鄭萍 康麗云 黃才華 郁琳潔

摘要：在培養(yǎng)紅掌組織的過(guò)程中，外植體容易產(chǎn)生褐變現(xiàn)象，從而對(duì)紅掌組織的正常培養(yǎng)過(guò)程造成嚴(yán)重影響。在本文中選取紅掌“紅粉佳人”作為選材產(chǎn)品，其外植體選取健康植株幼嫩葉片，探究與分析在培養(yǎng)愈傷組織過(guò)程中出現(xiàn)褐變的現(xiàn)象。采用不相同的抗壞血酸VC、聚乙烯吡咯烷酮PVP、活性炭AC、檸檬酸、葉酸等吸附劑、抗氧化劑、培養(yǎng)基硬度的防褐變現(xiàn)象進(jìn)行觀察與研究。經(jīng)研究發(fā)現(xiàn)，將0.2%聚乙烯吡咯烷酮PVP、4-D0.2mg/L、6-BA1.0mg/L均添加到5g/L硬度的瓊脂MS培養(yǎng)基中，可在最大限度上對(duì)褐變現(xiàn)象進(jìn)行有效控制，且提升愈傷誘導(dǎo)率。

關(guān)鍵詞：外植體；褐變現(xiàn)象；紅掌組織

中圖分類(lèi)號(hào)： S682.14 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼： A DOI編號(hào)： 10.14025/j.cnki.jlny.2018.10.030

紅掌又可稱(chēng)作火鶴花、紅鵝掌、紅掌植物界、安祖花，是天南星科多年生常綠草本植物[1]。紅掌的莖葉從基部萌出，呈綠色，全緣，卵心形或者是長(zhǎng)圓狀心形，莖節(jié)較短。哥倫比亞、哥斯達(dá)黎加、厄瓜多爾等熱帶雨林地區(qū)盛產(chǎn)紅掌，主要是因其適應(yīng)潮濕溫暖、不喜光的外部環(huán)境條件，也可附生在巖石上、樹(shù)上或者是地上。紅掌具有較長(zhǎng)花期，可常年開(kāi)花，且放置于水瓶中生長(zhǎng)期可長(zhǎng)達(dá)30天左右，是一種具有極高觀賞價(jià)值的高檔盆栽[2]。在通常情況下，紅掌在繁殖過(guò)程中主要是以分株為主，必要時(shí)可采用扦插作為輔助繁殖，其繁殖速度相對(duì)較慢。為了更好地滿(mǎn)足與適應(yīng)市場(chǎng)需求，其繁殖途徑主要是以組織培養(yǎng)為主。但在培養(yǎng)過(guò)程中容易出現(xiàn)外植體褐變現(xiàn)象，鑒于此，在本次研究中，探索出防褐變的最佳條件，旨在全面增長(zhǎng)繁殖系數(shù)以及誘導(dǎo)率。

1資料與方法

1.1一般資料

選取紅掌“紅粉佳人”作為選材產(chǎn)品，其外植體選取健康植株幼嫩葉片，探究與分析在培養(yǎng)愈傷組織過(guò)程中出現(xiàn)褐變的現(xiàn)象。采用不相同的抗壞血酸VC、聚乙烯吡咯烷酮PVP、活性炭AC、檸檬酸、葉酸等吸附劑、抗氧化劑、培養(yǎng)基硬度的防褐變現(xiàn)象進(jìn)行觀察與研究。

1.2試驗(yàn)方法

選取紅掌“紅粉佳人”作為選材產(chǎn)品，其外植體選取健康植株幼嫩葉片。采用自來(lái)水將試材進(jìn)行反復(fù)沖洗，放置在無(wú)菌室超凈工作臺(tái)上，給予75%酒精進(jìn)行預(yù)處理，處理時(shí)間控制在30秒。隨即在處理過(guò)程中再給予0.1%升汞，處理時(shí)間控制在8分鐘。使用無(wú)菌水再次進(jìn)行反復(fù)沖洗，6次即可，輕微震蕩直到完全清除升汞。采用無(wú)菌濾紙將剩余水分吸干之后，把其葉片切成小方塊4～6mm，在不同硬度培養(yǎng)基中進(jìn)行接種操作。外植體5個(gè)/瓶，10瓶/培養(yǎng)基，重復(fù)3次[3]。在選取培養(yǎng)基過(guò)程中，使用4-D0.2mg/L、6-BA1.0mg/L、MS，將30g/L蔗糖加入到其中。除了將濃度不相同的瓊脂添加到不同硬度培養(yǎng)基之外，還需將5g/L瓊脂添加到121℃的其他試驗(yàn)處理培養(yǎng)基中，進(jìn)行滅菌操作25min。設(shè)定（25±2）℃為最佳培養(yǎng)溫度，其每天的陽(yáng)光照射時(shí)長(zhǎng)應(yīng)在13h，光照強(qiáng)度約為1300lx，轉(zhuǎn)瓶時(shí)間為每個(gè)月1次。待接種2個(gè)月后，觀察并同步記錄褐變情況、愈傷誘導(dǎo)率以及褐變率?；九囵B(yǎng)基以4-D0.2mg/L、6-BA1.0mg/L、MS培養(yǎng)基為主，將不相同的抗壞血酸VC、聚乙烯吡咯烷酮PVP、活性炭AC、檸檬酸、葉酸等吸附劑、抗氧化劑添加到基本培養(yǎng)基中，并對(duì)試驗(yàn)處理進(jìn)行設(shè)計(jì)，對(duì)照組則為未添加抗氧化劑與吸附劑進(jìn)行試驗(yàn)處理。通過(guò)上述方法可分析出，不同添加物處理對(duì)愈傷誘導(dǎo)、外植體褐變現(xiàn)象的影響。同樣，在分析不同硬度培養(yǎng)基試驗(yàn)處理對(duì)愈傷誘導(dǎo)、外植體褐變現(xiàn)象的影響過(guò)程中，基本培養(yǎng)基以4-D0.2mg/L、6-BA1.0mg/L、MS培養(yǎng)基為主，將濃度不相同的瓊脂添加到基本培養(yǎng)基中，對(duì)不同硬度試驗(yàn)處理進(jìn)行設(shè)計(jì)。此外，將0.2%聚乙烯吡咯烷酮PVP添加到每個(gè)處理培養(yǎng)基中。

1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

在SPSS21.0統(tǒng)計(jì)軟件中算出本次研究所有數(shù)據(jù)，（X2）（%）分別表示計(jì)數(shù)資料，（t）（x±s）分別表示計(jì)量資料，（P<0.05）則表示為差異明顯，存在統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2結(jié)果和分析

2.1 不同添加物處理對(duì)愈傷誘導(dǎo)、褐變現(xiàn)象的影響

待接種2個(gè)月后，將抗壞血酸VC、聚乙烯吡咯烷酮PVP、活性炭AC、檸檬酸、葉酸添加到培養(yǎng)基中能夠發(fā)揮出抗褐變的效果。其中，葉酸褐變率最高，活性炭AC褐變率最少。經(jīng)分析，主要是由于活性炭的吸附能力較強(qiáng)，能夠?qū)в泻稚挠卸疚镔|(zhì)進(jìn)行吸附，從而在一定程度上避免因有害物質(zhì)對(duì)外植體產(chǎn)生嚴(yán)重影響，使褐變率降低。雖然活性炭的褐變率較低，但會(huì)將培養(yǎng)基中生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑進(jìn)行吸附，大幅降低了愈傷誘導(dǎo)率，對(duì)形成紅掌愈傷組織具有阻礙作用。因此，在形成紅掌愈傷組織的過(guò)程中，活性炭AC不是最佳防褐變劑。而通過(guò)添加聚乙烯吡咯烷酮，其褐變率為24%，僅次于活性炭，而愈傷誘導(dǎo)率高達(dá)76%，高于抗壞血酸VC、檸檬酸、葉酸?？傊谏鲜?個(gè)添加物中，聚乙烯吡咯烷酮具有良好的處理成效，是最佳防褐變劑（詳見(jiàn)表1）。

2.2 不同硬度培養(yǎng)基對(duì)外植體褐變現(xiàn)象的影響

瓊脂濃度越高，則培養(yǎng)基硬度越大。硬度為4的培養(yǎng)基，瓊脂濃度為5 g·L-1，其愈傷誘導(dǎo)率最高，而褐變率可達(dá)到最低值。隨著培養(yǎng)基硬度的不斷增加，其褐變率也隨之不斷提高。經(jīng)深入分析，認(rèn)為可能是由于在外植體傷口附近聚集了過(guò)多的褐色有害物質(zhì)而無(wú)法得到擴(kuò)散，從而導(dǎo)致局部有害物質(zhì)不斷累積，最終使褐變程度不斷上升（詳見(jiàn)表2）。

3討論

外植體褐變指的是在培養(yǎng)組織的過(guò)程中，在培養(yǎng)基中外植體釋放出褐色物質(zhì)，從而導(dǎo)致培養(yǎng)基也隨之變成褐色，其培養(yǎng)材料逐漸死亡[4-6]。褐變的發(fā)生機(jī)制主要是因外植體中的多酚氧化酶以及酚類(lèi)化合物被逐漸氧化之后所產(chǎn)生一種帶有褐色的醌類(lèi)化合物，并受到酪氨酸酶的影響，與蛋白質(zhì)進(jìn)行結(jié)合，從而致使其他酶系統(tǒng)失去活性，引起組織代謝紊亂，最終死亡[7]。在正常組織中，酶沒(méi)有受到活化作用的影響，或者是定位分隔酚與酶，從而降低了褐變率，這樣一來(lái)，外植體材料在不同培養(yǎng)環(huán)境下均能對(duì)多酚氧化酶以及酚類(lèi)化合物產(chǎn)生不同程度的影響。單寧含量、木本植物或者是含有高色素的植物均能產(chǎn)生褐變現(xiàn)象，這主要是因?yàn)閱螌?、木質(zhì)素、色素是酚類(lèi)糖苷化合物的合成前體[8]。此外，還應(yīng)重視季節(jié)因素。有相關(guān)學(xué)者曾在研究報(bào)道中指出，在1月份時(shí)，歐洲栗所形成的酚類(lèi)相對(duì)較少，而到了6月份左右，顯著增加了酚類(lèi)含量，從而提高了褐變率[9-11]。還有研究證實(shí)，外植體組織的不同受傷程度會(huì)對(duì)褐變?cè)斐芍苯佑绊?。在外植體的切取過(guò)程中，應(yīng)注意避免因增加其傷口面積而提高褐變現(xiàn)象。有研究者提出，選取葉片容易增加外植體褐變，該研究者在培養(yǎng)油棕組織的過(guò)程中選取葉片，由于組織出現(xiàn)高度分化從而引起褐變現(xiàn)象，但選取胚培養(yǎng)方式，其褐變率較低[12-13]。因此，在選取葉片中如何有效避免出現(xiàn)褐變現(xiàn)象已成為目前研究者所需面臨的重點(diǎn)課題之一，正確控制褐變的方法對(duì)成功培養(yǎng)紅掌組織具有重大意義。在本次研究中，主要是探究與分析在培養(yǎng)紅掌組織的過(guò)程中的外植體褐變現(xiàn)象，通過(guò)采用不同添加物試驗(yàn)處理及不同硬度培養(yǎng)基等研究方法，對(duì)科學(xué)合理的處理方式進(jìn)行有效篩選，從而為后期組織培養(yǎng)提供科學(xué)有力的理論支持?？傊?，外植體褐變現(xiàn)象普遍存在于植物組織的培養(yǎng)中，應(yīng)對(duì)褐變現(xiàn)象的發(fā)生機(jī)制進(jìn)行深入分析與了解，從而找尋出適宜外植體的培養(yǎng)條件。

本研究表明，在形成紅掌愈傷組織的過(guò)程中，活性炭AC不是最佳防褐變劑。而通過(guò)添加聚乙烯吡咯烷酮，其褐變率為24%，僅次于活性炭，而愈傷誘導(dǎo)率高達(dá)76%，高于抗壞血酸VC、檸檬酸、葉酸。在上述5個(gè)添加物中，聚乙烯吡咯烷酮具有良好的處理成效，是最佳防褐變劑。

綜上所述，將0.2%聚乙烯吡咯烷酮PVP、4-D0.2mg/L、6-BA1.0mg/L均添加到5g/L硬度的瓊脂MS培養(yǎng)基中，可在最大限度上對(duì)褐變現(xiàn)象進(jìn)行有效控制，且提升愈傷誘導(dǎo)率。

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作者簡(jiǎn)介：鄭萍，博士，農(nóng)藝師，研究方向：遺傳育種。