杜軍國(guó)，季 彬，祁宏山，曾 楊，陳 娟，祝 英，王治業(yè)*

（1.甘肅省科學(xué)院生物研究所，甘肅 蘭州 730030；2.甘肅省工業(yè)微生物工程技術(shù)研究中心，甘肅 蘭州 730030）

農(nóng)業(yè)部《全國(guó)草食畜牧業(yè)發(fā)展規(guī)劃（2016-2020）》中指出，2015年時(shí)我國(guó)規(guī)模以上肉牛（≥50頭）、肉羊（≥100只）飼養(yǎng)量分別占全國(guó)牛、羊飼養(yǎng)總量的27.5%、36.5%，預(yù)計(jì)至2020年時(shí)占比也僅為45%、45%。即截至目前占我國(guó)養(yǎng)殖業(yè)多數(shù)的仍為小散微養(yǎng)殖戶。由于養(yǎng)殖規(guī)模有限，小散微養(yǎng)殖戶在養(yǎng)殖過程中多不愿有過多的成本投入，飼料也僅以干、黃秸稈為主，少有青、黃貯等飼料，這嚴(yán)重制約了秸稈飼料化技術(shù)在我國(guó)的推廣應(yīng)用。

調(diào)查發(fā)現(xiàn)，青貯窯的建造以及青貯前的物料集運(yùn)、青貯過程中的機(jī)械化壓封等是造成秸稈青貯發(fā)酵成本過高的主因。為此，有研究人員[1-3]采用袋裝就地青貯的方法來(lái)制作秸稈飼料，該法具有一次性投資少、可階段性青貯、隨時(shí)取用等優(yōu)點(diǎn)[2-4]，比較適合在小散微養(yǎng)殖戶中推廣。但因我國(guó)西北地區(qū)秋冬季節(jié)環(huán)境溫度過低[5]，一般十月下旬時(shí)日最低溫度就已低至零下，由此導(dǎo)致袋裝青貯飼料發(fā)酵時(shí)間過長(zhǎng)、蛋白增量不明顯等問題。

一般說(shuō)來(lái)，用可低溫發(fā)酵的秸稈飼料化菌劑來(lái)制備秸稈飼料能有效解決這一問題。目前，關(guān)于低溫發(fā)酵菌劑的研究主要集中在秸稈還田[6-7]、廢水處理[8]以及沼氣產(chǎn)生[9-10]等領(lǐng)域。市面上，在售的秸稈飼料化菌劑種類繁多，但是否可用于在低溫下啟動(dòng)以發(fā)酵制備甜高粱袋裝秸稈飼料尚不可知?；诖?，本研究采用優(yōu)化篩選的方法，從眾多市售菌劑及自制菌劑當(dāng)中獲得一種可在低溫下發(fā)酵、并能顯著縮短發(fā)酵時(shí)間的秸稈飼料化菌劑，以期能在小散微養(yǎng)殖戶中推廣利用秸稈飼料化技術(shù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 材料與菌劑

1.1.2 培養(yǎng)基

MRS培養(yǎng)基：蛋白胨10 g，牛肉膏10 g，酵母膏5 g，檸檬酸氫二胺2 g，葡萄糖20 g，吐溫80 2 g，乙酸鈉5 g，磷酸氫二鉀2 g，七水合硫酸鎂0.58 g，瓊脂18 g，蒸餾水1 000 mL，將上述成分加入蒸餾水中，加熱溶解，校正pH至6.2，分裝后于121℃高壓滅菌20 min；

孟加拉紅培養(yǎng)基：蛋白胨5 g，葡萄糖10 g，磷酸二氫鉀1 g，七水合硫酸鎂0.5 g，1/3 000孟加拉紅溶液100 mL，蒸餾水1000mL，氯霉素0.1g，瓊脂15g。上述各組分加入蒸餾水中溶解后，再加孟加拉紅溶液，分裝后，121℃滅菌20 min。傾注平板前，另用少量乙醇溶解氯霉素加入培養(yǎng)基中。

1.1.3 化學(xué)試劑

葡萄糖（分析純）：天津市永大化學(xué)試劑開發(fā)中心；蛋白胨（生化試劑）：天津市英博生化試劑有限公司；酵母膏（生化試劑）：北京奧博星生物技術(shù)有限公司；瓊脂粉（生化試劑）：北京Solarbio科技有限公司；氯化鈉（分析純）：天津市北方化玻購(gòu)銷中心；3,5-二硝基水楊酸（分析純）：上海士鋒生物科技有限公司；酒石酸鉀鈉、無(wú)水硫酸銅、硫酸鉀（均為分析純）：天津市致遠(yuǎn)化學(xué)試劑有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

FE20-FiveEasy Plus pH計(jì)：梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司；海能K100型全自動(dòng)凱氏定氮儀：濟(jì)南海能儀器股份有限公司；SHP-250型智能生化培養(yǎng)箱：上海鴻都電子科技有限公司；756MC型紫外可見光分光光度計(jì)：上海分析儀器總廠；超低功耗便攜式地溫采集裝置和方法：專利產(chǎn)品（專利公開號(hào)：CN104330177A）。

1.3 方法

1.3.1 甜高粱秸稈發(fā)酵袋裝飼料制作

標(biāo)準(zhǔn)方面，因五味子、南五味子炮制飲片規(guī)格多，并且各地方飲片標(biāo)準(zhǔn)不完善，存在無(wú)標(biāo)準(zhǔn)或有標(biāo)準(zhǔn)而無(wú)檢驗(yàn)項(xiàng)目的情況。另外，本次在國(guó)抽樣品檢驗(yàn)基礎(chǔ)上對(duì)五味子標(biāo)準(zhǔn)的【鑒別】項(xiàng)進(jìn)行了探索性研究，新建立的薄層鑒別法增加了五味子醇甲和五味子乙素為指標(biāo)性成分，能有效區(qū)分五味子和南五味子。建議修訂其薄層色譜鑒別項(xiàng)，提高五味子藥材及飲片標(biāo)準(zhǔn)鑒別項(xiàng)目的專屬性，從而可有效區(qū)分以南五味子冒充五味子的情況。

試驗(yàn)采用隨機(jī)區(qū)組設(shè)計(jì)，對(duì)照組（CK處理）中每噸秸稈噴施1 L蒸餾水，試驗(yàn)組中不同菌劑的使用量分別如下：DJ菌劑，200 g/t飼料；“畜草1號(hào)”乳酸菌劑，2.5 g/t飼料；R2J1菌劑，1 L/t飼料。甜高粱秸稈采用袋裝打包、室溫堆放方式青貯發(fā)酵45 d，每個(gè)處理打10包，每包約75 kg，發(fā)酵期間對(duì)其溫度、pH值、乳酸菌、酵母菌數(shù)、粗蛋白含量、殘?zhí)堑戎笜?biāo)進(jìn)行測(cè)定。

1.3.2 分析檢測(cè)

溫度測(cè)定：在秸稈袋裝飼料制作過程中，將專利產(chǎn)品“超低功耗便攜式地溫采集裝置”溫度探頭置于發(fā)酵袋中，發(fā)酵過程中每隔3 d在固定時(shí)間采集一次溫度。pH值測(cè)定：稱取樣品10g再加入90mL蒸餾水，在室溫條件下靜置10min，待其充分浸泡后，用實(shí)驗(yàn)室pH計(jì)測(cè)定。粗蛋白含量測(cè)定：詳見國(guó)標(biāo)GB50095—2010《食品中蛋白質(zhì)的測(cè)定》。殘?zhí)菧y(cè)定：采用3,5-二硝基水楊酸（dinitrosalicvlic acid，DNS）比色法。

乳酸菌數(shù)測(cè)定：采用MRS培養(yǎng)基，分別接種10-6、10-7、10-8、10-94個(gè)稀釋梯度的懸浮液并涂布在培養(yǎng)皿上，于37℃培養(yǎng)72 h后，選取MRS培養(yǎng)基上光滑、圓形的灰白色菌落進(jìn)行乳酸菌計(jì)數(shù)。

酵母菌和霉菌數(shù)量測(cè)定：采用孟加拉紅培養(yǎng)基，分別接種10-1、10-2、10-3、10-4、10-5、10-6、10-7這7個(gè)稀釋梯度的懸浮液于（28±1）℃培養(yǎng)48 h后，選取孟加拉紅培養(yǎng)基上濕潤(rùn)、光滑、不透明、比細(xì)菌大而厚的菌落進(jìn)行酵母菌計(jì)數(shù)；同時(shí)選取菌絲細(xì)長(zhǎng)、菌落疏松呈絨毛狀、蜘蛛網(wǎng)狀、棉絮狀菌落進(jìn)行霉菌計(jì)數(shù)。

2 結(jié)果與分析

2.1 發(fā)酵過程中各處理溫度和pH值變化分析

在秸稈飼料發(fā)酵制備過程中，除了滿足一定的厭氧要求[11-12]外，還需維持菌種生長(zhǎng)和產(chǎn)物合成所需的一定溫度[13]，這主要是因?yàn)槲⑸锏纳L(zhǎng)和產(chǎn)物的合成都是在各種酶的催化作用下進(jìn)行的，而溫度是影響酶活性的重要因素。以甜高粱秸稈自然青貯為對(duì)照，不同發(fā)酵菌劑（DJ農(nóng)作物秸桿生物發(fā)酵飼料菌劑、“畜草1號(hào)”乳酸菌劑及R2J1菌劑）處理甜高粱秸稈發(fā)酵袋裝飼料制作過程中溫度及pH的變化結(jié)果見圖1。

西北地區(qū)秋冬季節(jié)寒冷的氣候條件，是制約秸稈飼料化技術(shù)在該地小散微養(yǎng)殖戶中推廣的主要原因。由圖1A可知，在整個(gè)飼料化發(fā)酵期間，各處理溫度隨著環(huán)境溫度的下降而迅速下降，但卻始終高于環(huán)境溫度0.6～7.2℃，說(shuō)明環(huán)境溫度的變化是影響青貯物料溫度變化的主要原因。試驗(yàn)過程中環(huán)境溫度平均值為5.93℃；R2J1菌劑處理組平均溫度10.24℃，為各處理中最高，比環(huán)境溫度平均值高出4.3℃，增溫效果要好于其他處理；“畜草1號(hào)”乳酸菌劑處理，其平均溫度為9.12℃，高出環(huán)境溫度平均值3.19℃，增溫效果僅次R2J1菌劑處理組；各處理中自然青貯組物料溫度最低，平均為8.5℃，卻也比環(huán)境溫度高出2.57℃，表明青貯過程中的微生物活動(dòng)可不同程度的抵消料溫隨著環(huán)境溫度而急劇下降的不利影響。

圖1 甜高粱莖稈自然青貯和菌劑青貯飼料化發(fā)酵中溫度(A)和pH值(B)的變化Fig.1 Changes of temperature(A)and pH(B)during natural and starter siliage fermentation of sweet sorghum straw

pH值是評(píng)價(jià)秸稈青貯飼料品質(zhì)最簡(jiǎn)單且最重要的指標(biāo)，pH值越低，酸度越大，雜菌不宜生長(zhǎng)，飼料可以得到很好的保存，但pH值＜4.5時(shí)，一則飼喂牛羊過程中須與干黃秸稈混合使用，方可避免牛羊酸中毒[14-15]，增加了農(nóng)戶勞動(dòng)量；二則在抑制雜菌的同時(shí)也會(huì)使酵母菌等不能繁殖，結(jié)果是成熟飼料單細(xì)胞蛋白增量有限，因此秸稈飼料化過程中，合理范圍的pH值才是發(fā)酵所需。本試驗(yàn)從發(fā)酵第3天時(shí)開始檢測(cè)pH值，由圖1B可知：甜高粱秸稈袋裝青貯發(fā)酵過程中，各菌劑處理組的pH值介于3.75～4.47之間，顯著低于自然青貯pH值（平均pH值為5.64），而其中添加R2J1菌劑處理的pH值穩(wěn)定在4.47左右，說(shuō)明R2J1菌劑處理的乳酸菌株產(chǎn)酸能力較為適中。

本試驗(yàn)表明，R2J1菌劑在甜高粱袋裝青貯過程中增溫效果優(yōu)于其他菌劑，在整個(gè)發(fā)酵期的平均溫度較室溫高出4.31℃，且成熟飼料酸度也較其他處理更為適中，這對(duì)該地區(qū)小散微養(yǎng)殖戶制作袋裝秸稈飼料有益。

2.2 發(fā)酵過程中粗蛋白和殘?zhí)呛孔兓治?/h3>

以甜高粱秸稈自然青貯為對(duì)照，不同發(fā)酵菌劑（DJ農(nóng)作物秸桿生物發(fā)酵飼料菌劑、“畜草1號(hào)”乳酸菌劑及R2J1菌劑）處理甜高粱秸稈發(fā)酵袋裝飼料制作過程中粗蛋白及殘?zhí)呛康淖兓Y(jié)果見圖2。

由圖2A可知，各處理中物料殘?zhí)呛侩S著發(fā)酵時(shí)間延長(zhǎng)均呈降低趨勢(shì)，其中R2J1處理降幅最大為44%，其他處理中DJ菌劑處理降幅為39.2%“，畜草1號(hào)”乳酸菌劑處理降幅為40.3%，自然青貯處理降幅為39.1%；R2J1處理殘?zhí)呛吭?～6 d時(shí)下降最為迅速，12 d以后有所降低但幅度不大，分析原因可能與環(huán)境溫度下降過快有關(guān)（見圖1A）；至發(fā)酵42 d時(shí)，DJ菌劑處理中殘?zhí)橇孔罡邽?.54%，R2J1菌劑處理中殘?zhí)呛孔钌贋?.69%。

由圖2B可知，菌劑處理組中蛋白含量在發(fā)酵過程中呈遞增態(tài)勢(shì)，但在發(fā)酵18 d后遞增幅度不大，分析原因可能與環(huán)境溫度過低致使發(fā)酵提前終止有關(guān)；自然青貯處理在第12天時(shí)粗蛋白含量為8.23%，為整個(gè)處理過程中的最高值，之后隨著發(fā)酵時(shí)間的延長(zhǎng)略有下降，這或許與自然青貯過程中的雜菌污染有關(guān)。在整個(gè)發(fā)酵處理過程中，R2J1菌劑處理中蛋白含量在第18天時(shí)含量為9.89%，比發(fā)酵前增加了27.44%，增幅在各處理中最大。

圖2 甜高粱莖稈自然青貯和菌劑青貯中殘?zhí)?A)和粗蛋白(B)含量的變化Fig.2 Changes of residual sugar(A)and crude protein(B)contents during natural and starter siliage fermentation of sweet sorghum straw

上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，R2J1菌劑處理在甜高粱秸稈袋裝青貯過程中降糖增蛋白效果優(yōu)于其他處理。

2.3 發(fā)酵過程中乳酸菌、酵母菌、霉菌數(shù)變化分析

以甜高粱秸稈自然青貯為對(duì)照，不同發(fā)酵菌劑（DJ農(nóng)作物秸桿生物發(fā)酵飼料菌劑、“畜草1號(hào)”乳酸菌劑及R2J1菌劑）處理甜高粱秸稈發(fā)酵袋裝飼料制作過程中乳酸菌、酵母菌及霉菌數(shù)量的變化結(jié)果見表1。

青貯發(fā)酵過程中，乳酸菌的數(shù)量與青貯品質(zhì)息息相關(guān)，已有研究[16-17]表明，乳酸菌在青貯飼料發(fā)酵過程中會(huì)產(chǎn)生大量有機(jī)酸、細(xì)菌素及其它抑菌物質(zhì)，可以有效抑制有害菌的生長(zhǎng)，防治二次污染，此外，作為益生菌株，其還可提高奶牛的進(jìn)食量和產(chǎn)奶量。由表1可知，在整個(gè)青貯發(fā)酵過程中，各處理中乳酸菌數(shù)均呈先增后降趨勢(shì)，分別在第10～20 d期間達(dá)到峰值，其中又以R2J1菌劑處理在第20天時(shí)含有最多的乳酸菌數(shù)，為1.2×1010個(gè)/g，之后，隨著發(fā)酵時(shí)間的延長(zhǎng)，乳酸菌數(shù)逐漸降低，至第45天時(shí)，自然青貯中乳酸菌數(shù)已低至5.39×106個(gè)/g，而R2J1菌劑處理卻仍有高達(dá)6.96×109個(gè)/g的乳酸菌數(shù)。另外，在整個(gè)發(fā)酵過程中，DJ菌劑和“畜草1號(hào)”乳酸菌劑處理中乳酸菌數(shù)相對(duì)穩(wěn)定的維持在（1.17～10.40）×108個(gè)/g。

表1 甜高粱秸稈自然青貯與菌劑青貯發(fā)酵過程中乳酸菌、酵母菌及霉菌數(shù)量的變化Table 1 Changes of the numbers of lactic acid bacteria,yeast and mould during natural and starter siliage fermentation of sweet sorghum straw

由表1可知，在自然青貯處理中，酵母菌和霉菌始終存在，說(shuō)明自然青貯處理中乳酸菌產(chǎn)酸抑菌效果不明顯；在菌劑處理組中，在發(fā)酵15 d以前時(shí)，只有R2J1菌劑處理中能檢測(cè)到酵母菌的存在，結(jié)合圖2B結(jié)果，此時(shí)粗蛋白含量正處于快速增長(zhǎng)期，說(shuō)明單細(xì)胞蛋白合成仍在繼續(xù)，另外根據(jù)圖1結(jié)果，此時(shí)R2J1處理組的pH為4.4左右，較DJ菌劑和“畜草1號(hào)”乳酸菌劑組要高。本試驗(yàn)中，自然青貯處理中，霉菌數(shù)量隨發(fā)酵時(shí)間的延長(zhǎng)持續(xù)減少，但一直都有存在，菌劑處理組中在發(fā)酵5 d時(shí)就已不能檢測(cè)到霉菌的存在，表明青貯菌劑可顯著減少秸稈飼料化過程中的霉菌污染問題。

甜高粱莖稈含糖量高[18-19]。本實(shí)驗(yàn)中，使用DJ菌劑和“畜草1號(hào)”乳酸菌劑處理的秸稈飼料，其在發(fā)酵第6天時(shí)pH值已低至4.0以下（見圖1B），由于過酸，飼料中酵母菌數(shù)在第10天時(shí)已不能檢出（見表1），而粗蛋白含量在整個(gè)試驗(yàn)期也基本維持在7%～8%之間（見圖2B），這是因?yàn)槿樗峋置诘娜樗嵩谝种齐s菌（如霉菌）的同時(shí)也阻止了有益酵母菌的繁殖（見表1），盡管在發(fā)酵18 d以后的物料粗蛋白含量仍有小幅增加，分析認(rèn)為是由于乳酸菌體蛋白增加所致。

3 結(jié)論

實(shí)驗(yàn)以甜高莖稈為原料，采用自然青貯和菌劑青貯兩種方式進(jìn)行，袋裝發(fā)酵，結(jié)果表明，添加菌劑青貯組在物料溫度、pH值、蛋白增量、乳酸菌數(shù)等方面優(yōu)于自然青貯組；而在3種菌劑青貯處理中，用R2J1菌劑可將發(fā)酵時(shí)間控制在18 d左右，此時(shí)飼料pH值為4.5，飼料中乳酸菌數(shù)高達(dá)1.2×1010個(gè)/g，粗蛋白含量9.89%，比發(fā)酵前增加27.44%，各項(xiàng)指標(biāo)均優(yōu)于其他處理組，表明R2J1菌劑可用于甜高粱莖稈袋裝青貯。

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