王 玲，賈 巖，李蒙蒙，王飛蝦，張自力， 張 峰,2,3， 鄭仕中,2,3

[南京中醫(yī)藥大學(xué)1. 江蘇省中藥藥效與安全性評(píng)價(jià)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室、2. 江蘇省中藥功效物質(zhì)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室、3. 中藥品質(zhì)與效能國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室(培育)，江蘇 南京 210023]

1 鐵死亡概述

2012年，Dixon等[5]首次發(fā)現(xiàn)并報(bào)道了一種新型的細(xì)胞死亡方式——鐵死亡。鐵死亡是一種鐵離子依賴性的氧化死亡方式，主要表現(xiàn)為過度的氧化應(yīng)激以及膜脂質(zhì)過氧化反應(yīng)，最終導(dǎo)致質(zhì)膜選擇透過性損壞，從而造成細(xì)胞死亡。

雖然鐵死亡的生理功能尚不明確，但它與多種生理和病理過程相關(guān)，包括腫瘤細(xì)胞死亡、神經(jīng)退行性疾病、急性腎功能衰竭、藥物肝毒性、肝和心臟缺血/再灌注損傷以及T細(xì)胞死亡等[4-12]。然而，與癌癥(如HCC、胰腺癌、腎癌、黑色素瘤、肺癌等)的聯(lián)系更加密切，主要是由于腫瘤細(xì)胞鐵離子的含量比正常細(xì)胞高，而且高表達(dá)致癌基因RAS，使得腫瘤細(xì)胞對(duì)于鐵死亡更加敏感。所以，誘導(dǎo)鐵死亡可能成為防治腫瘤的新策略。

Tab 1 Difference between ferroptosis and apoptosis, necrosis and autophagy in terms of morphological features, inducing factors, regulatory pathways, inducers and inhibitors

2 鐵死亡與HCC

HCC是我國乃至全世界常見的惡性腫瘤之一，其主要特征表現(xiàn)為癌細(xì)胞保留部分肝細(xì)胞的特征，不形成肝小葉；而且呈多角形，胞質(zhì)豐富，核大而核仁明顯，分化較好者可在胞質(zhì)中見到膽汁粒；癌細(xì)胞常排列成巢狀或索狀，癌巢間有豐富血竇。HCC可由多種病因引起，其中肝炎病毒以及肝硬化是其重要的致病因素[17]。近年來，鐵死亡在HCC的發(fā)生、發(fā)展中的作用引起大量學(xué)者的關(guān)注，逐漸成為肝癌領(lǐng)域研究的熱點(diǎn)[4-12]。與正常生理狀態(tài)肝細(xì)胞相比，HCC細(xì)胞中RAS致癌基因的高表達(dá)、鐵離子含量增加，所以HCC細(xì)胞對(duì)鐵死亡更加敏感，這提示鐵死亡在HCC的發(fā)生、發(fā)展中扮演著重要角色。本文接下來將針對(duì)鐵死亡在HCC中的分子機(jī)制作重點(diǎn)闡述(Fig 1)。

2.1p62-Keap1-Nrf2信號(hào)通路調(diào)控鐵死亡近年來，大量的臨床數(shù)據(jù)以及實(shí)驗(yàn)研究顯示，Keap1-Nrf2-ARE信號(hào)通路與HCC發(fā)展進(jìn)程存在密切的聯(lián)系[8,17-19]。Gum等[17]利用對(duì)乙酰氨基酚(acetaminophen,APAP)介導(dǎo)的藥物性肝損傷模型進(jìn)行研究，發(fā)現(xiàn) Keap1-Nrf2-ARE通路激活能減少肝損傷時(shí)ROS以及脂質(zhì)過氧化物的產(chǎn)生，提示Keap1-Nrf2-ARE信號(hào)通路可能與相關(guān)肝臟疾病存在密切的關(guān)系。Bishayee等[18]發(fā)現(xiàn)，同時(shí)采用致癌致突變衍生物2-氨基-3-甲基咪唑[4,5-9]喹啉處理裸鼠和Nrf2缺陷鼠時(shí)，Nrf2缺陷鼠肝癌發(fā)生率明顯高于野生型小鼠，說明Keap1-Nrf2-ARE信號(hào)通路在肝癌發(fā)生中發(fā)揮重要作用。Sid等[19]也得到了類似結(jié)果，發(fā)現(xiàn)實(shí)驗(yàn)采用的藥物5-氨基咪唑-4-甲酰胺1-β-D-呋喃糖苷(5-aminoimidazole-4-carboxamide1-β-D-ribofuranoside, AICAR)可以通過誘導(dǎo)Nrf2 基因表達(dá)，從而調(diào)節(jié)HCC細(xì)胞的氧化還原狀態(tài)，發(fā)揮減輕肝細(xì)胞損傷的作用，但一旦將Nrf2 基因沉默則會(huì)解除AICAR的保肝作用。這些報(bào)道顯示，在HCC中，Keap1-Nrf2-ARE信號(hào)通路可以調(diào)節(jié)下游相關(guān)因子的表達(dá)，從而調(diào)控HCC的發(fā)展。

Fig 1 Related regulatory pathways of ferroptosis in HCC

近年的研究發(fā)現(xiàn)，p62-Keap1-Nrf2信號(hào)通路對(duì)HCC的影響與鐵死亡存在緊密的聯(lián)系。Sun等[8]報(bào)道，干擾p62表達(dá)會(huì)增強(qiáng)愛拉斯汀(erastin)/索拉非尼誘導(dǎo)的HCC細(xì)胞鐵死亡；此外，在Nrf2 shRNA HCC細(xì)胞腫瘤移植小鼠以及Nrf2 shRNA HCC細(xì)胞實(shí)驗(yàn)中，Nrf2敲低可以增強(qiáng)愛拉斯汀/索拉非尼抗HCC的作用。這些結(jié)果表明，在愛拉斯汀/索拉非尼誘導(dǎo)的HCC細(xì)胞鐵死亡中，p62-Keap1-Nrf2信號(hào)通路扮演著重要角色?？偨Y(jié)p62-Keap1-Nrf2對(duì)HCC過程中鐵死亡的具體調(diào)節(jié)機(jī)制為[8]：在細(xì)胞正常狀態(tài)下，Nrf2與Keap1特異性結(jié)合于細(xì)胞質(zhì)中，此時(shí)Nrf2的活性受到抑制，細(xì)胞處于穩(wěn)定狀態(tài)。但當(dāng)細(xì)胞損傷癌變時(shí)，p62可以通過使Keap1失活，從而防止Nrf2降解，促進(jìn)其激活、轉(zhuǎn)位、入核。入核的Nrf2與Maf蛋白等形成二聚體，并與抗氧化反應(yīng)元件(antioxidant response element, ARE)結(jié)合，從而激活下游調(diào)節(jié)鐵和ROS代謝相關(guān)基因的表達(dá)，包括醌氧化還原酶1(quinone oxidoreductase 1，NQO1)、血紅素氧合酶-1(heme oxygenase-1，HO-1)、鐵蛋白重鏈1(ferritin heavy chain1,FTH1)等，由于鐵死亡主要表征為鐵依賴性脂質(zhì)過氧化物的聚集，而這些基因的表達(dá)能阻止鐵死亡的發(fā)生。總之，p62-Keap1-Nrf2主要對(duì)其下游的鐵和ROS代謝相關(guān)基因的表達(dá)進(jìn)行調(diào)節(jié)，從而調(diào)控鐵死亡的發(fā)生，進(jìn)而影響HCC的發(fā)生、發(fā)展。

2.2p53信號(hào)通路調(diào)控鐵死亡p53是一種腫瘤抑制基因，抑癌基因p53的突變失活是肝細(xì)胞生物學(xué)特性發(fā)生改變的核心分子事件。正常情況下，p53能夠介導(dǎo)相關(guān)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)，從而調(diào)控細(xì)胞的生長、分化、凋亡等過程，達(dá)到維持細(xì)胞基因穩(wěn)定性的目的。而在肝臟損傷癌變時(shí)，p53基因會(huì)發(fā)生突變，突變型的p53蛋白會(huì)在肝癌組織中堆積，通過與野生型p53的雜合型聚合，或反而獲得原癌基因激活功能，使野生型p53基因誘導(dǎo)凋亡、阻滯細(xì)胞周期及DNA修復(fù)功能受損，導(dǎo)致凋亡逃逸和細(xì)胞的過度增殖，最終加劇HCC的發(fā)生、發(fā)展。

2.3Rb信號(hào)通路調(diào)控鐵死亡在HCC發(fā)生、發(fā)展時(shí)，會(huì)有許多相關(guān)基因/蛋白表達(dá)以及通路異常，而最常發(fā)生的是Rb腫瘤抑制通路異常。Rb蛋白是調(diào)節(jié)真核細(xì)胞多種基因轉(zhuǎn)錄功能的蛋白家族成員之一，它主要作為細(xì)胞增殖、細(xì)胞周期進(jìn)程的負(fù)性調(diào)節(jié)因子。

目前臨床數(shù)據(jù)表明，肝炎病毒感染導(dǎo)致的HCC患者肝臟樣本中Rb蛋白水平是降低的[24]；體內(nèi)研究方面，小鼠模型實(shí)驗(yàn)揭示Rb功能的失效可以直接促進(jìn)肝癌的發(fā)生，這些都證明Rb蛋白在HCC發(fā)展過程中至關(guān)重要[25]。體外研究方面，Louandre等[10]研究證實(shí)，與未進(jìn)行索拉非尼處理的HCC細(xì)胞相比，使用索拉非尼處理過的HCC細(xì)胞Rb表達(dá)量明顯降低，而且死亡率是未處理組的2～3倍；接著，他們采用HCC細(xì)胞腫瘤移植小鼠的體內(nèi)實(shí)驗(yàn)以及 shRb Huh7細(xì)胞的體外實(shí)驗(yàn)，闡明了Rb是如何調(diào)節(jié)索拉非尼誘導(dǎo)的HCC細(xì)胞鐵死亡的。索拉非尼能夠誘導(dǎo)HCC細(xì)胞鐵死亡的主要原因是增加線粒體ROS產(chǎn)生，而Rb失活會(huì)增加線粒體ROS，增強(qiáng)氧化應(yīng)激，從而加劇鐵死亡?？傊?，這些結(jié)果說明，Rb蛋白在調(diào)節(jié)HCC細(xì)胞的鐵死亡中起著至關(guān)重要的作用，但是其具體的分子機(jī)制有待進(jìn)一步探索研究。

2.4CISD1信號(hào)通路調(diào)控鐵死亡近年來有實(shí)驗(yàn)研究顯示，CDGSH鐵硫域1(CISD1，也稱為mitoNEET)在HCC的發(fā)生、發(fā)展中扮演著重要的角色[11]。CISD1廣泛表達(dá)于線粒體豐富的組織(如肝臟和心臟)，是一種含鐵線粒體膜外蛋白[11]，能夠功能性調(diào)節(jié)線粒體鐵的吸收，以及呼吸能力。CISD1與肝癌的發(fā)展是密切相關(guān)的，一旦缺失會(huì)造成線粒體內(nèi)鐵的積累以及隨后發(fā)生的氧化損傷。這些結(jié)果顯示，CISD1在HCC細(xì)胞線粒體鐵代謝中發(fā)揮重要作用。

Yuan等[11]最新的研究結(jié)果表明，CISD1可能是通過調(diào)控鐵死亡，對(duì)HCC的發(fā)生、發(fā)展產(chǎn)生影響。他們采用經(jīng)典鐵死亡誘導(dǎo)劑愛拉斯汀處理人類HCC細(xì)胞(如HepG2、Hep3B)，發(fā)現(xiàn)能夠鐵依賴性地促進(jìn)CISD1表達(dá)；通過基因?qū)W手段(CISD1 shRNA)抑制CISD1的表達(dá)，結(jié)果顯示HCC細(xì)胞中鐵介導(dǎo)的線粒體脂質(zhì)過氧化會(huì)增加，加劇愛拉斯汀誘導(dǎo)的鐵死亡；與此相反，采用CISD1的鐵硫簇穩(wěn)定劑吡格列酮處理HCC細(xì)胞，結(jié)果顯示吡格列酮可以抑制線粒體鐵的吸收、脂質(zhì)過氧化以及隨后發(fā)生的鐵死亡。這些結(jié)果表明，CISD1在HCC發(fā)生、發(fā)展過程中可以通過防止線粒體損傷，從而對(duì)鐵死亡產(chǎn)生負(fù)調(diào)節(jié)作用。其中，CISD1調(diào)控鐵死亡的機(jī)制主要是CISD1可以減少線粒體鐵離子聚集，CISD1缺失則會(huì)導(dǎo)致線粒體鐵超載，鐵離子會(huì)介導(dǎo)芬頓反應(yīng)產(chǎn)生脂質(zhì)過氧化物，從而誘導(dǎo)鐵死亡的發(fā)生?？傊?，在HCC發(fā)生、發(fā)展過程中，可以通過靶向抑制CISD1的表達(dá)來增強(qiáng)細(xì)胞線粒體脂質(zhì)過氧化，從而誘導(dǎo)鐵死亡發(fā)生，最終調(diào)控HCC的發(fā)展進(jìn)程。

除了上述提及的調(diào)控HCC中鐵死亡的分子機(jī)制，最近Houessinon等[12]研究顯示，金屬硫蛋白-1 (metallothionein-1，MT1)可以作為索拉非尼(鐵死亡誘導(dǎo)劑)處理HCC細(xì)胞后氧化還原代謝改變的生物標(biāo)志物，并且鑒定索拉非尼作用于含有133堿基對(duì)的區(qū)域，該區(qū)域位于MT1G啟動(dòng)子轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)上游。更有趣的是，MT1G啟動(dòng)子區(qū)域含有Nrf2識(shí)別的ARE結(jié)構(gòu)，于是，他們進(jìn)一步采用Nrf2 siRNA技術(shù)干擾Huh7細(xì)胞中Nrf2的表達(dá)，結(jié)果顯示Nrf2 siRNA可以明顯抑制索拉非尼對(duì)MT1G的誘導(dǎo)作用。這些數(shù)據(jù)結(jié)果表明，在HCC發(fā)展進(jìn)程中，調(diào)節(jié)MT1G的表達(dá)可以對(duì)鐵死亡產(chǎn)生調(diào)控作用，而且這一作用的產(chǎn)生與Nrf2的表達(dá)密切相關(guān)。

3 總結(jié)

[1] Hirokawa F, Hayashi M, Asakuma M, et al. Risk factors and patterns of early recurrence after curative hepatectomy for hepatocellular carcinoma[J].SurgOncol, 2016,25(1): 24-9.

[2] Shang R Z, Qu S B, Wang D S. Reprogramming of glucose metabolism in hepatocellular carcinoma: progress and prospects [J].WorldJGastroenterol, 2016,22(45):9933-43.

[3] 張自力，趙士峰，許文萱，等.細(xì)胞因子信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)抑制分子-3在肝纖維化中的作用及研究進(jìn)展[J].中國藥理學(xué)通報(bào),2015,31(12):1646-51.

[3] Zhang Z L, Zhao S F, Xu W X, et al. The role and progress of cytokine signal transduction inhibitor -3 in liver fibrosis [J].ChinPharmacolBull, 2015,31(12): 1646-51.

[4] Xie Y, Hou W, Song X, et al. Ferroptosis: process and function [J].CellDeathDiffer, 2016,23(3): 369-79.

[5] Dixon S J, Lemberg K M, Lamprecht M R, et al. Ferroptosis: an iron-dependent form of nonapoptotic cell death [J].Cell, 2012,149(5):1060-72.

[6] Yang W S, SriRamaratnam R, Welsch M E, et al. Regulation of ferroptotic cancer cell death by GPX4 [J].Cell, 2014,156: 317-31.

[7] Cao J Y, Dixon S J. Mechanisms of ferroptosis [J].CellMolLifeSci, 2016,73:2195-209.

[8] Sun X, Ou Z, Chen R, et al. Activation of the p62-Keap1-NRF2 pathway protects against ferroptosis in hepatocellular carcinoma cells [J].Hepatology, 2016,63(1):173-84.

[9] Jiang L, Kon N, Li T, et al. Ferroptosis as a p53-mediated activity during tumour suppression [J].Nature, 2015,520(7545): 57-62.

[10] Louandre C, Marcq I, Bouhlal H , et al. The retinoblastoma (Rb) protein regulates ferroptosis induced by sorafenib in human hepatocellular carcinoma cells [J].CancerLett, 2015,356: 971-7.

[11] Yuan H, Li X, Zhang X, et al. CISD1 inhibits ferroptosis by protection against mitochondrial lipid peroxidation [J].BiochemBiophysResCommun, 2016,478(2):838-44.

[12] Houessinon A, Fran?ois C, Sauzay C, et al. Metallothionein-1 as a biomarker of altered redox metabolism in hepatocellular carcinoma cells exposed to sorafenib [J].MolCancer, 2016,15(1):38.

[13] Cao L, Quan X B, Zeng W J, et al. Mechanism of hepatocyte apoptosis[J].JCellDeath, 2016,9:19-29.

[14] Najafov A, Chen H, Yuan J. Necroptosis and cancer[J].TrendsCancer, 2017,3(4):294-301.

[15] Galluzzi L, Baehrecke E H, Ballabio A, et al. Molecular definitions of autophagy and related processes [J].EMBOJ, 2017,36(13):1811-36.

[16] Perz J F, Armstrong G L, Farrington L A, et al. The contributions of hepatitis B virus and hepatitis C virus infections to cirrhosis and primary liver cancer worldwide [J].JHepatol, 2006,45(4): 529-38.

[17] Gum S I, Cho M K. Recent updates on acetaminophen hepatotoxicity: the role of Nrf2 in hepatoprotection [J].ToxicolRes, 2013,29:165-72.

[18] Bishayee A, Bhatia D, Thoppil R J. Pomegranate-mediated chemoprevention of experimental hepatocarcinogenesis involves Nrf2-regulated antioxidant mechanisms [J].Carcinogenesis, 2011,32(6): 888-96.

[19] Sid B, Glorieux C, Valenzuela M, et al. AICAR induces Nrf2 activation by an AMPK-independent mechanism in hepatocarcinoma cells [J].BiochemPharmacol, 2014,91(2):168-80.

[20] Wang S J, Ou Y, Jiang L, et al. Ferroptosis: a missing puzzle piece in the p53 blueprint [J]MolCellOncol, 2015,3(3):e1046581.

[21] Ou Y, Wang S J, Li D, et al. Activation of SAT1 engages polyamine metabolism with p53-mediated ferroptotic responses [J].ProcNatlAcadSciUSA, 2016,113(44):E6806-12.

[22] Gao M, Monian P, Quadri N, et al. Glutaminolysis and transferrin regulate ferroptosis [J].MolCell, 2015,59(2):298-308.

[23] Jennis M, Kung C P, Basu S, et al. An African-specific polymorphism in the TP53 gene impairs p53 tumor suppressor function in a mouse model [J].GenesDev, 2016,30(8):918-30.

[24] Munakata T, Liang Y, Kim S, et al. Hepatitis C virus induces E6AP-dependent degradation of the retinoblastoma protein [J] .PLoSPathog, 2007,3(9):1335-47.

[25] Mayhew C N, Carter S L, Fox S R, et al. RB loss abrogates cell cycle control and genome integrity to promote liver tumorigenesis [J].Gastroenterology, 2007,133(3):976-84.