江繼鵬，楊凱，趙飛，張珊珊，逄璦博，張賽△，陳旭義△

少突膠質細胞（oligodendrocytes，OLs）是中樞神經(jīng)系統(tǒng)中一類重要的支持細胞，在軸突包繞、髓鞘絕緣結構形成、協(xié)助興奮傳遞、維持保護神經(jīng)元正常代謝等方面發(fā)揮決定性的作用［1-2］。OLs功能不良或發(fā)生病變時，可能發(fā)生嚴重的脫髓鞘疾病，其中以多發(fā)性硬化癥（MS）為代表的中樞神經(jīng)系統(tǒng)脫髓鞘疾病已經(jīng)成為困擾人類健康的一類頑疾［3］，其發(fā)病的年輕化、病情的反復性、治療策略的單一性及預后的不確定性給患者及其家庭帶來極大的痛苦［4］。目前該類疾病的發(fā)病機制仍未完全闡明，相關治療進展依舊緩慢，臨床診療主要以控制急性發(fā)作、延緩疾病加重、促進中樞神經(jīng)系統(tǒng)中神經(jīng)元軸突再生及髓鞘化為主要思路，常用的藥物如糖皮質激素、免疫抑制劑等的不良反應是傳統(tǒng)療法存在爭議的一大原因［5］，而新興的治療策略如干細胞療法等仍存在較多的不確定性。因此，尋找新的、安全有效的替代藥物保護內源性的、幼稚的少突膠質細胞前體細胞（oligodendroglial precursor cells，OPCs）及成熟的OLs是目前治療脫髓鞘疾病的一個新課題。

布洛芬作為一種非甾體抗炎藥已被廣泛應用于臨床鎮(zhèn)痛治療。近年來研究顯示，布洛芬可通過抑制環(huán)氧化酶等途徑控制出血性腦卒中后神經(jīng)系統(tǒng)炎癥反應及少突膠質細胞祖細胞的死亡，減少腦白質損傷，促進早期髓鞘的形成［6］。本文主要研究布洛芬對OPCs的促成熟作用及對OPCs和OLs的保護作用，旨在為下一步脫髓鞘疾病的基礎研究和臨床治療提供更多的可能。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1 實驗動物 清潔級健康成年雌性SD大鼠6只，體質量200～250 g；新生SD大鼠（出生24～48 h）6只，均購自中國人民解放軍軍事醫(yī)學科學院實驗動物中心。

1.1.2 主要藥品及試劑 布洛芬、油脂酰溶血磷脂酸（北京阿拉丁公司），DMEM/F12型培養(yǎng)基（美國HyClone公司），兔抗大鼠血小板衍生生長因子受體-α抗體（PDGFR-α，美國SCB公司），羊抗大鼠髓鞘堿性蛋白抗體（MBP，美國Abcam公司）。

1.1.3 主要儀器和設備 細胞恒溫培養(yǎng)箱DNP-9082（美國耐普克公司），高溫高壓蒸汽滅菌鍋MLS-3750L-PC（日本Sanyo公司），相差倒置熒光顯微鏡CKX41-A22PHP（日本奧林巴斯公司），顯微手術器械（蘇州施強公司），手術解剖顯微鏡M844F40（瑞士徠卡公司），微量電子稱TP-202（貴州電子衡器公司），高速細胞離心機5702R（德國Eppendorf公司）。

1.2 方法

1.2.1 細胞獲取及分組干預 對6只成年SD大鼠提取OLs進行培養(yǎng)擴增，并對6只新生大鼠提取腦皮質獲取混合膠質細胞，經(jīng)分離、擴增，傳代獲得一定數(shù)量的OPCs，分別對獲取的OLs和OPCs進行免疫熒光染色。用溶血磷脂酸（lysophosphatidic acid，LPA）干預成年SD大鼠的OLs，并觀察干預前后OLs形態(tài)學變化。將OPCs接種于24個六孔細胞培養(yǎng)板中，按隨機數(shù)字表法隨機分為對照組、布洛芬組、LPA組及LPA+布洛芬組，每組6個培養(yǎng)板。待各組細胞貼壁第3天，觀察細胞形態(tài)并加入藥物干預，對照組加入生理鹽水，其他3組分別加入布洛芬鹽水溶液（100μmol/L）、LPA（1μmol/L）及兩者的混合液各1 mL。藥物干預持續(xù)7 d后進行細胞形態(tài)觀察，比較各組OLs生成情況并進行成熟OLs細胞計數(shù)。

1.2.2 OPCs及OLs的免疫熒光染色鑒別 吸管吸取細胞培養(yǎng)基，PBS清洗細胞層3次，應用4%多聚甲醛1 mL固定細胞30 min，每個孔再次用PBS液清洗3次，使用聚乙二醇辛基苯基醚（Triton X-100）浸沒培養(yǎng)皿10 min后用PBS清洗3次，吸取1 mL BSA封閉液封閉細胞膜表面15 min后分別加入PDGFR-α（1∶200）和MBP（1∶200）一抗37～40 ℃下反應30 min，4℃下孵育過夜后吸取多余一抗，PBS沖洗3次，分別加入熒光二抗（鼠抗兔和鼠抗羊IgG熒光抗體），37℃下放置1 h，緩沖液搖洗3次（60 r/min），濾紙吸干蓋玻片，加入DAPI（1∶100）靜置10 min。然后利用緩沖液搖洗3次，3～5 min/次。封片后在相差倒置熒光顯微鏡下（200倍）觀察PDGFR-α、MBP熒光染色情況。

1.2.3 LPA干預前后OLs形態(tài)學觀察 用光學顯微鏡（400倍）觀察獲取的大鼠成熟OLs的細胞形態(tài)，在OLs培養(yǎng)皿中加入1 mL LPA（1.0μmol），2 h后觀察細胞形態(tài)的改變，進行干預前后的比較。

1.2.4 藥物干預前后各組OPCs的形態(tài)學觀察 將獲取的新生鼠的OPCs擴增培養(yǎng)后以6.7×104/cm2接種于六孔細胞培養(yǎng)板中，細胞貼壁3 d后在光鏡下（200倍）觀察各組細胞形態(tài)，分別對各組進行相對應的藥物干預，持續(xù)7 d后，光鏡下（200倍）觀察細胞形態(tài)，進行干預前后的比較。

1.2.5 免疫熒光染色觀察及細胞計數(shù) 持續(xù)干預7 d后，進行MBP免疫熒光染色（染色過程重復1.2.2中的操作步驟），觀察各組OPCs的生長發(fā)育情況和MBP陽性細胞數(shù)量，每組隨機取20個孔。應用Image Pro Plus圖像分析系統(tǒng)進行細胞計數(shù)。

1.2.6 Western blot法檢測MBP的表達 藥物持續(xù)干預7 d后，取細胞培養(yǎng)液以10 000 r/min離心10 min，取上清分裝。用BCA蛋白含量檢測試劑盒檢測蛋白濃度，調節(jié)蛋白終濃度為3 g/L，-80℃保存。每組按30μg/孔上樣，行12%十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE），將電泳儀電壓調至80 V，待溴酚藍指示劑進入分離膠后調整指示電壓至110 V，濕法將蛋白轉至硝酸纖維素膜上，5%牛血清白蛋白封閉，加入一抗（羊抗大鼠MBP抗體1∶10 000和兔抗大鼠GAPDH抗體1∶10 000）室溫孵育1 h，4 ℃過夜，二抗（HRP-兔抗羊1∶2 000和HRP-羊抗兔1∶20 000）室溫孵育1 h，用TBST在震蕩器上洗3次，每次10 min，ECL化學發(fā)光顯色試劑盒曝光顯影，凝膠成像儀獲取圖像，使用Scion Image軟件分析計算相對灰度值。

1.3 統(tǒng)計學方法 采用SPSS 22.0統(tǒng)計軟件進行統(tǒng)計學分析。數(shù)據(jù)以±s表示，采用析因設計進行單個因素主效應及雙因素交互效應統(tǒng)計分析。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 OPCs及OLs的免疫熒光染色結果 免疫熒光染色后PDGFR-α陽性的OPCs胞質呈紅色，胞核呈藍色；MBP陽性的OLs胞質和突起呈綠色，胞核呈藍色。見圖1。

Fig.1 Immunofluorescencestainingof OPCsand OLs(×200)圖1 OPCs及OLs免疫熒光染色（×200）

2.2 LPA干預前后OLs的形態(tài)比較 LPA作用于成熟OLs后可見呈“蜘蛛網(wǎng)狀”生長的突起自末端向胞體方向萎縮，細胞間致密的網(wǎng)狀連接變得十分稀疏。見圖2。

Fig.2 Morphological comparison of OLsbefore and after LPA treatment(×400)圖2 LPA干預前后OLs的形態(tài)比較（×400）

2.3 藥物干預前后各組OPCs細胞的形態(tài)學變化 各組在OPCs貼壁3 d時光鏡下可見細胞形態(tài)多呈類圓形，胞體折光性較強。藥物干預7 d后，對照組中大部分細胞在7 d時形態(tài)呈兩極化生長，細胞突起少，無網(wǎng)狀連接形成。LPA組細胞突起變細、萎縮，胞體生長不良，折光性下降。布洛芬組和LPA+布洛芬組較LPA組細胞突起及分支明顯增多，分支間形成網(wǎng)絡連接，發(fā)育良好。見圖3。

Fig.3 Comparison of growth and development of cellsbeforeand after treatment(×200)圖3 各組干預前后細胞的生長發(fā)育狀況比較（×200）

2.4 藥物干預后各組OPCs細胞的免疫熒光染色比較 結果顯示，布洛芬對細胞成熟發(fā)育有積極作用，加了LPA后細胞發(fā)育明顯受到抑制，但當LPA和布洛芬同時添加時，LPA對細胞的抑制作用得到了明顯控制，表現(xiàn)為布洛芬組和LPA+布洛芬組細胞突起明顯多于對照組和LPA組，且對照組細胞突起明顯多于LPA組，見圖4。布洛芬組和LPA+布洛芬組MBP陽性細胞數(shù)（OLs）明顯多于對照組和LPA組，而后2組差異無統(tǒng)計學意義，見圖5。

Fig.4 Comparison of immunofluorescencestainingafter treatment between four groups(×100)圖4 各組干預后免疫熒光染色比較（×100）

Fig.5 Comparison of thenumber of OLsbetween four groups圖5 各組OLs數(shù)目比較

2.5 MBP表達的Western blot檢測 結果顯示，LPA組的MBP相對表達量明顯低于其他3組，布洛芬組MBP相對表達量高于LPA＋布洛芬組，見圖6。

3 討論

Fig.6 Comparison of MBPexpression levelsbetween four groupsby Western blot assay圖6 Western blot法比較各組MBP相對表達量

3.1 中樞性脫髓鞘疾病的研究現(xiàn)狀 中樞性脫髓鞘疾病的高發(fā)病率和年輕化已使其成為影響人類健康的一大因素。尤其在歐美，MS是年輕人中除外傷外導致神經(jīng)障礙最常見的疾病，是增加年輕人死亡率的一大因素［7］。急性中樞性脫髓鞘病變的髓鞘在短期內可能再生，然而慢性、復發(fā)性或者進展性髓鞘病變的再生相對比較困難，且極易遺留神經(jīng)功能缺損癥狀。目前針對以MS為代表的自身免疫性脫髓鞘疾病的治療尚無有效的根治藥物，髓鞘再生涉及OLs發(fā)生及成熟過程中多種精細協(xié)調機制，而相關機制雖有所進展但仍有不足［8］。因此誘導內源性髓鞘再生已成為該領域的一個研究熱點。OLs在神經(jīng)發(fā)生脫髓鞘病變時，可向病變部位遷移、增殖并替代圍繞神經(jīng)軸突周圍已變性的無功能髓鞘組織［9］。而OLs的再生能力依賴OPCs的增殖分化。因此針對OLs分化發(fā)育成熟機制的研究有助于臨床良性干預髓鞘的再生修復。

3.2 布洛芬對OLs的保護作用 布洛芬應用于臨床已有很多年。近些年來其在經(jīng)典抗炎鎮(zhèn)痛作用外的神經(jīng)保護研究也越來越多。體外研究證實布洛芬可在一定程度上減小成熟OLs的凋亡程度［10］，提示布洛芬有一定的神經(jīng)保護作用。同時，布洛芬也已被應用于阿爾茲海默病的治療［11］。目前已知多種信號通路均參與OLs的分化發(fā)育成熟，如Rho/Rock信號通路、Wnt/β-catenin信號通路、Shh信號通路、BMP信號通路等［12］，其中Rho家族中的鳥苷三磷酸（GTP）酶在調節(jié)細胞形態(tài)中具有重要作用［13-14］。有研究指出布洛芬可通過作用于神經(jīng)系統(tǒng)中的多種細胞，如星形膠質細胞、小膠質細胞和神經(jīng)元細胞內的RhoA信號通路影響細胞形態(tài)結構變化［15］。尤其在OPCs發(fā)育為成熟OLs過程中，Rho信號通路的關鍵酶RhoA酶的活性狀態(tài)呈逐漸降低的趨勢［16］。有研究提示通過抑制RhoA酶活性可以促進少突膠質細胞突起生長［17］。本實驗的設計階段，除了進行鹽水對照組的設置以外，還加入了RhoA激酶激活劑LPA［18］，選擇的LPA濃度為1.0 μmol/L，有相關文獻證實在該濃度下少突膠質細胞胞體增大，突起明顯減少［19］。此外，本實驗中使用的布洛芬濃度為100μmol/L。Roloff等［10］證實在此濃度下神經(jīng)突即可發(fā)生明顯的伸長。LPA作用于大鼠OLs 2 h后即出現(xiàn)了細胞突起自末端向胞體方向萎縮，胞間的網(wǎng)狀連接變稀疏的現(xiàn)象，揭示了LPA對于成熟OLs的毒性作用，證實Rho信號通路保持低活性對于維持成熟OLs完整結構形態(tài)可能具有重要意義［20］。此外，設計的4個組中，在細胞貼壁3 d后開始進行藥物干預，因為在這個時間點細胞貼壁基本已經(jīng)完成，開始進入形成突起的關鍵階段［21］，在持續(xù)7 d干預后，布洛芬組和LPA+布洛芬組中細胞分化發(fā)育明顯好于對照組和LPA組，且免疫熒光染色和Western blot結果均顯示布洛芬組中OLs增殖發(fā)育好于LPA+布洛芬組，證明了布洛芬可在一定程度上削弱了LPA對OPCs的毒性作用，且能夠促進OPCs向OLs成熟形態(tài)發(fā)育并維持其正常狀態(tài)。

3.3 不足與展望 本實驗在布洛芬對OPCs的生長發(fā)育及OLs的形態(tài)維持方面進行了相關探索，但由于OPCs生長分化發(fā)育受到多種復雜的細胞內外因素的影響［22］，且本實驗思路相對簡單，尚不具備更好的臨床指導作用，在未來的研究中還有待進一步探究布洛芬應用的最佳時間窗及最佳劑量，并逐步拓展到其他神經(jīng)系統(tǒng)疾病治療研究中，為神經(jīng)保護和疾病治療提供更多的策略。

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