

表1 血漿樣本中miRNA-4270表達(dá)量與肝癌臨床資料相關(guān)性分析

表2 組織樣本中miR-4270表達(dá)量與肝癌臨床資料相關(guān)性分析

表3 血漿中AFP<400 μg/L肝癌患者與正常人miR-4270相對(duì)表達(dá)量

表4 組織中AFP<400 μg/L肝癌患者與正常人miR-4270相對(duì)表達(dá)量

2.6 miR-4270表達(dá)量與肝癌患者預(yù)后關(guān)系通過(guò)電話(huà)及門(mén)診隨訪(fǎng)，將血漿標(biāo)本和癌組織標(biāo)本中肝癌患者的生存預(yù)后與miRNA-4270的表達(dá)量分別進(jìn)行了統(tǒng)計(jì)分析。同時(shí)，將miR-4270表達(dá)量根據(jù)平均值分為低表達(dá)組(表達(dá)量小于平均值)與高表達(dá)組(表達(dá)量大于平均值)，實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，無(wú)論在血漿中還是在癌組織中，miRNA-4270表達(dá)量越高的患者反而生存越短，表達(dá)量低者生存期越長(zhǎng)，P<0.05(圖5、圖6)。

圖5 血漿標(biāo)本肝癌患者miRNA生存期限圖

圖6 組織標(biāo)本肝癌患者miRNA生存期限

3 討 論

流行病學(xué)調(diào)查發(fā)現(xiàn)，肝癌的發(fā)病率和死亡率呈逐年上升趨勢(shì)，是危害人類(lèi)健康的重大疾病。傳統(tǒng)的治療包括早期的手術(shù)切除、酒精射頻消融、經(jīng)動(dòng)脈血管栓塞術(shù)[6]，有最新報(bào)道研究，磁熱療法、索拉非尼藥物化療法也逐漸用于肝癌的治療[7-8]。然而，肝癌起病隱匿，缺乏早期典型癥狀，臨床癥狀明顯者，病情大多已進(jìn)入中晚期，缺乏有效的治療方案，且晚期并發(fā)癥多，嚴(yán)重影響患者生活質(zhì)量，早期診斷發(fā)現(xiàn)對(duì)腫瘤患者很重要。在2017年中國(guó)《原發(fā)性肝癌診療規(guī)范》中，動(dòng)態(tài)增強(qiáng)CT及MRI、超聲影像、普美顯動(dòng)態(tài)增強(qiáng)MRI這四項(xiàng)檢查成為診斷肝癌的特殊手段，其中AFP更是作為一項(xiàng)常規(guī)篩查的重要指標(biāo)[9]。趙亞靜等[10]研究發(fā)現(xiàn)，血清AFU(a-L巖藻糖苷酶)較AFP敏感性更高，兩者聯(lián)合，更能提高診斷精準(zhǔn)率。

目前肝癌的致病作用尚未被完全闡明，但大量研究證明，與DNA的損傷、染色體的變異、抑癌基因的滅活與致癌基因的活化密不可分。MicroRNA是一類(lèi)非編碼單鏈 RNA，在人類(lèi)表達(dá)有近千條，主要通過(guò)與宿主mRNA(信使RNA)結(jié)合從而發(fā)揮生物學(xué)效應(yīng)。MicroRNA let-7 家族是最早發(fā)現(xiàn)的 microRNA 之一，作為腫瘤抑制基因，經(jīng)常在人類(lèi)各種惡性腫瘤中被滅活。相當(dāng)多的證據(jù)表明,microRNA let-7 表達(dá)下調(diào)可能與癌癥患者臨床療效不佳有關(guān)[11]。MicroRNA作為肝癌的調(diào)節(jié)因子，在肝癌的發(fā)生發(fā)展中起重要作用。研究顯示，這些microRNA大致可分為兩種類(lèi)型[12]，一種為“肝臟特異性表達(dá)”，是指僅在肝臟組織中呈異常性表達(dá)，如 miR-122，它是肝癌中最豐富和最特定的microRNA，在肝臟中表達(dá)為上調(diào)，主要通過(guò)調(diào)節(jié)目的基因來(lái)抑制肝細(xì)胞癌；另一種為“非肝臟特異性表達(dá)”,是指在多種細(xì)胞中均可出現(xiàn)異常表達(dá)，如最早發(fā)現(xiàn)的let-7 家族，在乳腺癌、肝癌、肺癌中均有表達(dá)異常[13]。

本研究實(shí)驗(yàn)前期進(jìn)行基因芯片初篩，考慮目前還沒(méi)有關(guān)于miRNA-4270和肝癌之間關(guān)系的研究報(bào)道，選取microRNA-4270作為目標(biāo)RNA。研究表明，無(wú)論是在血漿中還是組織中，肝癌患者miR-4270表達(dá)量較正常人均明顯上調(diào)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。同時(shí)ROC曲線(xiàn)分析表明miR-4270檢測(cè)對(duì)于原發(fā)性肝癌患者的敏感度和特異度均較高，可作為肝癌的輔助診斷之一。此外，本研究還發(fā)現(xiàn)miR-4270的表達(dá)量與患者臨床資料并無(wú)顯著相關(guān)性，但是，對(duì)于部分AFP<400 μg/L的肝癌患者中，miR-4270的表達(dá)量明顯高于正常人，這提示在肝癌早期階段或者對(duì)于那些 AFP<400 μg/L 的患者中，通過(guò)檢測(cè)血清中 miRNA-4270的表達(dá)量，可以發(fā)現(xiàn)潛在的肝癌風(fēng)險(xiǎn)。而且，生存曲線(xiàn)分析表明miR-4270高表達(dá)者反而有更短的生存期，更加驗(yàn)證了miR-4270可能作為致癌基因的存在。

綜合本研究證明，microRNA-4270表達(dá)水平與正常人相比明顯上調(diào)，統(tǒng)計(jì)上存在顯著性差異，而且，在對(duì)于早期AFP<400 μg/L的肝癌患者，miR-4270明顯升高，提示對(duì)肝癌早期鑒別診斷、病情監(jiān)測(cè)具有重要借鑒作用，為治療方案選擇提供科學(xué)依據(jù)。

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