羅 翱，唐成林，黃思琴，趙丹丹，張安寧，郭全虎，高睿琦，曹 凈

（重慶醫(yī)科大學(xué)中醫(yī)藥學(xué)院，重慶400016）

骨骼肌是人體體量最大的組織，直接參與人體的各項生命活動。近年來，由于交通、體育等行業(yè)的發(fā)展，骨骼肌損傷的發(fā)病率逐年上升。90%的骨骼肌損傷屬于鈍挫傷或牽拉傷［1］，而最常見的運動損傷中就是急性骨骼肌鈍挫傷，尤其以股四頭肌和腓腸肌損傷最常見［2］。骨骼肌損傷主要表現(xiàn)為肌纖維的斷裂和肌細(xì)胞的溶解，其損傷修復(fù)時間較長，愈后較差，甚至造成骨骼肌功能和結(jié)構(gòu)的不可逆損害，嚴(yán)重影響患者的日常生活。基于此，國內(nèi)外學(xué)者對骨骼肌損傷修復(fù)相關(guān)機制進(jìn)行大量的研究，但尚未得到統(tǒng)一觀點和意見。

目前，自噬是國內(nèi)外研究的熱點和難點。自噬是指細(xì)胞在自噬相關(guān)基因的調(diào)控下，通過溶酶體途徑降解自身衰老、變性及凋亡的細(xì)胞器和大分子物質(zhì)，從而維持細(xì)胞內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)定［3］。自噬既可以作為一種適應(yīng)性機制，清除老化的和折疊錯誤的蛋白質(zhì)及受損的線粒體等細(xì)胞器，也能在一定程度上促進(jìn)細(xì)胞增殖和遷移［4］。實際上，自噬的過程就是細(xì)胞內(nèi)容物被降解成核苷酸、氨基酸及游離脂肪酸，從而被細(xì)胞再次利用，為大分子物質(zhì)的合成和ATP的產(chǎn)生提供必需的原材料的過程［5］，通常也認(rèn)為該過程是促進(jìn)細(xì)胞存活的過程［6］。本課題組前期對骨骼肌損傷修復(fù)機制進(jìn)行大量的研究，主要集中在炎癥水平、肌衛(wèi)星細(xì)胞增殖分化及細(xì)胞膜修復(fù)等方面［7-9］，本實驗擬通過建立大鼠骨骼肌急性鈍挫傷模型，觀察損傷前后不同時間點細(xì)胞自噬相關(guān)因子表達(dá)的變化，以期補充并完善骨骼肌損傷修復(fù)的相關(guān)機制，為臨床治療骨骼肌鈍挫傷提供新思路。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

健康成年SPF級雄性SD大鼠30只，體重（200±20）g，由重慶醫(yī)科大學(xué)動物實驗中心提供（SCXK（渝）2012-0001）。實驗動物飼養(yǎng)于重慶醫(yī)科大學(xué)實驗動物中心SPF級動物房，室內(nèi)保持光照、黑暗12 h晝夜節(jié)律，室溫（22±1）℃，相對濕度50%～60%，自由飲食飲水。

1.2 主要試劑及儀器

主要試劑：4%多聚甲醛（Biosharp生物科技公司）；2.5%戊二醛（重慶醫(yī)科大學(xué)電鏡室）；蘇木精-伊紅（HE）染液（北京索萊寶科技有限公司）；各基因引物、逆轉(zhuǎn)錄試劑盒、SYBR Green、Trizol、DEPC水（Takara-寶生物工程（大連）有限公司）；氯仿、異丙醇（重慶川東化工（集團）有限公司）；各蛋白質(zhì)一抗、各蛋白質(zhì)二抗（Cell Signaling Technology（CST））；抗體增強液（TOYOBO）；ECL發(fā)光液（Millipore）；脫脂奶粉（伊利集團）。

主要儀器：臺式高壓蒸汽滅菌鍋、恒溫孵育箱（上海精宏實驗設(shè)備有限公司）；生物顯微鏡、圖像采集系統(tǒng)（Olympus）；Hitachi-7500型透射電鏡（重慶醫(yī)科大學(xué)電鏡室）；勻漿器（IKA）；低溫離心機（長沙湘儀離心機有限公司）；全波長酶標(biāo)儀（BioTek）；金屬浴、溫控?fù)u床（江蘇海門市其林貝爾（Qilinbeier）儀器制造有限公司）；Bio-Rad標(biāo)準(zhǔn)電泳裝置、實時熒光定量 PCR儀（Bio-Rad）；Odyssey Fc發(fā)光儀（Gene Company Limited）。

1.3 大鼠骨骼肌急性鈍挫傷模型復(fù)制

參考Kami K［10］的造模方法。自備打擊器，打擊器為一打擊面平坦的空心鋁制圓柱體（直徑1 cm，長20 cm，質(zhì)量20 g），底面與木制圓柱體相接（直徑1 cm，長2 cm，質(zhì)量2 g），木制打擊面與打擊部位直接接觸，自制鐵球640 g，從25 cm高處落下，重力6.27 N，產(chǎn)生動能1.57 J。造模前用小動物剃毛器剔除大鼠右小腿內(nèi)側(cè)皮膚被毛。乙醚麻醉后，將大鼠右小腿外展屈曲90°固定，打擊部位為右小腿內(nèi)側(cè)面（其皮下為腓腸肌中段），抽出鐵片使鐵球下落導(dǎo)致一次性打擊傷并標(biāo)記。造模后通過大體觀察、觸診及病理學(xué)檢測，證實腓腸肌有一定收縮功能障礙且無骨折，屬急性腓腸肌鈍挫傷模型。重力錘的投放和大鼠的固定均由一人操作，以保證打擊力度、損傷部位及程度的一致性。

1.4 分組及取材

30只SD大鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)一周后，隨機選取6只作為對照組，對照組于造模前一天取材。其余24只大鼠制備腓腸肌急性鈍挫傷模型，然后隨機分為4組（n＝6），各組分別在造模后 3 d、5 d、7 d、14 d取材。取材前，大鼠腹腔注射2%戊巴比妥鈉（0.5 ml／200 g體重）麻醉，解剖并分離大鼠右側(cè)腓腸肌，迅速將離體的腓腸肌放在干凈的濾紙上均分為3份，一份置2.5%戊二醛中固定，待做透射電鏡檢測；另一份置4%多聚甲醛中固定，以備石蠟包埋、冰凍切片及HE染色；第三份置液氮中速凍2 h，然后轉(zhuǎn)移到-80℃冰箱保存，以備Western blot及RT-PCR檢測。

1.5 腓腸肌組織HE染色及病理學(xué)評價

將各組大鼠經(jīng)4%多聚甲醛固定的腓腸肌取出，自來水沖洗，酒精梯度脫水，二甲苯透明，石蠟包埋切片并進(jìn)行HE染色。光學(xué)顯微鏡下觀察各組大鼠腓腸肌組織形態(tài)學(xué)變化，并用圖像采集系統(tǒng)獲取所需圖片，進(jìn)行組織學(xué)和病理學(xué)分析。

1.6 腓腸肌組織透射電鏡觀察及形態(tài)學(xué)評價

取經(jīng)2.5%戊二醛固定的腓腸肌，使用pH 7.2的磷酸緩沖鹽溶液漂洗3次，1%鋨酸固定2 h，4℃下梯度酒精（50%、70%、90%，100%）脫水；置換（環(huán)氧丙烷，環(huán)氧丙烷和樹脂1∶1混合液，環(huán)氧丙烷和樹脂1∶4混合液，純樹脂）；環(huán)氧樹脂包埋后制作半薄切片（甲苯胺藍(lán)染色-光鏡下定位-定位于橫切）；超薄切片機切片后銅網(wǎng)撈片，3%醋酸雙氧鈾-枸櫞酸鉛雙染色法染色。待樣品干燥后，透射電鏡觀察受損肌組織超微結(jié)構(gòu)變化并進(jìn)行分析。

1.7 Western blot檢測自噬相關(guān)蛋白質(zhì)表達(dá)水平

自-80℃取出適量腓腸肌組織，加入裂解液勻漿，離心取上清，BCA法測定蛋白質(zhì)濃度，在一定量上清液中加入緩沖液后金屬浴10 min，置于冰上待上樣。SDS-PAGE分離蛋白質(zhì)，電轉(zhuǎn)移至PVDF膜，置搖床上用5%脫脂奶粉封閉1 h。輕輕沖洗PVDF膜，將其置一抗稀釋液中4℃搖床上孵育過夜。次日用TBST洗膜10min×3次，加對應(yīng)的二抗稀釋液置搖床上室溫孵育1 h，用TBST洗膜10 min×3次。將ECL化學(xué)發(fā)光液均勻涂于膜上反應(yīng)2min，置發(fā)光機中曝光顯影成像，以Image Studio Ver 5.0軟件統(tǒng)計灰度值并進(jìn)行分析。

1.8 RT-PCR檢測自噬相關(guān)基因mRNA表達(dá)水平

自-80℃冰箱取出各組大鼠腓腸肌組織約30 mg，加入1ml Trizol試劑勻漿，依次加氯仿，振蕩，離心取上清；加異丙醇，振蕩，離心棄上清，75%酒精洗滌2次，晾干；加適量DEPC水溶解RNA并彈勻離心，隨后測定RNA濃度。根據(jù)逆轉(zhuǎn)錄體系調(diào)整RNA濃度并計算逆轉(zhuǎn)錄所需上樣量，而后逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA，反應(yīng)條件：37℃、15min、85℃、5 s、4℃、∞。按SYBR?Premix Ex TaqTMII（Tli RNase H Plus）配置反應(yīng)混合物后，根據(jù)反應(yīng)體系所需量上樣并進(jìn)行RTPCR擴增，上機條件：預(yù)變性（95℃、30 s）；擴增（95℃、5 s，60℃、30 s）；溶解曲線（95℃、5 s，60℃、1 min）。通過CFXmanager 3.1軟件讀取Ct值。各基因引物序列如表1。

Tab.1Primer sequences of RT-PCR

1.9 統(tǒng)計學(xué)處理

實驗數(shù)據(jù)用均數(shù) ±標(biāo)準(zhǔn)差）表示，采用SPSS 19.0統(tǒng)計軟件進(jìn)行單因素方差分析（one-way ANOVA），以LSD法進(jìn)行組間兩兩比較。

2 結(jié)果

2.1 骨骼肌急性鈍挫傷后各組大鼠組織變化情況

HE結(jié)果（圖1，見彩圖頁Ⅰ）顯示：對照組大鼠骨骼肌肌纖維呈鈍角多邊形，肌細(xì)胞大小結(jié)構(gòu)均一，胞核大多位于細(xì)胞邊緣，肌節(jié)結(jié)構(gòu)完整，肌絲排列整齊（圖1A）。與對照組比較，其余各組均可見大量肌纖維溶解及炎細(xì)胞浸潤（圖1A-E）。自然恢復(fù)3 d組，同一視野下可見少量的成肌細(xì)胞，且腫脹明顯，另有大量的炎細(xì)胞浸潤（圖1B）。自然恢復(fù)5 d組與3 d組比較差異不大，依然存在大量的炎細(xì)胞浸潤，肌纖維斷裂溶解現(xiàn)象也較明顯，肌細(xì)胞明顯變形，細(xì)胞出現(xiàn)崩解和萎縮（圖1C）。自然恢復(fù)7 d組，可見部分新生肌細(xì)胞和小血管，細(xì)胞排列相對緊密但較紊亂，其間可見明顯的結(jié)締組織填充，炎細(xì)胞浸潤減輕（圖1D）。自然恢復(fù)14 d組，可見肌纖維排列整齊且致密，有輕微腫脹，肌纖維大小結(jié)構(gòu)均一，細(xì)胞核移至細(xì)胞邊緣，損傷部位初步愈合（圖1E）。

電鏡觀察結(jié)果（圖2）顯示：對照組肌原纖維無異常，肌節(jié)排列整齊，明暗帶相間，線粒體橫向排列于Z帶附近，形態(tài)無異常，肌質(zhì)網(wǎng)無擴張，可見明顯的三聯(lián)體（圖2A）。自然恢復(fù)3 d組，可見線粒體明顯腫脹，且結(jié)構(gòu)異常，嵴變性，空泡化，肌原纖維部分溶解變形，Z線部分消失且排列紊亂，肌質(zhì)網(wǎng)輕度擴張（圖2B）。自然恢復(fù)5 d組，可見大面積的線粒體腫脹，排列紊亂，肌原纖維小灶狀丟失，Z線大多消失且部分飄移，呈近似水紋狀改變，肌質(zhì)網(wǎng)擴張明顯（圖2C）。自然恢復(fù)7 d組，線粒體腫脹依舊明顯，Z線消失或部分增粗，肌質(zhì)網(wǎng)擴張明顯，肌原纖維排列依舊紊亂（圖2D）。自然恢復(fù)14 d組，可見稍清晰的Z線，形態(tài)近似于對照組，線粒體腫脹減輕、嵴疏松變性明顯，線粒體排列向Z線兩側(cè)移位，肌質(zhì)網(wǎng)擴張減輕但仍較對照組明顯（圖2 E）。

Fig.2 The gastrocnemius electronmicroscopy of the control group and the natural recovery group for 3 d，5 d，7 d，14 d（×20 000，scale＝1μm）

2.2 骨骼肌急性鈍挫傷后各組大鼠自噬相關(guān)蛋白質(zhì)LC3-II、P62表達(dá)的變化

Western blot結(jié)果（表2）顯示，在骨骼肌鈍挫傷自然恢復(fù) 3 d、5 d、7 d、14 d過程中，LC3-II與 P62總體呈現(xiàn)先升高后降低的變化趨勢。其中，與對照組和自然恢復(fù)14 d組比較，自然恢復(fù)3 d、5 d、7 d組LC3-II表達(dá)水平顯著升高（P＜0.01），3 d、7 d組也較5 d組明顯升高（P＜0.01）。同樣，與對照組相比，在損傷后第3天 P62達(dá)到高峰（P＜0.01），損傷后第5天表達(dá)開始下降但仍明顯高于對照組（P＜0.05），14 d組P62表達(dá)已恢復(fù)至正常水平。

Tab.2 The relative expression levels of LC3-II and P62 in gastrocnemiusmuscle of the control group and the natural recovery groups for 3 d，5 d，7 d，14 d（，n＝3）

Tab.2 The relative expression levels of LC3-II and P62 in gastrocnemiusmuscle of the control group and the natural recovery groups for 3 d，5 d，7 d，14 d（，n＝3）

*P＜0.05，**P＜0.01 vs controlgroup；＃＃P＜0.01 vs14 d；△△P＜0.01 vs 5 d；▲▲P＜0.01 vs 3 d

Group LC3-II P62 Con 0.376±0.126 0.260±0.067 3 d 1.195±0.064**＃＃△△ 4.783±1.207**＃＃5 d 0.946±0.078**＃＃ 1.560±0.392*▲▲7 d 1.284±0.115**＃?！鳌?1.285±0.196▲▲14 d 0.351±0.076 0.788±0.289

2.3 骨骼肌急性鈍挫傷后各組大鼠自噬相關(guān)基因atg7、atg10、atg12、atg16L1mRNA表達(dá)的變化

RT-PCR結(jié)果（表3）顯示，骨骼肌鈍挫傷在自然恢復(fù) 3 d、5 d、7 d、14 d這一過程中 atg10mRNA表達(dá)呈現(xiàn)先降低后升高的趨勢，其中3 d、5 d、7 d組明顯低于對照組與 14 d組（P＜0.01）。atg7、atg12、atg16L1mRNA表達(dá)總體呈現(xiàn)先升高后降低的趨勢，3 d、5 d、7 d各組明顯高于對照組與14 d組（P＜0.01，P＜0.05，P＜0.01）；與 5 d組比較，3 d、7 d組atg7與atg12mRNA表達(dá)量明顯升高（P＜0.05，P＜0.01）；與對照組比較，自然恢復(fù) 14 d組 atg7、atg12、atg16L1mRNA表達(dá)呈下降趨勢，但無統(tǒng)計學(xué)差異。

Tab.3 The relative expression levels of atg7，atg10，atg12 and atg16 L1in the gastrocnemiusmuscle of the control group and the natural recovery group for 3 d，5 d，7 d，14 d（，n＝3）

Tab.3 The relative expression levels of atg7，atg10，atg12 and atg16 L1in the gastrocnemiusmuscle of the control group and the natural recovery group for 3 d，5 d，7 d，14 d（，n＝3）

*P＜0.05，**P＜0.01 vs control group；＃P＜0.05，＃＃P＜0.01 vs 14 d；△P＜0.05，△△P＜0.01 vs 5 d

Group atg7 atg10 atg12 atg16L1 Con 1.003±0.093 1.007±0.149 1.002±0.082 1.010±0.182 3 d 5.117±0.380**＃?！?0.276±0.112**＃＃ 3.941±1.071**＃?！?2.806±0.426**＃＃5 d 3.753±1.167**＃＃ 0.360±0.231**＃＃ 2.573±0.884*＃＃ 3.176±1.083**＃＃7 d 6.307±0.937**＃＃△△ 0.249±0.001**＃＃ 3.409±0.227**＃＃ 3.071±0.135**＃＃14 d 0.626±0.100 1.268±0.202 0.674±0.028 0.715±0.107

3 討論

起“管家機制”作用的自噬一直是國內(nèi)外研究的熱點及難點。目前，哺乳動物自噬的發(fā)生機制尚未完全闡明。但在酵母中已鑒定出約30多種與自噬相關(guān)的基因，同樣在哺乳動物中也已鑒定出一些同源基因而且也具有一定的功能［11，12］。在生理狀態(tài)下，幾乎所有的細(xì)胞都存在基礎(chǔ)水平的自噬現(xiàn)象，以便清除未折疊或折疊錯誤的蛋白質(zhì)，降解大分子物質(zhì)，為細(xì)胞重建、再生和修復(fù)提供必需的原材料，實現(xiàn)物質(zhì)的循環(huán)再利用，維持細(xì)胞內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)定。但在某些特殊狀態(tài)下，例如缺血缺氧、氧化應(yīng)激、DNA損傷，饑餓等條件下，細(xì)胞會上調(diào)自噬以清除損傷的細(xì)胞器，實現(xiàn)能量的再利用，抑制凋亡因子的釋放，減少細(xì)胞損害［13］。

自噬的核心分子機制主要由atg相關(guān)基因及自噬微管相關(guān)蛋白1輕鏈3組成，在自噬級聯(lián)反應(yīng)數(shù)個連續(xù)步驟中起編排功能。本實驗通過建立骨骼肌急性鈍挫傷動物模型，檢測自噬相關(guān)蛋白LC3-Ⅱ、P62及自噬相關(guān)基因 atg7、atg10、atg12、atg16L1等指標(biāo)，觀察損傷后上述因子的變化情況。研究發(fā)現(xiàn)，與正常組比較，損傷后 3 d、5 d、7 d、14 d，atg7，atg12，atg16L1mRNA表達(dá)呈現(xiàn)先升高后降低的規(guī)律性變化，且變化趨勢一致，atg10變化與之正好相反。atg7是具有泛素E1樣酶活性的自噬相關(guān)基因，已證實Atg7是atg12-atg5泛素樣蛋白通路上游的蛋白質(zhì)分子，在自噬體擴張伸展中具有重要作用［14］。首先水解的Atg7通過自身被激活的507位半胱氨酸殘基與Atg12的C末端甘氨酸殘基結(jié)合形成高能硫酯鍵，催化Atg12活化，之后轉(zhuǎn)運至具有泛素E2樣酶活性的Atg10，再通過與Atg5連接形成異肽鍵，構(gòu)成Atg7-Atg5系統(tǒng)，而后再和Atg16L1以共價鍵結(jié)合，組成三元復(fù)合物 Atg12-Atg5-Atg16L1［14］，該復(fù)合物與前自噬泡外膜結(jié)合，促進(jìn)自噬泡的伸展和延伸。因此，當(dāng)細(xì)胞自噬活性增強時，Atg7、Atg12、Atg16L1表達(dá)應(yīng)明顯增多，Atg10應(yīng)明顯減少。結(jié)合上述實驗結(jié)果，不難發(fā)現(xiàn)骨骼肌急性鈍挫傷后自噬相關(guān)基因轉(zhuǎn)錄水平發(fā)生了改變，改變提示自噬活性明顯增強，隨著機體損傷的自我修復(fù)，自噬活性又逐漸降至損傷前的基礎(chǔ)狀態(tài)，提示自噬相關(guān)基因 atg7，atg10，atg12，atg16L1參與損傷的修復(fù)，推測肌肉損傷修復(fù)的速度很可能與該基因的轉(zhuǎn)錄水平高低密切相關(guān)。同時，研究表明Atg7也參與LC3-I的活化，促進(jìn) LC3-I與PE（phosphatidyl ethanolamine，磷脂酰乙醇胺）結(jié)合形成自噬標(biāo)記分子 LC3-II。LC3（microtubule-associated protein 1 light chain 3）是哺乳動物中Atg8的同源物，它以兩種形式存在，即 LC3-I和 LC3-II，LC3-I與 PE結(jié)合成為 LC3-II，是 LC3-I的活化形式，LC3-II含量與自噬泡數(shù)量的多少成正比，當(dāng)細(xì)胞內(nèi) LC3-I向LC3-II轉(zhuǎn)化增加時，細(xì)胞自噬水平明顯升高。因此，檢測細(xì)胞內(nèi)LC3-II含量變化，可以判斷自噬水平的高低［15，16］。同樣，由原癌基因 c-myc編碼的 P62蛋白位于細(xì)胞質(zhì)中，當(dāng)細(xì)胞自噬時，P62與經(jīng)泛素化的蛋白質(zhì)結(jié)合，再與LC3-II結(jié)合形成復(fù)合物，并最終在溶酶體酶的作用下不斷被降解［15］。換言之，細(xì)胞自噬水平升高時P62水平理論上應(yīng)下降，而自噬活性受抑制時，P62理論上則不斷累積。因此，P62同樣可作為反映細(xì)胞自噬活性高低的標(biāo)記蛋白質(zhì)。作者采用Western blot檢測損傷后不同時間點腓腸肌中LC3-II和P62水平，發(fā)現(xiàn)骨骼肌鈍挫傷后在自然恢復(fù) 3 d、5 d、7 d、14 d過程中，LC3-II與 P62總體呈現(xiàn)先升高后降低的趨勢，其中3 d、5 d、7 d組LC3-II水平較正常組與14 d組明顯升高，14 d組恢復(fù)至正常水平。同樣，與正常組對比，P62在損傷后第3天達(dá)到高峰，損傷后第5天表達(dá)開始下降，第14天恢復(fù)至正常水平，該結(jié)果也表明骨骼肌損傷修復(fù)過程中自噬活性一開始會明顯增強，但隨著機體自我修復(fù)，自噬活性會逐漸降至損傷前的基礎(chǔ)狀態(tài)。值得注意的是，骨骼肌損傷后LC3-II和P62兩者表達(dá)并未呈現(xiàn)完全相反的變化，只是出現(xiàn)峰值的時間不一，可能系P62不僅參與細(xì)胞自噬過程，同時也參與多種生命過程，例如有研究發(fā)現(xiàn)P62參與細(xì)胞抗氧化應(yīng)激反應(yīng)中的重要通路NRF2-Keap1通路［17］，同時有研究也表明P62的表達(dá)與細(xì)胞的分化有關(guān)［18］。因此需開展進(jìn)一步實驗，并分析P62在骨骼肌損傷中扮演的角色。

綜上所述，本實驗建立大鼠骨骼肌急性鈍挫傷模型，通過HE染色和透射電鏡對損傷后不同時間點的腓腸肌組織進(jìn)行形態(tài)學(xué)觀察，同時對自噬相關(guān)基因 atg7、atg10、atg12、atg16L1 mRNA表達(dá)水平及自噬相關(guān)蛋白LC3-II、P62表達(dá)水平的變化進(jìn)行分析。結(jié)果直接和間接證實，骨骼肌急性鈍挫傷后自噬活性顯著提高，而隨著損傷的修復(fù)，自噬活性又恢復(fù)至損傷前水平，提示細(xì)胞自噬參與骨骼肌損傷的修復(fù)過程，推測損傷修復(fù)的速度很可能與上述指標(biāo)的表達(dá)水平密切相關(guān)，這為研究不同治療方法對骨骼肌損傷修復(fù)的作用機制提供新思路。

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