，，

(南華大學(xué)附屬第一醫(yī)院泌尿外科，湖南 衡陽 421001)

關(guān)于腎癌增殖、侵襲和轉(zhuǎn)移的分子機(jī)制是當(dāng)今有關(guān)腫瘤發(fā)生、發(fā)展和治療研究的熱點(diǎn)之一[1]。COL6A1是一種重要的編碼細(xì)胞外基質(zhì)的基因, 其功能復(fù)雜，研究表明細(xì)胞外基質(zhì)在細(xì)胞增殖和凋亡的過程中起著不可或缺的作用，其表達(dá)水平與腫瘤轉(zhuǎn)移密切相關(guān)[2]。子宮頸癌、肺癌的相關(guān)研究表明COL6A1的表達(dá)增高，可以明顯提高腫瘤的侵襲能力和轉(zhuǎn)移概率[3]， COL6A1對腎癌增殖與侵襲的影響仍未知，且缺乏體外實(shí)驗(yàn)的研究，本文旨在通過體外細(xì)胞生物學(xué)觀察和探討抑制COL6A1的表達(dá)對腎癌細(xì)胞786-0增殖和侵襲的影響,為探討COL6A1對腎癌增殖侵襲的影響提供實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1材料腎癌786-0細(xì)胞株受贈于武漢協(xié)和醫(yī)院中心試驗(yàn)室，COL6A1抑制表達(dá)的SiRNA(small interfering RNA, siRNA)由上海吉凱公司使用Rational siRNA Design軟件及Blast設(shè)計(jì)和優(yōu)化合成。RPMI-1640培養(yǎng)基、標(biāo)準(zhǔn)胎牛血清、0.25%胰蛋白酶購自Hyclone公司，Opti-MEM減血清培養(yǎng)基購自于Gibco公司(美國)， LipofectamineTM2000購自Invitrogen公司(美國)，COL6A1蛋白抗體、β-actin總RNA提取試劑、逆轉(zhuǎn)錄試劑盒、實(shí)時熒光定量 PCR試劑盒購自武漢邁進(jìn)生物試劑有限公司，熒光實(shí)時定量PCR引物由武漢邁進(jìn)有限公司設(shè)計(jì)合成，MTT購自Promega公司，Transwell小室購自Corning公司。

1.2細(xì)胞培養(yǎng)腎癌786-0于含有10%胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)基中培養(yǎng)，本研究中所有細(xì)胞系皆在37 ℃、CO2體積分?jǐn)?shù)為5%的培養(yǎng)箱中常規(guī)培養(yǎng)，每2～3天用0.25%的胰蛋白酶消化、傳代，取對數(shù)期細(xì)胞用于實(shí)驗(yàn)。本實(shí)驗(yàn)將2條靶向COL6A1基因的特異性siRNA瞬時轉(zhuǎn)染786-0細(xì)胞，SiRNA序列見圖1，并篩選出對COL6A1表達(dá)抑制最有效的一條。轉(zhuǎn)染前取對數(shù)生長期786-0細(xì)胞,用含10%胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)液懸浮后,以2×105個/孔的密度接種于6孔板中。Lipofectamine2000用Opti-MEM預(yù)混后,靜置5 min, 將加入Opti-MEM稀釋后的COL6A1-siRNA和陰性對照的negtive-siRNA混勻,室溫靜置20 min，將混合物按分組加入含786-0細(xì)胞的6孔板中,置于37 ℃、5%CO2的細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng),48 h后收集細(xì)胞進(jìn)行后續(xù)試驗(yàn)。將未轉(zhuǎn)染SiRNA的786-0細(xì)胞作為空白對照組，轉(zhuǎn)染negtive-siRNA的細(xì)胞作為陰性對照組，以及轉(zhuǎn)染抑制表達(dá)siRNA的COL6A1-siRNA1組和COL6A1-siRNA2組，并通過檢測基因表達(dá)水平和蛋白表達(dá)水平，選擇COL6A1抑制效果最佳的SiRNA，轉(zhuǎn)染后作為COL6A1-siRNA組與陰性對照組和空白對照組一并進(jìn)行細(xì)胞增殖和侵襲實(shí)驗(yàn)。

1.3實(shí)時定量PCR(quantification real-timePCR，qRT-PCR) 檢測786-0細(xì)胞COL6A1中的表達(dá)收集處于對數(shù)生長期的4組細(xì)胞，按以下步驟操作：①按照TRIzol試劑說明提取總RNA，1%的瓊脂糖變性凝膠電泳檢測RNA的完整性，紫外分光光度計(jì)檢測RNA的純度和濃度；②按逆轉(zhuǎn)錄試劑盒逆轉(zhuǎn)錄得cDNA，反應(yīng)條件如下：70 ℃ 10 min、冰浴2 min、42 ℃ 60 min、70 ℃ 10 min；③qRT-PCR反應(yīng)參數(shù)設(shè)置：95 ℃20 s；95 ℃ 5 s，60 ℃ 20 s，72 ℃ 5 s，40個循環(huán)，每個樣品做3個平行管，每次實(shí)驗(yàn)至少重復(fù)3次；數(shù)據(jù)分析由定量PCR儀器OpticonMonitorTM Analysis software軟件自動完成，目的基因與內(nèi)參基因引物見表1。

表1 目的基因引物與SiRNA序列

圖1 COL6A1-SiRNA及其相應(yīng)mRNA抑制位點(diǎn)

1.4蛋白質(zhì)免疫印跡法檢測COL6A1蛋白表達(dá)取4組生長良好的細(xì)胞，根據(jù)BCA試劑盒說明書依次操作，測細(xì)胞總蛋白濃度，灌制SDS聚丙烯酰胺凝膠; 取40 μg的等量蛋白質(zhì)樣品與1×SDS凝膠加樣緩沖液按1∶1混合, 置10 ℃加熱3 min使蛋白質(zhì)變性，進(jìn)行SDS-PAGE膠電泳分離, 以15 V電轉(zhuǎn)移至PVDF膜;對照蛋白質(zhì)Marker將所需片斷剪下,5%脫脂奶粉封閉2 h; 加一抗, 37 ℃孵育12 h, PBS洗膜3次, 每次10 min; 加二抗, 37 ℃孵育2 h, PBS洗膜3次, 每次10 min; 辣根過氧化酶ECL法顯色,BIO-RAD Gel Doc XR凝膠成像系統(tǒng)采集結(jié)果，以β-actin作內(nèi)對照。

1.5噻唑藍(lán)(3-(4,5)-dimethylthiahiazo (-z-y1)-3,5-di-phenytetrazoliumromide，MTT)比色法檢測細(xì)胞增殖取生長良好的3組細(xì)胞，以5×104/孔接種于96孔板。分別于接種后的第1，2，3天每組細(xì)胞取5個孔，每孔加入20 μL MTT溶液(5 g/L)，37 ℃、體積分?jǐn)?shù)為5% CO2繼續(xù)培養(yǎng)4 h后棄掉各孔內(nèi)的培養(yǎng)基，每孔加入二甲基亞砜200 μL，低速振蕩10 min使結(jié)晶充分溶解，酶標(biāo)儀檢測490 nm波長的吸光度，每組設(shè)5個復(fù)孔，實(shí)驗(yàn)均重復(fù)3次。

1.6 Transwell小室侵襲實(shí)驗(yàn)取對數(shù)期生長的3組細(xì)胞，將 3組細(xì)胞將細(xì)胞密度調(diào)整為2.5×105/mL，向Transwell上室中加入400 μL，在下室的24孔板內(nèi)加入含20%FBS的RPMI-1640培養(yǎng)基600 μL， 24 h后，將小室取出，濕棉簽擦去上室細(xì)胞，PBS液洗3次，用-20 ℃預(yù)冷的甲醇固定細(xì)胞10 min，摒棄甲醇，PBS液洗3次后自然風(fēng)干，結(jié)晶紫染色后于光鏡下觀察，隨機(jī)選取中央及四周5個視野，計(jì)算穿膜細(xì)胞數(shù)，并求平均值，以穿膜細(xì)胞的數(shù)目代表786-0細(xì)胞的體外遷移能力。

2 結(jié) 果

2.1 COL6A1基因抑制降低腎癌786-0細(xì)胞COL6A1mRNA水平的表達(dá)熒光定量PCR實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示在COL6A1-SiRNA兩組細(xì)胞中， COL6A1 mRNA的表達(dá)較陰性對照組、空白對照細(xì)胞顯著降低(P<0.001)。而陰性對照組和空白對照細(xì)胞組之間COL6A1mRNA表達(dá)差異無顯著性意義(P>0.05，圖2)。其中以COL6A1-SiRNA2抑制效果最佳，綜上，COL6A1在腎癌786-0細(xì)胞中存在表達(dá)，并且通過SiRNA沉默技術(shù)可以成功使COL6A1基因mRNA的表達(dá)降低。

圖2 RNA干擾使COL6A1基因mRNA低表達(dá)的效果與空白對照組比較,*P<0.05

2.2 COL6A1抑制對腎癌786-0細(xì)胞COL6A1蛋白表達(dá)的影響Western blot顯示，陰性對照組和空白對照組細(xì)胞相比，COL6A1-SiRNA干擾使COL6A1蛋白表達(dá)顯著降低,其中以COL6A1-SiRNA2組蛋白表達(dá)量最低(圖3，P<0.05)，陰性對照組和空白對照組細(xì)胞相比則無明顯不同(圖3，P>0.05)。綜上COL6A1-SiRNA2顯著降低了目的基因在mRNA和蛋白水平的表達(dá)，以下MTT實(shí)驗(yàn)，transwell侵襲實(shí)驗(yàn)皆應(yīng)用COL6A1-SiRNA2組作為COL6A1-SiRNA組。

圖3 RNA干擾使COL6A1蛋白表達(dá)下調(diào)與空白對照組比較, *P<0.05

2.3 COL6A1低表達(dá)對腎癌786-0細(xì)胞增殖的影響MTT實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，在各個時間點(diǎn)，與空白對照組相比，陰性對照組無統(tǒng)計(jì)學(xué)差別(圖4，P>0.05)，COL6A1-SiRNA組細(xì)胞增殖能力明顯降低(圖4，P<0.05)。

2.4 COL6A1低表達(dá)對786-0細(xì)胞侵襲的影響與空白對照組786-0細(xì)胞的穿膜細(xì)胞數(shù)(222.6±14.2)和陰性對照組組穿膜細(xì)胞數(shù)(219.2±15.1，圖5)相比，COL6A1-SiRNA轉(zhuǎn)染組的穿膜細(xì)胞數(shù)(103.5±10.4)顯著減少(P<0.05)，而空白對照組與陰性對照組相比，但其穿膜細(xì)胞數(shù)間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05，圖5)。

圖4 MTT實(shí)驗(yàn)各組細(xì)胞增殖曲線與空白對照組比較, *P<0.05

圖5 transwell侵襲實(shí)驗(yàn)各組細(xì)胞穿膜細(xì)胞數(shù)A：為空白對照組；B：為陰性對照組；C：COL6A1-SiRNA組與空白對照組比較, *P<0.05

3 討 論

本文通過體外細(xì)胞生物學(xué)的研究發(fā)現(xiàn)COL6A1基因在腎786-0癌細(xì)胞中存在表達(dá)，抑制COL6A1表達(dá)可以抑制腫瘤細(xì)胞在體外的生長，顯著降低腫瘤細(xì)胞的侵襲能力，進(jìn)而表明COL6A1與腎癌的增殖轉(zhuǎn)移密切相關(guān)。

通過文獻(xiàn)研究發(fā)現(xiàn)，COL6A1是一種脊椎動物保守基因/蛋白，廣泛存在于所有連接組織中，編碼構(gòu)成了膠原蛋白Ⅵ α1鏈[3-4]。膠原蛋白Ⅵ是一種重要的細(xì)胞外基質(zhì)蛋白，它形成了細(xì)胞微絲網(wǎng)絡(luò)，細(xì)胞微絲網(wǎng)絡(luò)可以與細(xì)胞外基質(zhì)分子相互作用，給予細(xì)胞結(jié)構(gòu)上的支持，有研究表明膠原蛋白Ⅵ可以觸發(fā)與細(xì)胞凋亡、炎癥、腫瘤進(jìn)展相關(guān)的信號通路[5-6]。

最近有研究表明COL6A1在多種腫瘤組織中存在特異性的高表達(dá)，并與腫瘤進(jìn)展相關(guān)，并影響著腫瘤患者的預(yù)后[4]。最近的臨床研究發(fā)現(xiàn)在惡性星形細(xì)胞瘤中發(fā)現(xiàn)了COL6A1的高表達(dá)[7]。在有關(guān)分泌組蛋白的研究中發(fā)現(xiàn)，COL6A1是一種新發(fā)現(xiàn)的介導(dǎo)腫瘤骨轉(zhuǎn)移的分子產(chǎn)物[8]?；仡櫺匝芯堪l(fā)現(xiàn)COL6A1的高表達(dá)與肺癌不良預(yù)后存在關(guān)系[9]。COL6A1編碼的細(xì)胞外基質(zhì)不僅在細(xì)胞增生和凋亡的過程中作用關(guān)鍵，并且在腫瘤的治療過程中，可通過減少化療藥物與瘤灶的接觸，降低機(jī)體對抗腫瘤藥物的應(yīng)答，并形成防止腫瘤與藥物接觸的物理屏障，促進(jìn)耐藥現(xiàn)象的發(fā)生[3]。

文獻(xiàn)研究發(fā)現(xiàn)， COL6A1在腫瘤組織的上調(diào)表達(dá)與TGF-β/Smad信號傳導(dǎo)系統(tǒng)有關(guān)。在人類上皮成纖維細(xì)胞中，COL6A1被認(rèn)為是TGF-β/Smad信號傳導(dǎo)系統(tǒng)的標(biāo)靶，隱匿在基質(zhì)細(xì)胞中的癌細(xì)胞TGF-β系統(tǒng)作用活躍，可促進(jìn)癌細(xì)胞的增殖，而這些細(xì)胞的增殖又反過來增加TGF-β的分泌[10]。而 TGF-β的過量表達(dá)可以使機(jī)體免疫反應(yīng)受到抑制，促進(jìn)血管的生成，最終有利于腫瘤的侵襲[11]。因此，COL6A1 基因的表達(dá)上調(diào)，可能是TGF-β激活的結(jié)果，從而提示腫瘤病人預(yù)后不良[12]。

近些年來的研究發(fā)現(xiàn)，基因靶向治療可能是治療腎透明細(xì)胞癌新的研究熱點(diǎn)[13]，本項(xiàng)研究表明COL6A1的抑制表達(dá)可以明顯抑制腎癌細(xì)胞的增殖以及侵襲，故對COL6A1的研究可為治療腎透明癌開辟新的路徑和提供新的治療靶點(diǎn)。

參考文獻(xiàn)：

[1] SUBRAMANIAN P,HAAS MD NB.Recent advances in localized RCC: A focus on VEGF and immuno-oncology therapies[J]. Urol Oncol, 2017.

[2] KEENE DR.Ultrastructure of type VI collagen in human skin and cartilage suggests an anchoring function for this filamentous network[J].J Cell Biol,1988,107(5):1995-2006.

[3] BONNANS C, CHOU J,WERB Z.Remodelling the extracellular matrix in development and disease[J]. Nature Reviews Molecular Cell Biology, 2014,15(12):786-801.

[4] CHEN P, CESCON M,BONALDO P.Collagen VI in cancer and its biological mechanisms[J]. Trends Mol Med, 2013,19(7):410-7.

[5] CHENG IH, LIN YC, HWANG E, et al.Collagen VI protects against neuronal apoptosis elicited by ultraviolet irradiation via an Akt/Phosphatidylinositol 3-kinase signaling pathway[J]. Neuroscience, 2011,183:178-88.

[6] FITZGERALD J, RICH C, ZHOU FH, et al.Three novel collagen VI chains, alpha4(VI), alpha5(VI), and alpha6(VI)[J]. J Biol Chem, 2008,283(29):20170-80.

[7] FUJITA A, SATO JR, FESTA F, et al.Identiication of COL6A1 as a differentially expressed gene in human astrocytomas[J]. Gen Mol Res, 2008,7(2):371-8.

[8] CHIU KH, CHANG YH, WU YS, et al.Quantitative secretome analysis reveals that COL6A1 is a metastasis-associated protein using stacking gel-aided purification combined with iTRAQ labeling[J]. J Proteome Res, 2011,10(3):1110-25.

[9] SIEGEL R, NAISHADHAM D,JEMAL A.Cancer statistics[J]. CA Cancer J Clin, 2012,62(1):10-29.

[10] VERRECCHIA F, CHU ML,MAUVIEL A.Identification of novel TGF-beta/Smad gene targets in dermal fibroblasts using a combined cDNA microarray/promoter transactivation approach[J]. J Biol Chem, 2001,276(20):17058-62.

[11] SONG J,SHI W.The concomitant apoptosis and EMT underlie the fundamental functions of TGF-beta[J]. Acta Biochim Biophys Sin (Shanghai), 2017:1-7.

[12] ELSNER A, LANGE F, FITZNER B, et al.Distinct antifibrogenic effects of erlotinib, sunitinib and sorafenib on rat pancreatic stellate cells[J]. World J Gastroenterol, 2014,20(24):7914-25.

[13] 唐碧霞, 遲志宏, 盛錫楠, 等.索拉非尼治療晚期腎癌患者的療效及不良反應(yīng)[J].中華醫(yī)學(xué)雜志, 2015(30):2459-61.