李朝暉，張 穎，路 艷，陸慶明，謝曉華△

（解放軍總醫(yī)院南樓綜合外科，北京100853）

據(jù)WHO統(tǒng)計，全世界每年僅交通事故傷害就導致超過120萬人死亡［1］。嚴重的創(chuàng)傷失血（traumatic hemorrhage）是可以直接威脅生命的危急重癥，也是中青年人重要的致死原因。當機體受到嚴重創(chuàng)傷時，常因血容量丟失導致有效循環(huán)血量減少，引起嚴重微循環(huán)障礙，引發(fā)一系列延續(xù)性局部／全身創(chuàng)傷反應，造成臟器功能不可逆損傷，包括心肌組織，但其確切發(fā)生機制尚不清楚。目前已知，在心肌損傷的發(fā)生過程中，心肌細胞凋亡具有重要意義。本文通過在體觀察及體外心肌細胞培養(yǎng)研究，探討雙下肢骨折創(chuàng)傷失血反應可否誘導心肌細胞發(fā)生凋亡反應，以為下一步深入研究肢體創(chuàng)傷出血導致心肌損傷的發(fā)生機制奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 大鼠雙下肢骨折創(chuàng)傷失血模型的建立與分組

健康雄性SD大鼠20只，體重250～300 g（購自軍事醫(yī)學科學院動物中心），常規(guī)飼養(yǎng)條件下正常飲食飲水。大鼠隨機分為對照組和骨折創(chuàng)傷組（n＝10）。腹腔注射3%異戊巴比妥鈉（80 mg／kg體重）麻醉大鼠，使用自制重物墜落裝置致大鼠雙后肢股骨干粉碎性骨折。方法為：將大鼠固定在裝置底盤上，將重物升至固定高度后任其自由墜落，分別砸傷大鼠雙側(cè)股骨干致其閉合性粉碎性骨折，隨后尾動脈抽血約10ml，1 h后雙倍液體（生理鹽水）回輸，包扎，固定［2］。全部大鼠分別在創(chuàng)傷發(fā)生后 0、1、2、4、8、12、16、24及 48 h尾動脈取血，并于 48 h時處死大鼠，留取左室前壁心肌標本，液氮保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 心肌細胞損傷模型

取正常大鼠心臟，經(jīng)Langendorff裝置灌注，從灌流液中分離心肌細胞，置CO2培養(yǎng)箱中懸浮培養(yǎng)24 h后，加入創(chuàng)傷血清繼續(xù)培養(yǎng)48 h，構(gòu)建心肌損傷模型。

1.3 血清炎癥相關細胞因子的測定

在創(chuàng)傷后的不同時間點（創(chuàng)傷前和創(chuàng)傷后1、2、4、8、12、16、24及 48 h），分別取各組大鼠尾動脈血液，2 000～3 000 r／min離心 20 min，取血清，以備ELISA法測定。

1.4 心肌組織HE染色

心肌組織取材、固定、脫水、石蠟包埋、切片，常規(guī)蘇木素-伊紅染色，中性樹膠封固。

1.5 心肌細胞凋亡的測定

取心肌細胞制備切片，滅活內(nèi)源性過氧化物，生物素標記后，采用TUNEL法測定。

1.6 凋亡調(diào)控基因bcl-2／bax測定

取30mg心肌碾碎后，加入1 ml Trizol振搖，離心 12 000 r／min×15min（4℃），采用 RT-PCR法測定基因表達。引物序列為：baxForward 5’-3’TCGTCCATCGAGGATGACTTC， Reverse 5’-3’AACACCACAATTAAGGCAGGG；bcl-2Forward 5’-3’ACGTGGACCTCATGGAGTG，Reverse 5’-3’TGTGTATAGCAATCCCAGGCA

1.7 凋亡調(diào)控基因 bcl-2／bax蛋白表達的測定（Western blot）

取心肌碾磨，加入RIPA 300μl裂解30 min，4℃12 000 r／min離心，SDS-PAGE，電轉(zhuǎn)液中反應后轉(zhuǎn)膜，加入一抗后4℃孵育過夜，給予二抗結(jié)合反應，經(jīng)DAB顯色，測定Bcl-2／Bax蛋白的表達量。

1.8 統(tǒng)計學處理

計量數(shù)據(jù)以均數(shù)±標準差（）表示，所有資料均運用GraphPad Prism醫(yī)學統(tǒng)計軟件進行檢驗，兩組等方差數(shù)據(jù)之間的比較采用成組t檢驗。

2 結(jié)果

2.1 大鼠雙下肢骨折創(chuàng)傷失血對心肌損傷的影響

2.1.1 心肌組織HE染色 閱片發(fā)現(xiàn)，骨折創(chuàng)傷失血反應會導致心肌組織發(fā)生一定程度的損傷，心肌細胞形態(tài)發(fā)生改變，排列不規(guī)則，腫脹明顯，伴有大量巨噬細胞聚集（圖1，見彩圖頁Ⅳ）。

2.1.2 心肌細胞培養(yǎng)TUNEL染色 實驗表明，加入創(chuàng)傷血清進行心肌細胞培養(yǎng)后，能夠復制創(chuàng)傷模型，創(chuàng)傷組培養(yǎng)的心肌細胞中出現(xiàn)大量核染成棕褐色的細胞，此即為凋亡的心肌細胞（圖2，見彩圖頁Ⅳ）。對照組凋亡指數(shù)為3.65±0.81，創(chuàng)傷組凋亡指數(shù)為 27.47±1.83，兩組有明顯差異（P＜0.01）。

2.2 大鼠雙下肢骨折創(chuàng)傷失血對血清炎性因子含量的影響

檢測大鼠骨折創(chuàng)傷后不同時間點血清炎性因子含量的變化，發(fā)現(xiàn)在創(chuàng)傷后短時期（8 h）內(nèi)血清IL-2水平急劇下降，8 h降至最低值（74.22±8.90 pg／ml，n＝6），較對照組（214.41±11.99 pg／ml，n＝10）顯著減低 （P＜0.05）；隨著時間的延長，血清IL-2的水平開始緩慢增加，一直到創(chuàng)傷后48 h大鼠血清IL-2水平仍顯著低于對照組水平（P＜0.05）。

在骨折失血后，創(chuàng)傷組大鼠血清IL-6、IL-10水平開始急劇升高，創(chuàng)傷后4 h達到峰值，分別為（455.70±14.31pg／ml，n＝6）和（189.71±8.05 pg／ml，n＝6），較對照組（分別為 203.75±4.98 pg／ml，n＝10和 64.52±8.36 pg／ml，n＝10）顯著增加（P＜0.05，P＜0.05）。隨著時間的延長，血清 IL-6、IL-10水平呈逐步下降趨勢，創(chuàng)傷后16～24 h恢復至對照組水平。

在骨折創(chuàng)傷失血后的早期，創(chuàng)傷組TNF-α表達水平迅速升高，創(chuàng)傷后1 h即可達到最高值（58.22±3.51 pg／ml，n＝6），較對照組（45.24±5.94 pg／ml，n＝10）顯著升高（P＜0.05），隨后即呈快速下降趨勢（圖 3）。

2.3 雙下肢骨折創(chuàng)傷失血對大鼠心肌bcl-2／bax表達的影響

骨折創(chuàng)傷發(fā)生后，Western blot方法檢測顯示，心肌bax蛋白表達量增高，而bcl-2蛋白表達量下調(diào)。

RT-PCR檢查結(jié)果則提示，對照組bax基因相對表達量為（0.98±0.03，n＝10），創(chuàng)傷組為（3.96±0.21，n＝6），兩組差異顯著（P＜0.01）。而創(chuàng)傷組bcl-2基因相對表達量為（0.50±0.08，n＝6），較之對照組（1.01±0.05，n＝10）明顯下調(diào)（P＜0.01，圖 4）。

Fig.3 Changes in contentofserum associated inflammatory factors in rats

Fig.4 Changes of bax／bcl-2 expression in ratmyocardial tissue 1：Control group；2：Trauma group

2.4 心肌細胞培養(yǎng)測定凋亡調(diào)控基因bax／bcl-2表達的變化

Western blot檢測發(fā)現(xiàn)，加入創(chuàng)傷血清培養(yǎng)的損傷心肌細胞中，bcl-2蛋白表達量減少，而bax蛋白表達量增加。

進一步以 RT-PCR方法檢測基因 bax／bcl-2表達。結(jié)果顯示：對照組心肌細胞中促凋亡基因bax的相對表達量為（0.99±0.09），而創(chuàng)傷組為（3.95±0.28），兩者差異顯著（P＜0.01）。而對照組抑制凋亡基因 bcl-2的相對表達量為（0.99±0.08），創(chuàng)傷組為（0.56±0.05），二者相差具有明顯統(tǒng)計學意義（P＜0.05，圖 5）。

Fig.5 Changes of bax／bcl-2 expression in cultured cardiomyocytes

3 討論

目前認為，創(chuàng)傷所導致的心肌損傷機制，與炎性因子介導的心肌細胞凋亡、氧化應激損傷、能量代謝障礙、鈣超載等諸多因素有關，這些因素之間還存在相互鏈接，交織成復雜的網(wǎng)絡。本研究通過ELISA檢測也發(fā)現(xiàn)，創(chuàng)傷后 IL-2、IL-6、IL-10、TNF-α均呈現(xiàn)時間依賴性規(guī)律的變化，首先是TNF-α在創(chuàng)傷后極短時間內(nèi)達峰值（1 h內(nèi)），然后緩慢下降；隨即IL-6、IL-10升高，4 h左右達到峰值，然后逐步下降；而IL-2呈現(xiàn)相反的改變，創(chuàng)傷后急劇下降，4～8 h時降至谷底，隨后緩慢回升。這樣的變化規(guī)律，與其他學者的研究報導是一致的［3］。這說明創(chuàng)傷可使機體產(chǎn)生和釋放一系列炎癥相關因子，通過級聯(lián)放大產(chǎn)生“全身炎癥瀑布效應”，造成心肌受損。如IL-6和TNF-α，可引起機體多種炎性介質(zhì)的釋放失調(diào)［4］，TNF-α表達水平的持續(xù)增高既可直接導致心肌細胞膜受損、破壞，同時還可以募集其他炎性細胞浸潤，直至心肌發(fā)生壞死、纖維化。而IL-6則可以通過氧化應激機制促使心肌細胞發(fā)生凋亡［5］，TNF-α還可以增加IL-6的表達，產(chǎn)生協(xié)同作用，加速心肌細胞損傷。IL-10通過信號轉(zhuǎn)導機制直接／間接降低凋亡消音蛋白的活性，上調(diào)機體對創(chuàng)傷損害的敏感性閾值，避免凋亡發(fā)生［6］。

HE染色發(fā)現(xiàn)，大鼠雙下肢骨折創(chuàng)傷失血反應可以導致心肌不同程度受損，心肌細胞腫大，炎性細胞浸潤。而且，培養(yǎng)心肌細胞TUNEL染色證實，創(chuàng)傷可以誘導心肌細胞發(fā)生凋亡。對于心肌細胞凋亡的認知曾有爭議。曾有人認為，心肌細胞是一種最終分化的細胞，其死亡過程應為壞死，一旦壞死發(fā)生則不可再生。但隨著凋亡相關研究的逐步深入，心肌細胞凋亡這一現(xiàn)象得到普遍的認同。心肌缺血、動脈粥樣硬化、心肌病變等心血管疾患的不斷發(fā)展均可以導致心肌細胞凋亡，進而加重心臟功能受損；反之，心肌細胞凋亡又可以加速心臟疾患的進程，累及心功能不斷下降。資料表明，壓力過負荷所致心衰過程中，常常伴有心肌細胞肥大，而細胞數(shù)量減少，凋亡系這種量減少過程的主要原因；即使是極小量的減少，也極可能會明顯惡化心力衰竭的進程。甚至有研究提示，單一細胞死亡，通過與鄰近細胞間信號轉(zhuǎn)導，也會對整個心臟功能產(chǎn)生影響［7］。體外心肌細胞培養(yǎng)觀察到，凋亡在短時間內(nèi)（2 h）即可發(fā)生［8］；而在體研究表明，凋亡的發(fā)生可能需要4～24 h［9，10］，甚至更長。相對于某一固定的時間點，所測得的凋亡反應僅能反映相對固定的短時間內(nèi)細胞的凋亡進程，只有歷經(jīng)足夠長的時間過程檢測，才可能符合機體心臟的實際狀況［11］。

心肌細胞凋亡過程中，Bcl-2／Bax是一對最有效也是最關鍵的凋亡蛋白，具有非常重要的意義。Bax分布廣泛，細胞膜、細胞漿及細胞核中都有它的定位，如在線粒體外膜、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、核周膜等處［12］。在各種凋亡誘發(fā)信號介導下，游離于胞漿中的Bax發(fā)生遷移，與Bcl-2異源寡聚化為Bax-Bcl-2，可以使Bcl-2的活性受到抑制；同時還可以直接同源寡聚化為Bax-Bax，促進Cyt-c釋放入胞漿，松解凋亡激活因子Apaf-1與 Bcl-2的耦合，進而觸發(fā)凋亡［13］。與之相反，Bcl-2的主要作用是抑制心肌細胞凋亡，是公認的長命基因，通過C末端插入域定位于線粒體外膜、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、核周膜等處，能夠封閉Bax激活的mPTP孔道，進而阻斷凋亡［14］。研究表明，細胞內(nèi) Bcl-2／Bax的比例變化，對于是否產(chǎn)生凋亡傾向具有關鍵意義，直接反映心肌受損程度［15］。一般情況下，Bcl-2／Bax處于穩(wěn)定的動態(tài)平衡狀態(tài)，一旦機體受到刺激，通過信號傳遞打破這種動態(tài)平衡，將產(chǎn)生截然相反的結(jié)局。因此，Bax／Bcl-2的比例可以作為檢測凋亡的一個很重要的指標，如出現(xiàn)Bax表達增加而Bcl-2表達下調(diào)，則促進凋亡；反之，則可抑制凋亡反應。有資料顯示，心肌缺血初始階段，p38MAPK及其下游通道活化，促進Bax易位至線粒體，進而啟動凋亡；這一過程涉及凋亡激活因子Apaf-1，以及死亡蛋白（caspase-9）的易化過程；Bcl-2通過維持線粒體膜的完整性，阻斷該反應過程［16，17］。

綜上，本研究表明，大鼠雙下肢骨折創(chuàng)傷失血反應，無論在體內(nèi)或體外，均可以誘導凋亡調(diào)控基因Bcl-2／Bax表達比例發(fā)生變化，呈現(xiàn)促凋亡發(fā)生樣改變，導致遠隔臟器的損傷。通過一系列細胞因子介導，最終可以引發(fā)心肌細胞凋亡，造成更加嚴重的傷害，但其確切傳遞機制尚需進一步探討。針對性地阻斷其傳導通路，或上調(diào)其保護性應答機制，可能會為臨床提高危重創(chuàng)傷的救治、避免心肌損傷的發(fā)生提供一定的幫助。

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