王旭燾，陳思思，齊敏友

（浙江工業(yè)大學(xué)藥學(xué)院藥理研究所，杭州310014）

糖尿病除引起心、腦、腎、眼器官的損傷外，其所致的肝損傷日益受到學(xué)術(shù)界的重視。統(tǒng)計顯示，21%～78%的2型糖尿病（type 2 diabetesmellitus，T2DM）患者通常伴有肝內(nèi)脂肪浸潤，部分患者可發(fā)展為脂肪性肝炎甚至肝硬化［1］。高血糖介導(dǎo)的氧化應(yīng)激在糖尿病性肝損傷的發(fā)生發(fā)展中起著關(guān)鍵作用［2］。熊果酸（ursolic acid，UA）是一種五環(huán)三萜類化合物，現(xiàn)代藥理研究證實，具有降血糖、調(diào)血脂、護肝等作用［3-5］。Jang［6］等報道，UA能夠通過抑制糖尿病小鼠肝臟多元醇途徑，對肝臟起保護用。但是UA是否能夠通過降低糖尿病小鼠肝組織氧化應(yīng)激水平而減輕肝組織損傷，少有報道。本實驗通過建立高脂飼料聯(lián)合鏈脲佐菌素（streptozotocin，STZ）誘導(dǎo)的糖尿病小鼠模型，觀察UA對肝功能及肝組織氧化應(yīng)激指標的影響，研究UA對糖尿病小鼠肝損傷的保護作用及其機制，為熊果酸治療糖尿病性肝損傷提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試劑與設(shè)備

鏈脲佐菌素（HPLC≥98%，美國Sigma公司）；檸檬酸鈉緩沖溶液（澤衡生物科技有限公司）；熊果酸（HPLC≥98%，西安開來生物工程有限公司）；高脂飼料（含70%普通飼料，15%蔗糖，15%豬油），血糖儀、血糖試紙（Onetouch ultraeasy，美國Johnson公司）；總膽固醇、甘油三酯、谷丙轉(zhuǎn)氨酶、谷草轉(zhuǎn)氨酶、超氧化物歧化酶、丙二醛試劑盒（南京建成生物工程研究所）；電子天平（AL104，瑞士 Mettler Toledo公司）；超低溫冰箱（702，美國 Thermo公司）；恒溫水浴箱（WB22LA，德國 Memmert公司）；多功能酶標儀（Synergy H1，美國 Bio-Tek公司）；倒置熒光顯微鏡（TI-S，日本Nikon公司）；臺式高速冷凍離心機（Biofuge pico，德國 Heraeus）。

1.2 實驗動物和模型建立

實驗使用雄性ICR小鼠共30只，SPF級，體重（20±2）g，由浙江省實驗動物中心提供，合格證號：SCXK（浙）2014-0001。小鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)1周。隨機選取20只小鼠高脂飼料喂養(yǎng)6周后，STZ（30mg／kg）腹腔注射連續(xù) 5 d，9 d后測空腹血糖，大于 11.1 mmol／L視為糖尿病模型，將其隨機分為模型組和熊果酸組（100mg／kg［7-8］），每組 10只；剩余 10只小鼠設(shè)為對照組。熊果酸研磨成粉，用生理鹽水制成混懸液，超聲混勻后灌胃（100 mg／kg），正常組和模型組以等體積生理鹽水灌胃，實驗第9周起連續(xù)8周。

1.3 一般指標檢測

小鼠末次給藥后，禁食12 h，稱重并測定空腹血糖。

1.4 樣本收集

血樣本留?。盒∈笳矍蛉⊙?，常溫靜置6 h，4℃離心（3 500 r／min，10 min），取上清，-20℃冰箱保存待用。肝組織樣本留?。禾幩佬∈?，迅速摘取肝臟，生理鹽水漂洗，取同側(cè)部位肝組織少許，置于4%多聚甲醛溶液中固定。取適量肝臟組織，用冷生理鹽水制成 10%均漿液，離心（3 000 r／min，10min），取上清液，-20℃冰箱保存待用。

1.5 生化指標檢測

按試劑盒說明書測定總膽固醇（total cholesterol，TC）、甘油三酯（triglyceride，TG）、谷丙轉(zhuǎn)氨酶（alanine aminotransferase，ALT）、谷草轉(zhuǎn)氨酶（aspartate transaminase，AST）、超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）、丙二醛（malondialdehyde，MDA）。

1.6 病理學(xué)檢查

肝組織用4%多聚甲醛溶液固定72 h后，乙醇梯度脫水、二甲苯透明、浸蠟、包埋、切片、進行HE染色，400倍光鏡下觀察。

1.7 統(tǒng)計學(xué)處理

采用GraphPad Prism 5.0軟件進行單因素方差分析（One way ANOVA）及Tukey檢驗進行多組間比較，以均數(shù) ±標準差（）表示。

2 結(jié)果

2.1 熊果酸對小鼠一般體征、體重和血糖的影響

對照組小鼠精神良好，毛色光亮，飲食攝水正常，體重逐漸增加。模型組小鼠精神不振，毛色發(fā)黃，多飲、多食、多尿，與對照組小鼠相比，16周后體重顯著降低（P＜0.01），空腹血糖顯著升高（P＜0.01）。熊果酸組小鼠精神較好，毛色較亮，多飲、多食、多尿癥狀明顯改善。與模型組小鼠比較，16周后熊果酸組小鼠體重有所增加，但無統(tǒng)計學(xué)差異，空腹血糖顯著降低（P＜0.01，表1）。結(jié)果表明，熊果酸能夠有效降低糖尿病小鼠血糖水平。

2.2 熊果酸對小鼠血清TC、TG含量的影響

相較于對照組小鼠，模型組小鼠TC、TG水平顯著升高（P＜0.01）。與模型組小鼠比較，熊果酸組小鼠 TC、TG水平明顯降低（P＜0.05，表 2）。提示熊果酸能夠有效調(diào)節(jié)糖尿病小鼠脂質(zhì)代謝紊亂。

Tab.1 Changes of body weight and fasting blood glucose before and after ursolic acid administration inmice（，n＝10）

Tab.1 Changes of body weight and fasting blood glucose before and after ursolic acid administration inmice（，n＝10）

BW：Body weight；FBG：Fasting blood glucose；UA：Ursolic acid**P＜0.01 vs control；＃＃P＜0.01 vs model

Group BW（g ）FBG（mmol／L）0Week 8Week 16Week Control 22.6±2.2 30.3±1.2 40.6±2.8 4.5±0.6 4.8±0.3 4.9±0.5 Model 22.8±2.0 34.7±3.8 28.4±3.9** 4.6±0.6 18.0±1.9** 18.9±3.1**UA 22.3±1.8 34.5±4.0 30.8±2.5** 4.1±0.9 17.8±1.8** 13.3±2.1**＃＃0Week 8Week 16Week

Tab.2 Effects of ursolic acid on level of TC and TG in serum（mmol／L，珋，n＝10）

Tab.2 Effects of ursolic acid on level of TC and TG in serum（mmol／L，珋，n＝10）

TC：Total cholesterol；TG：Triglyceride；UA：Ursolic acid*P＜0.05，**P＜0.01 vs control；＃P＜0.05 vs model

Group TC TG Control 2.2±0.5 1.2±0.3 Model 3.5±0.4** 1.9±0.4**UA 2.8±0.4*＃ 1.4±0.2＃

2.3 熊果酸對小鼠血清ALT、AST活性的影響

相較于對照組小鼠，模型組小鼠ALT、AST活性顯著升高（P＜0.01）。熊果酸組小鼠相較于模型組小鼠ALT、AST活性有不同程度下降（P＜0.05，P＜0.01，表3）。提示熊果酸能夠改善糖尿病小鼠的肝功能。

Tab.3 Effects of ursolic acid on the activity ALT and AST in serum（，n＝10）

Tab.3 Effects of ursolic acid on the activity ALT and AST in serum（，n＝10）

ALT：Alanine aminotransferase；AST：Aspartate transaminase；UA：Ursolic acid*P＜0.05，**P＜0.01 vs control； ＃P＜0.05，＃＃P＜0.01 vs model

Group ALT（U／L） AST（U／L ）Control 14.4±3.7 12.8±2.9 Model 44.0±7.8** 24.6±3.4**UA 23.1±6.5*＃＃ 19.6±3.0**＃

2.4 熊果酸對小鼠肝組織SOD活性與MDA含量的影響

相較于對照組小鼠，模型組小鼠SOD活力顯著降低（P＜0.01），MDA含量顯著增多（P＜0.01）。熊果酸組小鼠與模型組小鼠比較，SOD活力明顯升高（P＜0.05），MDA含量明顯減少（P＜0.05，表 4）。提示熊果酸能夠有效增強糖尿病小鼠肝組織的抗氧化功能。

Tab.4 Effects of ursolic acid on MDA and SOD in liver（，n＝10）

Tab.4 Effects of ursolic acid on MDA and SOD in liver（，n＝10）

SOD：Superoxide dismutase；MDA：Malondialdehyde；UA：Ursolic acid**P＜0.01 vs control；＃P＜0.05 vs model

Group SOD（U／mg prot） MDA（nmol／mg prot ）Control 117.7±19.1 1.4±0.1 Model 74.5±7.4** 1.8±0.3**UA 97.9±11.1＃ 1.5±0.1＃

2.5 熊果酸對小鼠肝組織結(jié)構(gòu)的影響

HE染色顯示，對照組肝小葉結(jié)構(gòu)清晰，肝索排列有序，肝竇規(guī)則；模型組部分肝細胞水腫，輕度脂肪變性，門管區(qū)可見淋巴細胞浸潤。熊果酸組肝細胞排列較為整齊，水腫不明顯，未見空泡變性，淋巴細胞少量存在（圖1）。提示熊果酸能夠延緩糖尿病小鼠肝組織的病變過程。

Fig.1 Effects of ursolic acid on pathological changes（HE×400）

3 討論

本實驗通過高脂飼料聯(lián)合小劑量STZ腹腔注射的方法誘導(dǎo)制備T2DM小鼠模型。高脂飲食使小鼠體內(nèi)產(chǎn)生胰島素抵抗，再通過小劑量STZ腹腔注射破壞部分胰島β細胞，使其體內(nèi)胰島素分泌相對不足，造成T2DM小鼠模型。實驗結(jié)果顯示，模型組小鼠空腹血糖顯著升高，表明T2DM模型建立成功。經(jīng)熊果酸干預(yù)后，小鼠空腹血糖明顯降低，提示熊果酸具有降血糖的作用。

T2DM常伴有脂質(zhì)代謝紊亂，高脂血癥是糖尿病性肝損傷的常見原因［9］。ALT、AST活性是檢測肝功能的常用指標，提示肝臟是否受到損傷。實驗結(jié)果提示，熊果酸具有調(diào)節(jié)脂質(zhì)代謝和改善肝功能的作用，能延緩肝臟的病變進程。

眾多研究發(fā)現(xiàn)，高血糖介導(dǎo)的氧化應(yīng)激在糖尿病性肝損傷的發(fā)生發(fā)展中起著關(guān)鍵作用［2］。當機體內(nèi)活性氧簇（reactive oxgen species，ROS）生成增加或抗氧化能力減弱時，過剩的ROS與大分子物質(zhì)發(fā)生脂質(zhì)過氧化反應(yīng)，形成脂質(zhì)過氧化物，如MDA等，致使細胞結(jié)構(gòu)和功能發(fā)生改變，引起肝細胞損傷［10］。SOD是一種內(nèi)源性抗氧化酶系，通過抑制自由基生成發(fā)揮抗氧化作用，保護肝細胞免受損傷。本實驗結(jié)果提示熊果酸能降低肝組織的氧化應(yīng)激水平，提高肝臟抗氧化能力。

綜上所述，熊果酸對糖尿病小鼠肝損傷具有保護作用，其機制可能與降血糖、調(diào)節(jié)血脂、降低肝組織的氧化應(yīng)激水平，提高肝臟抗氧化能力有關(guān)。由于目前針對糖尿病肝臟并發(fā)癥仍缺乏較好的治療手段和治療方法，因此研究熊果酸對糖尿病肝臟并發(fā)癥的作用機制，對開發(fā)中藥治療臨床糖尿病肝損傷具有重要的理論意義和實用價值。

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