，

(1. 南華大學(xué)附屬第二醫(yī)院藥劑科，湖南 衡陽(yáng)421001；2.南華大學(xué)藥物藥理研究所)

現(xiàn)代醫(yī)學(xué)研究發(fā)現(xiàn)動(dòng)脈粥樣硬化(Atherosclerosis,As)是多種心血管疾病的共同病理基礎(chǔ)，As的發(fā)病機(jī)制涉及內(nèi)皮損傷、脂質(zhì)浸潤(rùn)、血栓形成等方面，血管內(nèi)皮細(xì)胞氧化應(yīng)激損傷是As發(fā)生的始動(dòng)環(huán)節(jié)[1]。有機(jī)磷酸酯類(lèi)化合物(Organophosphares,Org-P)在農(nóng)業(yè)防蟲(chóng)抗害中應(yīng)用廣泛，Org-P的代謝物對(duì)氧磷引起血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷，引起動(dòng)脈粥樣硬化等疾病的發(fā)生發(fā)展[2-4]。本文探討對(duì)氧磷(Paraoxon,PO)對(duì)人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞(Human umbilical vein endothelial cells，HUVECs)的氧化應(yīng)激損傷。

1 材料與方法

1.1細(xì)胞株人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞株，由南華大學(xué)藥物藥理研究所中心實(shí)驗(yàn)室提供。

1.2主要藥品與試劑PO購(gòu)于Dr. Ehrenstorfer GmbH公司(德國(guó))；二甲基亞砜(DMSO)，胰蛋白酶購(gòu)于Sigma公司(美國(guó))；DMEM購(gòu)于Gibco(美國(guó))；胎牛血清購(gòu)于四季清(中國(guó)杭州)；BCA蛋白濃度測(cè)定試劑，SDS-PAGE蛋白上樣緩沖液，細(xì)胞裂解液，超敏ECL化學(xué)發(fā)光試劑盒購(gòu)于碧云天生物技術(shù)公司；CCK8試劑盒購(gòu)于廣州奕源生物公司；抗Notch1兔單克隆抗體，抗Hes1兔單克隆抗體購(gòu)于Cell Signaling Technology；抗Bcl-2兔單克隆抗體，抗Caspase3兔單克隆抗體，抗Bax兔單克隆抗體購(gòu)于萬(wàn)類(lèi)生物科技；抗α-Tublin兔單克隆抗體購(gòu)于上海瓦蘭生物科技；辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記羊抗兔IgG，辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記羊抗鼠IgG購(gòu)于北京康為世紀(jì)生物技術(shù)有限公司；乳酸脫氫酶(lactate dehydrogenase,LDH)試劑盒，丙二醛(Malonaldehyde,MDA)試劑盒，超氧化物歧化酶(Superoxide Dismutase,SOD)試劑盒購(gòu)于中國(guó)南京建誠(chéng)生物技術(shù)有限公司。

1.3 PO刺激HUVECs氧化應(yīng)激損傷模型建立PO刺激HUVECs氧化應(yīng)激損傷量效關(guān)系實(shí)驗(yàn):取90%融合狀態(tài)時(shí)HUVECs空白對(duì)照組、不同濃度PO(300，600，900，1 200，2 400 μm)組和溶媒對(duì)照組(0.1%DMSO)培養(yǎng)24 h(每組6個(gè)平行孔)。PO刺激HUVECs氧化應(yīng)激損傷時(shí)效關(guān)系:通過(guò)PO量效關(guān)系實(shí)驗(yàn)，選取最佳PO刺激終濃度(1 200 μm)為PO時(shí)效關(guān)系的條件，待HUVECs 90%融合狀態(tài)時(shí)，用1200 μm PO處理HUVECs，分為0，6，12，24 h四組(每組6個(gè)平行孔，其中0 h組為含有0.1% DMSO培養(yǎng)基)。

1.4數(shù)據(jù)分析用Graphpad prism5軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示。多組數(shù)據(jù)平均值的差異用單因素方差分析檢驗(yàn)，以P<0.05認(rèn)為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 PO刺激HUVECs氧化應(yīng)激損傷量效關(guān)系

2.1.1 不同濃度PO刺激引起的HUVECs形態(tài)變化 如圖1所示，普通光學(xué)顯微鏡下觀察空白對(duì)照組HUVECs貼壁生長(zhǎng)呈鵝卵石樣排列，生長(zhǎng)狀態(tài)良好，細(xì)胞間緊密連接；細(xì)胞呈多角形或短梭形，大小均勻，邊界清楚；隨PO濃度增加，細(xì)胞數(shù)量變少，細(xì)胞間隔變大，細(xì)胞間出現(xiàn)空泡與碎片。PO(300，600 μm)組HUVECs變化不明顯，PO(1 200，2 400 μm)組細(xì)胞內(nèi)空泡與碎片較明顯且細(xì)胞間排列稀疏，2 400 μm組細(xì)胞皺縮明顯，空泡與裂解碎片增多。溶媒對(duì)照組 (DMSO組)對(duì)比空白對(duì)照組細(xì)胞形態(tài)沒(méi)有明顯改變。

圖1 不同濃度PO刺激24 h后引起HUVECs的形態(tài)變化(100×)

2.1.2 CCK8法檢測(cè)PO對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞活力的影響 與空白對(duì)照組相比，HUVECs經(jīng)PO處理后細(xì)胞存活率降低。設(shè)對(duì)照組細(xì)胞存活率為100%，PO(300，600，900，1200，2400μm)細(xì)胞存活率(%)分別為：1.003%±0.094%，0.928%±0.201%，0.760%±0.148%，0.525%±0.105%，0.408%±0.133%。其中PO(900,1200，2400μm)組細(xì)胞活力呈劑量依賴(lài)性降低(P<0.01)；溶媒DMSO組與空白組相比，細(xì)胞存活率(0.885%±0.186%)下降不明顯(P>0.05)。

圖2 不同濃度的PO刺激24 h后對(duì)HUVECs活力的影響(n=6)與空白對(duì)照組比較,*P<0.05

2.1.3 不同濃度PO對(duì)HUVECs中SOD活性、MDA、LDH含量的影響 HUVECs與不同濃度的PO(300，600，900，1 200，2 400μm)共同孵育24 h，測(cè)定培養(yǎng)液SOD活性、MDA、LDH含量。結(jié)果如表1所示：與空白對(duì)照組相比，PO(600，900，1 200，2 400 μm)組細(xì)胞中SOD活力呈現(xiàn)濃度依賴(lài)性減弱(P<0.01)，溶媒對(duì)照組(DMSO組)變化不明顯(P>0.05)；PO(900，1 200，2 400 μm)組MDA、LDH含量呈現(xiàn)濃度依賴(lài)性升高(P<0.01)，溶媒對(duì)照組(DMSO組)MDA、LDH含量無(wú)明顯變化(P>0.05)。

表1 PO對(duì)HUVECs培養(yǎng)液中SOD、MDA、LDH的影響(n=6)

與空白對(duì)照組比較,aP<0.05

2.1.4 不同濃度PO對(duì) HUVECs凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)的影響 結(jié)果如圖3，圖4顯示，不同濃度PO損傷HUVECs 24 h，通過(guò)Western blot法檢測(cè)各凋亡相關(guān)蛋白(Notch1、Hes1、Bcl2、Caspase3、Bax)表達(dá)；結(jié)果表明，與空白對(duì)照組相比，PO(1 200，2 400μm)組Notch1、Hes1、Caspase3、Bax表達(dá)顯著上調(diào)(P<0.01)，Bcl-2表達(dá)下調(diào)，Bcl-2/Bax比值降低(P<0.01)，溶媒對(duì)照組(DMSO組)各凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)變化不明顯(P>0.05)。

圖3 不同濃度PO刺激HUVECs 24 h后Notch1、Hes1蛋白表達(dá)變化(n=3) 與空白對(duì)照組比較,*P<0.05

圖4 不同濃度PO刺激HUVECs 24 h后細(xì)胞Casepase3表達(dá)及Bcl2/Bax比值變化(n=3)與空白對(duì)照組比較,*P<0.05

2.2 PO對(duì)HUVECs氧化應(yīng)激損傷的時(shí)效關(guān)系

2.2.1 不同時(shí)間PO刺激HUVECs對(duì)細(xì)胞形態(tài)的影響 經(jīng)前面的量效關(guān)系實(shí)驗(yàn)可知1 200 μm的PO處理HUVECs，細(xì)胞損傷最明顯。故選用1 200 μm的PO分別刺激HUVECs不同時(shí)間(0，6，12，24 h)后在顯微鏡下觀察，如圖5顯示，0 h組HUVECs貼壁生長(zhǎng)呈鵝卵石樣排列，生長(zhǎng)狀態(tài)良好，細(xì)胞間緊密連接，細(xì)胞呈多角形或短梭形，大小均一，邊界清楚；隨損傷時(shí)間延長(zhǎng)，細(xì)胞形態(tài)逐漸發(fā)生變化，細(xì)胞內(nèi)出現(xiàn)空泡與碎片，細(xì)胞數(shù)目減少，脫落增多。

圖5 1 200 μm PO損傷HUVECs不同時(shí)間后細(xì)胞形態(tài)變化(100×)

2.2.2 不同時(shí)間PO刺激HUVECs對(duì)細(xì)胞活力的影響 如圖6所示，與0 h組相比， PO(12 h，24 h)組細(xì)胞活力呈時(shí)間依賴(lài)性下降(P<0.05)。

圖6 1 200 μm PO作用于HUVECs不同時(shí)間對(duì)細(xì)胞活力的影響(n=6)與0 h組比較，*P<0.05

2.2.3 不同時(shí)間PO對(duì)HUVECs培養(yǎng)液中SOD、MDA、LDH含量的影響 如表2所示，與0 h組相比，隨著PO處理HUVECs時(shí)間的延長(zhǎng)，細(xì)胞內(nèi)SOD含量逐漸降低，PO(12 h, 24 h)組SOD含量呈時(shí)間依賴(lài)性顯著降低(P<0.01)。與0 h組相比，隨著時(shí)間延長(zhǎng)，細(xì)胞內(nèi)MDA、LDH含量逐漸增加，PO(12 h，24 h)組MDA、LDH含量呈時(shí)間依賴(lài)性顯著增加(P<0.01)。

表2 不同時(shí)間PO刺激HUVECs的SOD、MDA、LDH含量的影響(n=6)

與0h比較，aP<0.05

2.2.4 不同時(shí)間PO對(duì)HUVECs凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)的影響 由圖7-8可知，Western blot分析結(jié)果顯示，與0 h對(duì)照組相比，隨著PO處理HUVECs時(shí)間延長(zhǎng)，PO(12 h，24 h)組Notch1、Hes1、Caspase3、Bax表達(dá)增加(P<0.05)，同時(shí)Bcl-2表達(dá)下降，Bcl-2/Bax比值降低(P<0.05)。

圖7 1 200 μm PO作用于HUVECs不同時(shí)間后Notch1、Hes1蛋白變化表達(dá)(n=3)與0 h組比較，*P<0.05

圖8 1 200 μm PO作用于HUVECs不同時(shí)間后Casepase3表達(dá)及Bcl2/Bax比值變化(n=3)與0 h組比較，*P<0.05

3 討 論

動(dòng)脈粥樣硬化是一種多因素誘發(fā)的疾病，它涉及到年齡、飲食習(xí)慣、感染與環(huán)境等因素，發(fā)病機(jī)理十分復(fù)雜，至今尚未完全闡明。有文獻(xiàn)報(bào)道長(zhǎng)期與有機(jī)磷酸酯類(lèi)殺蟲(chóng)劑接觸對(duì)心血管疾病的發(fā)生有密切關(guān)系[5-6]，還有研究表明長(zhǎng)期使用農(nóng)藥的花匠與牧民會(huì)增加患心血管疾病的風(fēng)險(xiǎn)[7-9]。LDH是細(xì)胞內(nèi)的糖酵解酶，廣泛存在于細(xì)胞漿內(nèi)，培養(yǎng)液中 LDH 漏出增加顯示細(xì)胞遭到破壞或細(xì)胞膜通透性增加，細(xì)胞或細(xì)胞膜損傷的程度可通過(guò)LDH水平高低反映出來(lái)[10]。研究表明內(nèi)皮細(xì)胞氧自由基產(chǎn)生脂質(zhì)過(guò)氧化程度的增加時(shí)，MDA含量的升高， DNA合成抑制，阻礙內(nèi)皮細(xì)胞損傷修復(fù)，促進(jìn)動(dòng)脈粥樣硬化的發(fā)生發(fā)展[11]。正常細(xì)胞內(nèi)的SOD 等內(nèi)源性抗氧化酶系，可通過(guò)代謝轉(zhuǎn)化清除活性氧，抑制動(dòng)脈粥樣硬化的發(fā)生發(fā)展[12-13]。本課題組近年來(lái)對(duì)有機(jī)磷酸酯類(lèi)農(nóng)藥產(chǎn)生的心血管危害作用及機(jī)制做了大量的研究，前期試驗(yàn)已成功建立敵百蟲(chóng)加速的遠(yuǎn)交群大鼠 (Sprague Dawley Rat, SD Rat)As模型[14]，用有機(jī)磷酸酯類(lèi)農(nóng)藥敵百蟲(chóng)給家兔長(zhǎng)期灌胃，發(fā)現(xiàn)兔血管形態(tài)明顯改變以及血管內(nèi)皮功能的損傷[15]。人體內(nèi)的一些基因與生理病理?xiàng)l件下的程序式細(xì)胞調(diào)亡有關(guān)，已證實(shí)凋亡調(diào)節(jié)因子參與細(xì)胞的調(diào)控，Bcl-2基因可抑制多種細(xì)胞的凋亡，Bax是細(xì)胞凋亡的啟動(dòng)子，Bcl-2/Bax比值反應(yīng)細(xì)胞凋亡的程度；Bax促進(jìn)Caspase表達(dá)，介導(dǎo)細(xì)胞凋亡[16-17]。王寧等用姜黃素拮抗內(nèi)皮細(xì)胞的氧化應(yīng)激反應(yīng)主要是通過(guò)調(diào)節(jié)Notch1信號(hào)通路發(fā)揮減輕細(xì)胞凋亡的作用[18]。研究發(fā)現(xiàn)Notch1信號(hào)通路在內(nèi)皮細(xì)胞的間質(zhì)化、內(nèi)皮細(xì)胞增生以及凋亡過(guò)程中發(fā)揮著重要作用[19]。有文獻(xiàn)報(bào)導(dǎo)血管內(nèi)皮細(xì)胞中Notch 1促進(jìn)Hes 1的表達(dá)[20]。

本實(shí)驗(yàn)用對(duì)氧磷誘導(dǎo)人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞建立氧化應(yīng)激損傷的模型，發(fā)現(xiàn)PO呈濃度與時(shí)間依賴(lài)性介導(dǎo)人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞氧化應(yīng)激損傷，引起內(nèi)皮細(xì)胞的形態(tài)改變(如細(xì)胞萎縮以及細(xì)胞間隙增寬等)，內(nèi)皮細(xì)胞活力SOD明顯降低，MDA、LDH含量逐漸增加；本實(shí)驗(yàn)也觀察到Caspase3、Bax、Notch1、Hes1的表達(dá)上調(diào)，而B(niǎo)cl-2表達(dá)和Bcl-2/Bax比值下降，PO對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞產(chǎn)生明顯的氧化應(yīng)激損傷。

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