羅梓垠，高 慧，項冰倩，邱曉曉，戴雍月△，王萬鐵△

（1.溫州醫(yī)科大學(xué)缺血-再灌注損傷研究所，浙江 溫州325035；2.湖北省中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院病理科，武漢430015）

肺缺血／再灌注損傷（lung ischemia／reperfusion injury，LIRI）是個復(fù)雜的病理生理過程，主要表現(xiàn)為再灌注后肺血管阻力增加、肺水腫、肺泡損傷及微血管通透性增加，嚴重影響患者預(yù)后［1-2］。CCAAT／增強子結(jié)合蛋白同源蛋白（CHOP）是C／EBP轉(zhuǎn)錄因子的家族成員之一，是內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激（endoplasmic reticulum stress，ERS）的一個特異轉(zhuǎn)錄因子。CHOP主要分布于細胞質(zhì)中，正常情況下含量很低。但當ERS發(fā)生時，CHOP會大量表達，過量表達的CHOP會誘導(dǎo)細胞凋亡［3］。本實驗室前期研究發(fā)現(xiàn)，LIRI能激活ERS，活化CHOP凋亡通路，導(dǎo)致小鼠肺組織細胞凋亡。通過RNA干擾使CHOP進行基因沉默，LIRI程度減輕，提示抑制ERS相關(guān)通路是治療LIRI的有效作用靶點之一［4］。右美托咪定（dexmedetomidine，Dex）是一種新型的麻醉類輔助用藥，能與α2腎上腺素受體結(jié)合發(fā)揮鎮(zhèn)靜、鎮(zhèn)痛作用，有研究表明Dex能減輕多種器官的缺血／再灌注損傷［5］。本研究體外模擬LIRI方法建立A549（起源于肺泡II型上皮細胞系）細胞的缺氧／復(fù)氧（hypoxia／reoxygenation，H／R）損傷模型，旨在觀察Dex對A549細胞H／R損傷時細胞凋亡和CHOP表達的影響及可能機制，以期為Dex臨床治療LIRI提供充分的實驗依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 主要試劑與儀器

F12K培養(yǎng)基和胎牛血清（Gibco），右美托咪定（江蘇恒瑞醫(yī)藥股份有限公司），CCK-8試劑盒（日本同仁），TUNEL檢測試劑盒（Roche），DAB顯色試劑盒（北京中杉金橋生物科技有限公司），Trizol（Invitrogen），逆轉(zhuǎn)錄試劑盒、PCR試劑盒（Fermentas Life Science），BCA蛋白濃度測定試劑盒（碧云天生物技術(shù)研究所），一抗：兔抗GAPDH多克隆IgG抗體（杭州賢至生物科技有限公司），CHOP、caspase-3、Grp78（Cell Signaling Technology），二抗：HRP偶聯(lián)山羊抗兔IgG二抗（Cell Signaling Technology）。其余試劑均為市售分析純。

常氧培養(yǎng)箱和低氧培養(yǎng)箱（Thermo），倒置相差顯微鏡（Olympus），超凈工作臺（蘇凈安泰），低溫高速離心機（Eppendorf），酶標儀（Biotek），搖床（Thermo），熒光化學(xué)發(fā)光成像系統(tǒng)（上海勤翔科學(xué)儀器有限公司），超低溫冰箱（Thermo），梯度 PCR儀（Bio-Rad）。

1.2 A549細胞的培養(yǎng)

在人肺泡Ⅱ型上皮細胞系A(chǔ)549細胞（購于中國科學(xué)院細胞庫）中加入新配制的含10%胎牛血清的F12K培養(yǎng)液（含糖）。F12K培養(yǎng)液中含100 U／ml青霉素和 100μg／ml鏈霉素。A549細胞常規(guī)置于37℃、5%CO2常氧培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。待細胞貼壁達80%以上進行傳代，每2 d按1∶3傳代，待傳代3～4次后用于實驗。

1.3 細胞模型的建立

采用隨機數(shù)字表法，將A549細胞分成4組（n＝10）：常氧培養(yǎng)組（N組），Dex常氧組（D組），缺氧／復(fù)氧組（H組），缺氧／復(fù)氧+Dex組（HD組）。依據(jù)參考文獻建立A549細胞H／R損傷模型［6］：將生長至對數(shù)生長期的A549細胞的完全培養(yǎng)基更換成無血清的F12K培養(yǎng)基，在常氧培養(yǎng)箱中預(yù)處理1 h。然后，將細胞培養(yǎng)液換為無糖的OGD液［7］，并置于低氧培養(yǎng)箱內(nèi)孵育6 h。之后將OGD液再次更換為無血清的F12K培養(yǎng)基，于常氧培養(yǎng)箱內(nèi)復(fù)氧處理24 h。D組和HD組在造模開始時加入Dex至終濃度 1 nmol／L［8］。

1.4 細胞形態(tài)學(xué)觀察

造模結(jié)束后，將A549細胞置于倒置顯微鏡下觀察其生長狀況及形態(tài)學(xué)變化。

1.5 CCK-8法檢測細胞活力

用胰酶消化，將A549細胞吹打成細胞懸液，按104cells／well將其接種于96孔板中。每組設(shè)6個復(fù)孔，且加設(shè)空白對照組。接種細胞后，周圍一圈加PBS，防止培養(yǎng)液蒸發(fā)。置細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，待貼壁生長良好后開始造模。從培養(yǎng)箱中取出96孔板，棄去舊培養(yǎng)基，按每孔110μl將CCK-8混合液加入96孔板，避光、37℃孵育30 min，用酶標儀在450 nm波長處測定吸光度值。

1.6 TUNEL法檢測細胞凋亡

取處于對數(shù)生長期的A549細胞，消化后置6孔板內(nèi)進行細胞爬片，細胞生長良好后進行造模。造模結(jié)束后，按TUNEL檢測試劑盒說明書進行操作，在光學(xué)顯微鏡下（×100）觀察細胞形態(tài)，胞核呈棕褐色者為凋亡細胞，每張片至少觀察500個細胞，計數(shù)每100個細胞中的凋亡細胞數(shù)，再取其平均值，得出凋亡指數(shù)（apoptotic index，AI）。

1.7 Western blot法檢測 A549細胞 CHOP、Grp78、caspase-3蛋白的表達水平

用細胞刮刀收集A549細胞，加入預(yù)冷的裂解液100μl（PMSF：RAPI＝1∶100），反復(fù)吹打。置于冰上40 min，使其充分裂解。低溫離心，取上清液，用BCA法測定蛋白質(zhì)濃度，繪制標準曲線，樣品蛋白配制成2μg／ml，繼之將其煮沸變性。配制瓊脂糖凝膠進行電泳，轉(zhuǎn)膜至PVDF膜。再將用TBS浸濕的膜放至5%脫脂奶粉中，室溫下封閉2 h。TBST漂洗，加入一抗（抗 CHOP／Grp78／caspase-3／GAPDH抗體，CHOP／caspase-3 1∶500稀釋，Grp78／GAPDH 1∶1 000稀釋），4℃孵育過夜。TBST洗滌7 min×3次，再加入HRP標記的二抗（測定CHOP／Grp78／caspase-3／GAPDH時二抗均以1∶8 000稀釋），室溫孵育 1 h。TBST洗滌 7 min／次、×3次，滴加發(fā)光液，反應(yīng) 2 min，用熒光化學(xué)發(fā)光成像系統(tǒng)進行曝光，再用凝膠分析軟件分析內(nèi)參蛋白與目的蛋白吸光度值。

1.8 RT-PCR檢測 A549細胞 CHOP、Grp78 mRNA的表達水平

在每組細胞皿里加Trizol充分勻漿，使細胞完全裂解。提取總RNA并測定RNA濃度，按照逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA。引物由上海捷瑞生物工程有 限公司合成，CHOP：Left：5’-CCACTCTTGACCCTGCTTCTC-3’，Right：5’-CTAGCTGTGCCACTTTCCTTT-3’，擴 增 片 段 長 度 246 bp。Grp78： Left：5’-GTCCTATGTCGCCTTCACTCC-3’，Right：5’-AAATGTCTTTGTTTGCCCACC-3’，擴增片段長 度 232 bp。GAPDH： Left：5’-ATCCCATCACCATCTTCCAG-3’， Right： 5’-TTGAGGCTGTTGTCATACTTCT-3’，擴增片段長度220 bp。采用熒光實時PCR儀進行擴增。PCR參數(shù)：94℃，3 min；94℃，30 s；CHOP，52℃／Grp78 59℃／GAPDH 54℃，30 s；72℃，1min；共 33個循環(huán)，72℃，5min終止延伸。配制1.5%瓊脂糖凝膠，每孔加入5μl PCR產(chǎn)物，電泳條件為100 V，40min，紫外線照射掃描結(jié)果并保存。Quantity One軟件分析電泳條帶灰度值，以目的基因擴增產(chǎn)物密度與GAPDH基因擴增產(chǎn)物密度之比表示目的基因表達水平。

1.9 統(tǒng)計學(xué)處理

所有計量數(shù)據(jù)以均數(shù)±標準差（）表示，采用SPSS 17.0統(tǒng)計軟件進行分析，并進行正態(tài)性檢驗。多組樣本均數(shù)間的比較進行方差齊性檢驗，組間兩兩比較應(yīng)用單因素方差分析（one-way ANOVA）。方差齊性者兩兩比較采用LSD-t法，方差不齊者兩兩比較進行Dunnet’t3檢驗。

2 結(jié)果

2.1 Dex對A549細胞形態(tài)學(xué)的影響

倒置顯微鏡下觀察發(fā)現(xiàn)，N組和D組未見懸浮細胞，A549細胞生長良好，胞體透亮，胞核完整。H／R損傷后，H組A549細胞呈不規(guī)則多邊形生長，細胞發(fā)生融合現(xiàn)象，核固縮，胞體變暗；細胞間隙增大，貼壁細胞數(shù)減少。與H組比較，HD組A549細胞數(shù)增多，細胞形態(tài)變化不明顯（圖1）。

2.2 Dex對A549細胞活力的影響

常氧培養(yǎng)條件下，N組和D組細胞活力的吸光度值分別為 1.358±0.104，1.371±0.046，二者無統(tǒng)計學(xué)差異（P＞0.05）。經(jīng) H／R損傷后，H組吸光度值為0.752±0.096，與N組比較，吸光度值明顯下降（P＜0.01）。經(jīng) Dex處理后，與 H組相比，HD組吸光度值上調(diào)，為 1.057±0.045，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01），表明 Dex能增加 A549細胞 H／R損傷后的細胞活力（圖2）。

Fig.1 The historical changes of A549 cells in each group under the invertedmicroscope（×100）

Fig.2 The changes of expression of absorbance value and AIvalue in all groups

2.3 Dex對A549細胞凋亡率的影響

在常氧培養(yǎng)條件下，N組和D組AI值分別為3.500±1.080和 4.300±1.494，兩者比較無統(tǒng)計學(xué)差異（P＞0.05）。經(jīng) H／R損傷后，H組 AI值為35.400±3.534，與 N組比較，H組 AI值升高顯著（P＜0.01）。經(jīng) Dex處理后，HD組 AI值下降為 17.900±3.071，與 H組比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01），這表明Dex能降低H／R損傷A549細胞的AI值，減少細胞凋亡（圖 2，3）。

2.4 Dex對 CHOP、Grp78和 caspase-3蛋白表達的影響

Western blot結(jié)果顯示，與 N組相比，D組CHOP、Grp78和caspase-3蛋白表達水平無明顯統(tǒng)計學(xué)差異（P＞0.05）。經(jīng) H／R損傷后，與 N組相比，H組中CHOP、Grp78和caspase-3蛋白表達水平均明顯升高（P＜0.01）。經(jīng) Dex處理后，HD組 CHOP、caspase-3蛋白水平顯著下降，與H組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01，圖 4）。

Fig.3 The apoptosis index detected by TUNEL in each group（×100）

Fig.4 The expression levels of CHOP、Grp78、caspase-3 proteins in various groups

2.5 Dex對CHOP和Grp78mRNA表達的影響

RT-PCR結(jié)果顯示，與 N組相比，D組 Grp78、CHOPmRNA表達水平無明顯統(tǒng)計學(xué)差異（P＞0.05）。經(jīng) H／R損傷后，H組中 Grp78、CHOPmRNA表達水平均明顯升高（P＜0.01）。經(jīng)Dex處理后，與H組相比，HD組 Grp78 mRNA表達上升（P＜0.01），CHOPmRNA表達顯著下降，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01，圖 5）。

Fig.5 The expression levels of Grp78、CHOPmRNA in various groups

3 討論

肺泡II型上皮細胞是肺泡的重要組成部分，盡管僅占肺泡表面積的5%，但對維持肺泡結(jié)構(gòu)和功能具有重要作用。肺泡II型上皮細胞的凋亡和壞死數(shù)量直接決定LIRI的嚴重程度及預(yù)后。由于肺泡II型上皮細胞體外培養(yǎng)較為困難，其性狀不穩(wěn)容易向肺泡I型上皮細胞轉(zhuǎn)化，故很多體外實驗研究采用A549細胞來替代肺泡 II型上皮細胞［9］。H／R損傷模型的建立是先對A549細胞進行一定時間的氧糖剝奪，低氧造模時，A549細胞培養(yǎng)液被更換成OGD液，并置于低氧培養(yǎng)箱中進行低氧處理以模擬在體肺組織缺血損傷；隨后將OGD液更換成細胞培養(yǎng)液，將培養(yǎng)皿放回常氧培養(yǎng)箱中模擬在體的再灌注損傷，這是國內(nèi)外研究常用的離體組織器官缺血／再灌注損傷的造模方法之一［8，10］。本研究觀察到，造模后H組細胞數(shù)量減少、細胞形態(tài)發(fā)生改變。采用CCK-8法檢測細胞活力，與N組相比，H組細胞吸光度值顯著下降，細胞活力降低。TUNEL結(jié)果顯示，與N組比較，H組凋亡細胞數(shù)明顯增多，AI值升高，提示H／R損傷造模成功。

引起細胞凋亡的因素有很多，如氧化應(yīng)激、炎癥反應(yīng)、細胞內(nèi)鈣穩(wěn)態(tài)失衡等。有研究發(fā)現(xiàn)，細胞凋亡與LIRI有密切聯(lián)系，且細胞凋亡在LIRI中起到重要作用［11］。ERS是細胞凋亡的途徑之一。葡萄糖調(diào)節(jié)蛋白 78（glucose-regulated protein 78，Grp78）是內(nèi)質(zhì)網(wǎng)上3種伴侶蛋白之一，在非應(yīng)激狀態(tài)下處于無活性狀態(tài)。當ERS發(fā)生時，Grp78會與3種內(nèi)質(zhì)網(wǎng)跨膜蛋白 PERK（protein kinase R like ER kinase）、IRE1（inositol-requiring protein-1）和 ATF6（activating transcription factor 6）解離，使其活化，介導(dǎo)發(fā)生未折疊蛋白反應(yīng)（unfolded protein response，UPR），與未折疊或錯誤折疊蛋白結(jié)合，維持內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)態(tài)［12］。PERK、ATF6及IRE1都能誘導(dǎo)CHOP轉(zhuǎn)錄，使細胞內(nèi)CHOP大量表達，促使細胞凋亡［13］。caspase-3是 Caspase家族中重要的凋亡執(zhí)行者，是多個凋亡信號通路的一個共同的下游效應(yīng)酶，其活化是凋亡進入不可逆階段的標志［14］。本研究表明，N組 CHOP、Grp78、caspase-3蛋白和 CHOP、Grp78mRNA表達均處于較低水平。經(jīng) H／R干預(yù)后，H組 AI值上調(diào)，CHOP、Grp78、caspase-3蛋白和 CHOP、Grp78mRNA的表達水平急速增加，提示H／R損傷會誘發(fā) ERS，導(dǎo)致細胞凋亡。

右美托咪定（Dex）通過多種途徑對重要器官發(fā)揮一定的保護作用，主要途徑有抑制炎癥反應(yīng)、抑制血管收縮、減輕氧化應(yīng)激水平、增強機體免疫力等［15］，具有廣闊的應(yīng)用前景。袁培根等［16］研究證實，Dex能通過α2受體上調(diào)Nrf2核內(nèi)表達，啟動有利基因以對抗氧化作用，從而達到緩解肢體I／R損傷的作用。葛東建等［17］研究發(fā)現(xiàn)，Dex預(yù)處理能激活p-Akt信號通路減輕急性肺損傷，發(fā)揮對肺的保護作用。本研究顯示，經(jīng)Dex干預(yù)后，HD組A549細胞Grp78蛋白與mRNA表達增加，其機制可能與Grp78活性增加以促進蛋白折疊，試圖恢復(fù)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)功能，抑制內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激，發(fā)揮保護細胞作用。這亦與調(diào)控內(nèi)質(zhì)網(wǎng)相關(guān)凋亡通路等有密切關(guān)系。CHOP信號通路是內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激重要途徑之一，與H組比較，HD組CHOP、caspase-3蛋白，CHOPmRNA表達水平明顯下降，細胞活力增加，細胞損傷程度減輕、凋亡細胞數(shù)明顯減少。提示Dex能抑制ERS，對抗細胞凋亡，減輕H／R損傷。

綜上所述，Dex對H／R損傷A549細胞具有一定的保護作用，其機制可能與減少過度ERS時CHOP表達所引起的細胞凋亡有關(guān)。本研究在離體實驗中證實Dex對LIRI的保護作用，進一步闡明肺組織細胞凋亡的分子機制，為Dex治療LIRI提供理論依據(jù)。

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