陳 芳 郭奇桑 陳麗梅 江寧紅 隋 龍,△

(1復(fù)旦大學(xué)附屬婦產(chǎn)科醫(yī)院宮頸疾病診療中心 上海 200011; 2上海市女性生殖內(nèi)分泌相關(guān)疾病重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 上海 200011)

宮腔粘連(intrauterine adhesion,IUA)又稱為Asherman綜合征,1948年由Asherman首次詳細(xì)報(bào)道[1],是由于子宮內(nèi)膜損傷導(dǎo)致子宮內(nèi)膜瘢痕纖維化及修復(fù)障礙,宮腔部分或全部粘連閉塞從而引起一系列臨床癥狀的一種婦科常見病。近年來(lái),隨著頻繁的宮腔操作及宮腔鏡手術(shù)的普及,IUA的發(fā)病率和檢出率逐年上升,成為女性繼發(fā)不孕的第二大病因[2-3]。目前認(rèn)為,創(chuàng)傷和感染是IUA發(fā)生的主要高危因素,任何引起子宮內(nèi)膜基底層脫落、缺失使得肌層暴露的損傷均可導(dǎo)致子宮內(nèi)壁相互粘連,子宮內(nèi)膜前后壁基底層破壞是粘連發(fā)生的必要條件[4-5]。IUA導(dǎo)致的不孕、反復(fù)流產(chǎn)、月經(jīng)減少甚至閉經(jīng)等一系列臨床疾病的治療一直是國(guó)內(nèi)外婦產(chǎn)科醫(yī)生面臨的棘手問(wèn)題。IUA病理機(jī)制尚不明確[6],目前主要治療方法為盡可能恢復(fù)宮腔解剖形態(tài),然而粘連部位子宮內(nèi)膜生理功能的恢復(fù)尚不明確,遠(yuǎn)期療效不肯定,且IUA的治愈率和妊娠率尚無(wú)明顯改善[7]。因此,有必要建立一個(gè)穩(wěn)定的接近人類IUA發(fā)病原因的IUA動(dòng)物模型,以利于更加深入研究其發(fā)病機(jī)制及病理生理,為子宮內(nèi)膜損傷和IUA的實(shí)驗(yàn)研究和臨床治療尋找契機(jī)與手段。本實(shí)驗(yàn)采用子宮內(nèi)膜全層切除法,以期建立一種更符合人體子宮內(nèi)膜機(jī)械性損傷的IUA大鼠模型。

材 料 和 方 法

主要材料

動(dòng)物來(lái)源 清潔級(jí)成年雌性SD大鼠105只,6～8周齡,體重200～250 g,購(gòu)自上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動(dòng)物責(zé)任有限公司[SCXK(滬)2012-003],動(dòng)物由復(fù)旦大學(xué)附屬婦產(chǎn)科醫(yī)院動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心飼養(yǎng)。飼養(yǎng)飲條件:每5只合并一籠,室溫21～22 ℃,濕度67%～75% ,自由攝水。

試劑和儀器 LEICA顯微鏡(德國(guó)Leica公司)、石蠟切片機(jī)(金華市益迪醫(yī)療設(shè)備廠)、Masson 染色試劑盒(南京凱基生物科技發(fā)展有限公司)、戊巴比妥鈉、顯微手術(shù)器械(上海金鐘器械廠)、醫(yī)用7-0縫線(上海強(qiáng)生公司)、羊抗鼠CD31一抗(美國(guó)Abcam公司)和兔/鼠通用型免疫組化試劑盒[基因科技(上海)有限公司]。

造模方法

實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分組 105只大鼠根據(jù)損傷范圍的不同隨機(jī)分為A組(2.5 cm×0.5 cm,即全周徑子宮內(nèi)膜切除)、B組(2.5 cm×0.25 cm,即半周徑子宮內(nèi)膜切除)和C組(假手術(shù),只做切口不切除內(nèi)膜),每組35只大鼠。

造模步驟 取6～8周齡雌性SD大鼠適應(yīng)環(huán)境1周,術(shù)前禁食1晚,按2%戊巴比妥鈉0.3 mL/100 g體重,腹腔注射麻醉,固定大鼠。剃除下腹部皮膚毛發(fā),75%乙醇消毒。在無(wú)菌手術(shù)操作臺(tái)中于恥骨聯(lián)合上方2～3 cm處縱向切開腹壁皮膚2.5 cm,逐層切開組織,進(jìn)入腹腔,緩慢挑出大鼠的Y型子宮,A、B兩組雙側(cè)宮角同時(shí)手術(shù),左側(cè)宮角為造模側(cè),右側(cè)宮角為自身對(duì)照(只做切口,不損傷內(nèi)膜),C組左側(cè)宮角只做切口不切除內(nèi)膜,右側(cè)宮角不處理。眼科直剪于子宮中段正中央縱向剪開長(zhǎng)2.5 cm切口,保留子宮系膜完整,眼科彎剪垂直于子宮縱切口,逐個(gè)部位將子宮內(nèi)膜剪除,徹底去除子宮內(nèi)膜全層,深度控制在不突破子宮漿膜面,即確保子宮漿膜面的完整性,剪除直至子宮壁菲薄半透明為止。B組以子宮系膜為界,只去除1/2宮腔面積的子宮內(nèi)膜。子宮內(nèi)膜切除完成后,無(wú)菌紗布徹底止血,7-0縫線間斷縫合子宮,將子宮還納至腹腔,生理鹽水沖洗腹腔,關(guān)腹。C組只沿子宮中段做相同長(zhǎng)度縱切口,不切除子宮內(nèi)膜(圖1)。

A:Bilateral uteruses in rat after opening the abdomen;B:A longitudinal incision about 2.5 cm along the uterus was made;C:In the surgery of endometrial resection,endometrium had not been completely removed;D:Bilateral uteruses were made in the same modeling method.

圖1大鼠子宮內(nèi)膜切除術(shù)步驟
Fig1Thestepsofendometrialexcisioninrats

取材處理 各實(shí)驗(yàn)組造模后按時(shí)間點(diǎn)3、7、15和30天分別處死5只大鼠取材,以C組子宮作為對(duì)照組。取材后記錄子宮狹窄、堵塞情況,4%多聚甲醛固定組織,行石蠟包埋、切片,分別行HE、Masson及CD31染色。

子宮內(nèi)膜腺體數(shù)量、纖維化面積比、微血管密度(micro vascular density,MVD)測(cè)定方法 顯微視野選擇方法:A造模組和C假手術(shù)組隨機(jī)選取內(nèi)膜處視野進(jìn)行拍攝,B造模組則在切除內(nèi)膜一側(cè)選取視野,3組選取視野的放大倍數(shù)相同。HE染色觀察子宮內(nèi)膜造模后腺體數(shù)量:每張HE染色切片選取6個(gè)低倍鏡視野(×40),計(jì)算每個(gè)視野下腺體的數(shù)量,取其平均值。Masson染色計(jì)算纖維化面積比率:每張Masson切片選取8個(gè)高倍鏡視野(×200),纖維化面積比率為每個(gè)視野子宮內(nèi)膜間質(zhì)纖維化(膠原染色陽(yáng)性面積)的總面積除以子宮內(nèi)膜間質(zhì)和腺體面積(整個(gè)視野面積)的總和,取平均值,以Image Proplus圖像分析軟件自動(dòng)計(jì)算完成,評(píng)估造模后子宮內(nèi)膜損傷和IUA的形成情況;CD31染色計(jì)算MVD,評(píng)價(jià)子宮內(nèi)膜損傷及血供情況。

子宮腔通暢性評(píng)分方法 評(píng)分標(biāo)準(zhǔn):將造模術(shù)后30天的大鼠子宮置于白色濾紙上,1 mL注射器從子宮卵巢端向大鼠宮腔內(nèi)推入同等體積(約0.5 mL)的亞甲藍(lán)溶液。根據(jù)推入液體所需的力度及濾紙上藍(lán)色區(qū)域面積大小綜合評(píng)分,分為3個(gè)等級(jí)(圖2)。子宮通暢,計(jì)為0分;子宮通而不暢,計(jì)為1分;子宮完全不通暢,計(jì)為2分。IUA評(píng)估包括子宮內(nèi)膜纖維化面積比率和宮腔通暢性兩個(gè)變量,將每只大鼠以上兩個(gè)參數(shù)評(píng)分相加,得到大鼠造模30天后子宮內(nèi)膜纖維化總評(píng)分,評(píng)分越高提示IUA程度越重。

圖2 C組SD大鼠子宮腔通暢性評(píng)估Fig 2 Uterus patency evaluation of group C

妊娠率評(píng)估 造模術(shù)后12周,每組剩余15只大鼠與成年雄性SD大鼠連續(xù)合籠交配過(guò)夜,以合籠后第2天陰道圖片見精子為妊娠第1天,同時(shí)觀察雌鼠體重及腹形變化,于妊娠中晚期開腹探查受試雌鼠雙側(cè)子宮的受孕情況,統(tǒng)計(jì)每組孕鼠個(gè)數(shù)及孕囊或胚胎的數(shù)量,從第1天合籠時(shí)間開始至30天交配實(shí)驗(yàn)完全結(jié)束。

結(jié) 果

觀察造模后子宮內(nèi)膜形態(tài)學(xué)改變子宮內(nèi)膜全層切除術(shù)后3天,A組和B組大鼠子宮病理組織學(xué)均表現(xiàn)為內(nèi)膜上皮細(xì)胞大范圍脫落缺失,局部?jī)H少量殘存上皮附著;子宮內(nèi)膜間質(zhì)水腫明顯,間質(zhì)成分減少;殘余間質(zhì)內(nèi)毛細(xì)血管破裂、出血,伴有大量中性粒細(xì)胞浸潤(rùn)(圖3),其中A組殘存的子宮內(nèi)膜間質(zhì)成分和腺體數(shù)量較B組明顯減少。造模后7天,A組子宮內(nèi)膜上皮再生不明顯,幾乎無(wú)腺體再生,間質(zhì)纖維化明顯,大量膠原蛋白形成,粘連致使大鼠子宮管腔完全粘連閉合(圖4);B組子宮內(nèi)膜扁平腺上皮不同程度再生,間質(zhì)充血水腫逐漸減輕,間質(zhì)纖維化增生不明顯,無(wú)明顯IUA形成或?qū)m腔閉合(圖5)。造模后15天,A組損傷達(dá)肌層、無(wú)上皮間質(zhì)附著的子宮內(nèi)膜基本無(wú)腺上皮再生,而殘存少量間質(zhì)和上皮組織的內(nèi)膜腺上皮層開始逐漸恢復(fù),上皮下少量腺體再生,間質(zhì)仍可見輕度充血、水腫,淋巴細(xì)胞浸潤(rùn),部分子宮可見IUA或有粘連帶形成,腺體稀疏,間質(zhì)纖維化明顯;B組腺上皮再生,內(nèi)膜間質(zhì)仍比正常對(duì)照側(cè)稀薄,有纖維組織增生。造模后30天,A組子宮內(nèi)膜間質(zhì)纖維化,部分子宮內(nèi)膜呈萎縮狀態(tài),仍可見子宮內(nèi)膜上皮細(xì)胞全層缺失,間質(zhì)稀薄或僅有少量間質(zhì)殘存;局部子宮肌層裸露,無(wú)間質(zhì)及上皮附著;部分子宮肌層缺失,僅有少數(shù)子宮內(nèi)膜上皮可再生,間質(zhì)修復(fù)困難;B組子宮內(nèi)膜上皮基本恢復(fù),間質(zhì)再生,部分纖維組織形成(圖6)。

本實(shí)驗(yàn)中觀察到采用A造模法造模后30天,大鼠子宮內(nèi)膜呈萎縮狀態(tài),無(wú)粘連形成(圖6 A)共2

圖3 A、B組子宮內(nèi)膜切除術(shù)后3天Masson染色Fig 3 Masson’s trichrome staining of endometrium 3 days after surgery in group A and B

圖4 A組子宮內(nèi)膜切除術(shù)后7天Masson染色Fig 4 Masson’s trichrome staining of endometrium 7 days after surgery in group A

圖5 B組子宮內(nèi)膜切除術(shù)后7天Masson染色Fig 5 Masson’s trichrome staining of endometrium 7 days after surgery in group B

例,病理學(xué)表現(xiàn)為:子宮內(nèi)膜腺體消失,零星散在管腔閉鎖的微血管,MVD和纖維化面積比率均較A組其余樣本低。提示A造模術(shù)式對(duì)子宮內(nèi)膜損傷較為徹底,采用子宮內(nèi)膜全層切除法造模后可形成IUA模型和子宮內(nèi)膜萎縮模型。

造模后子宮內(nèi)膜腺體數(shù)量統(tǒng)計(jì)A組各時(shí)間點(diǎn)腺體數(shù)量明顯少于其余2組(P<0.00 1),差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義;B、C兩組相比較,差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.054),其中B組腺體數(shù)量在造模術(shù)后15天恢復(fù)至C組水平;A、B兩組相比較,A組腺體數(shù)量低于B組,隨時(shí)間變化,A組腺體數(shù)量?jī)H呈緩慢增長(zhǎng),至術(shù)后30天,仍然不能增長(zhǎng)至C組水平。由此說(shuō)明,A組造模術(shù)式對(duì)子宮內(nèi)膜造成的損傷較為徹底(圖7)。

圖6 A和B組子宮內(nèi)膜切除術(shù)后30天Masson染色Fig 6 Masson’s trichrome staining of endometrium 30 days after surgery in group A and B

A:2.5 cm×0.5 cm;B:2.5 cm×0.25 cm;C:Sham operation.The same in the other figures and tables.

圖7A、B、C組腺體數(shù)量比較
Fig7ComparisonofglandquantitybetweengroupA,BandC

造模后CD31標(biāo)記的子宮內(nèi)膜MVD統(tǒng)計(jì)A、B模型組與C假手術(shù)組MVD相比較,A組各時(shí)間點(diǎn)MVD明顯低于其余2組(P均<0.000 1);B、C兩組差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.303);A組MVD明顯低于B組,且隨著時(shí)間的增長(zhǎng),A造模組MVD增長(zhǎng)緩慢,各時(shí)間點(diǎn)相比較,差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.543),A造模組MVD水平至術(shù)后30天,明顯低于B、C兩組(圖8、9)。

子宮內(nèi)膜纖維化面積比率和子宮腔通暢性評(píng)分子宮內(nèi)膜Masson染色后膠原纖維顯微鏡下呈藍(lán)色,排列較整齊,血管和肌肉呈暗紅色(圖10),A、B、C組造模術(shù)后30天,A組有大量纖維組織形成, 膠原纖維彌漫子宮內(nèi)膜間質(zhì);B組亦有較多量纖維組織形成,子宮內(nèi)膜切除面膠原聚集,少量腺體及新生毛細(xì)血管形成。C組纖維組織成分少,僅有少量的膠原纖維分布。子宮內(nèi)膜纖維化面積比率比較,A造模組高于B、C兩組(P<0.01),B造模組高于C組(P<0.05)。各組子宮通暢性評(píng)分比較,A組顯著高于C組,A、B、C組兩兩相比較(PA,B=0.05,PB,C<0.05,PA,C<0.001),均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(表1)。

圖8 A、B、C組子宮內(nèi)膜免疫組化CD31染色(×400)Fig 8 The immunohistochemical staining CD31 of endometrium in group A,B and C (×400)

圖9 A、B、C造模組MVD比較Fig 9 Comparison of MVD between group A,B and C

子宮內(nèi)膜全層切除模型鼠妊娠率情況以大鼠左側(cè)子宮為A、B造模側(cè),右側(cè)子宮采用假手術(shù)作為自身對(duì)照,造模后3個(gè)月與雄鼠合籠,孕囊數(shù)和妊娠率的統(tǒng)計(jì)方法:觀察并統(tǒng)計(jì)A、B、C各組造模單側(cè)宮角(即左側(cè)宮角)的孕囊數(shù)量,并進(jìn)行組間比較,自身對(duì)照側(cè)(即右側(cè)宮角)的孕囊數(shù)量不納入統(tǒng)計(jì)。圖11采用A造模法造模,A圖為造模術(shù)后1個(gè)月IUA實(shí)體圖,見術(shù)后IUA閉塞并形成積液,對(duì)側(cè)子宮未見明顯粘連。B圖為術(shù)后3個(gè)月與雄鼠合籠后妊娠情況,大鼠左側(cè)子宮孕囊數(shù)量較對(duì)側(cè)明顯減少。從表2可知,A組術(shù)后IUA率為60%,高于B組和C組(P<0.001),而妊娠率僅為20%,均低于B、C兩組(P<0.05)。

The three pictures in the first line were taken on the edge of the endometrium,while the others in the second line were taken in the middle of the endometrium.

圖10A、B、C造模組術(shù)后30天子宮內(nèi)膜Masson染色比較(×400)
Fig10Masson’strichromestainingofendometriumgroupA,BandC30daftersurgery(×400)

GroupThe ratio of fibrosis areaUterus patency A0.89±0.071.87±0.16 B0.56±0.031.20±0.17C0.37±0.070.68±0.10

The ratio of fibrosis area:PA,B<0.01,PA,C<0.001,PB,C<0.05;Uterus patency:PA,B=0.05;PB,C<0.05;PA,C<0.001.

R:Right;L:Left.

圖11A模型鼠造模術(shù)后IUA(A)及妊娠(B)情況
Fig11TheIUAperformance(A)andpregnancy(B)ofratingroupA

表2大鼠IUA模型子宮妊娠率

Tab2PregnancyrateinIUAmodelsofrats(n=15)

Pregnancy rate:PA,B<0.05,PA,C<0.001,PB,C=0.01.

討 論

IUA引起的閉經(jīng)、繼發(fā)不孕、反復(fù)流產(chǎn)或前置胎盤、胎盤植入等產(chǎn)科并發(fā)癥嚴(yán)重影響了女性的身心健康[8-9],也是國(guó)內(nèi)外婦產(chǎn)科醫(yī)師長(zhǎng)期以來(lái)棘手的醫(yī)學(xué)難題。IUA分解術(shù)雖能一定程度改善內(nèi)膜條件,但總體治愈率和妊娠率無(wú)明顯提高,IUA的內(nèi)膜修復(fù)機(jī)制到目前為止尚不明確,因此,臨床研究中亟需尋找到合適的IUA動(dòng)物模型,以提供理想的實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ),指導(dǎo)IUA疾病的治療,為實(shí)現(xiàn)“人人享有生殖健康”的奮斗目標(biāo)邁進(jìn)一步。

本實(shí)驗(yàn)經(jīng)過(guò)研究對(duì)比,選取大鼠作為造模動(dòng)物,大鼠具有雙子宮雙宮頸單陰道的特殊解剖結(jié)構(gòu),兩側(cè)子宮不相通,其雙子宮結(jié)構(gòu)可形成自身對(duì)照,是IUA造模動(dòng)物的良好選擇對(duì)象。迄今為止,IUA的動(dòng)物造模方法主要有物理方法、化學(xué)方法和生物方法3類:物理方法包括機(jī)械損傷[10-12]、電凝損傷[13]及熱鹽水損傷[14]等;化學(xué)方法主要使用0.4%甲醛溶液及無(wú)水乙醇等行宮腔注射[15];生物方法包括宮腔內(nèi)成纖維細(xì)胞移植[16]及脂多糖感染聯(lián)合機(jī)械損傷法[17]。

以上方法均能一定程度上造成子宮內(nèi)膜損傷,形成內(nèi)膜纖維化及IUA,但I(xiàn)UA最主要的病因?yàn)楣螌m后的內(nèi)膜基底層損傷[18]。研究報(bào)道指出,妊娠期宮腔操作引起的IUA高達(dá)91%,其中66.7%源于人工流產(chǎn)或自然流產(chǎn)后的刮宮,21.5%源于產(chǎn)后出血[19]。物理方法中電凝損傷或熱鹽水損傷導(dǎo)致的子宮內(nèi)膜凝固型壞死和化學(xué)方法導(dǎo)致的子宮內(nèi)膜腐蝕性炎性壞死,與臨床上機(jī)械性損傷后的修復(fù)反應(yīng)不同,不適合用于IUA 的子宮內(nèi)膜再生功能的研究,本研究采用機(jī)械性損傷方法旨在為子宮內(nèi)膜損傷后的再生修復(fù)研究提供有效的動(dòng)物模型。

如上所述,創(chuàng)傷是IUA發(fā)生的主要病因[20-21]。子宮腔由前壁、后壁及周圍側(cè)壁所組成,單獨(dú)某一壁的損傷不足以導(dǎo)致整個(gè)宮腔的粘連閉塞,損傷面積越大,內(nèi)膜再生能力越差,IUA形成的概率越高。因此,本研究依據(jù)IUA發(fā)生的高危因素,根據(jù)不同的子宮內(nèi)膜切除面積將實(shí)驗(yàn)組分為全周徑子宮內(nèi)膜全層切除組和半周徑子宮內(nèi)膜全層切除組,構(gòu)建IUA大鼠模型。

本實(shí)驗(yàn)前期預(yù)實(shí)驗(yàn)中采用單純搔刮法損傷大鼠子宮內(nèi)膜,證實(shí)單純性機(jī)械搔刮法不足以徹底損傷子宮內(nèi)膜基底層。SD大鼠子宮內(nèi)膜在機(jī)械搔刮后3天起內(nèi)膜腺上皮細(xì)胞即開始再生,7天子宮內(nèi)膜組織完全再生,術(shù)后28天間質(zhì)部位僅有輕微纖維化改變,子宮內(nèi)膜上皮的形態(tài)學(xué)基本恢復(fù),宮腔基本無(wú)粘連帶形成。說(shuō)明單純搔刮法對(duì)子宮內(nèi)膜上皮再生影響較小,無(wú)法構(gòu)建滿意的大鼠IUA模型。而實(shí)驗(yàn)組在此基礎(chǔ)上改進(jìn)的子宮內(nèi)膜全層切除法能較為徹底地切除子宮內(nèi)膜腺上皮及絕大部分間質(zhì),引起SD大鼠的子宮內(nèi)膜全層損傷,構(gòu)建出滿意的大鼠IUA模型,且該模型與人體刮宮導(dǎo)致的IUA較為接近。

本研究顯示,相比于半周徑子宮內(nèi)膜全層切除法,全周徑切除法造模后纖維化評(píng)分和IUA形成率更高,胚胎著床率更低,具有明顯的統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,該實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步證實(shí)子宮腔內(nèi)壁的損傷面積越大,內(nèi)膜再生能力越差,IUA形成的概率越高。另外,本研究還發(fā)現(xiàn),采用子宮內(nèi)膜全層切除法構(gòu)建IUA模型過(guò)程中,損傷深度控制尤為重要,當(dāng)損傷深度達(dá)子宮內(nèi)膜基底層時(shí),切除絕大部分間質(zhì)和腺上皮組織,僅殘留少量腺上皮時(shí),較易構(gòu)建成宮腔粘連模型(圖3),此模型適用于內(nèi)膜損傷后防粘連措施的效果評(píng)價(jià);而當(dāng)損傷深度達(dá)子宮淺肌層甚至深肌層,子宮內(nèi)膜層幾乎完全被切除時(shí),則反而不易形成IUA,如圖5所示,造模后30天觀察,仍見子宮內(nèi)膜萎縮,無(wú)法生長(zhǎng),此模型適用于子宮內(nèi)膜再生修復(fù)的研究,如干細(xì)胞再生修復(fù)。本實(shí)驗(yàn)中A、B、C各組造模后分4個(gè)時(shí)間點(diǎn)進(jìn)行觀察:3、7、15和30天,3組模型中每個(gè)時(shí)間點(diǎn)均有5只大鼠,每組共20只大鼠用于形態(tài)學(xué)觀察。造模術(shù)后30天不形成粘連,組織病理學(xué)表現(xiàn)如圖5所示的實(shí)際樣本數(shù)僅有A模型組中的2例,其組織學(xué)表現(xiàn)為腺體消失,高倍鏡下可觀察到零星散在的微血管,同時(shí)纖維化程度較A組其余樣本明顯小。這2例子宮內(nèi)膜萎縮模型均在A造模組術(shù)后30天觀察到,其余時(shí)間點(diǎn)未見,因此,A組出現(xiàn)內(nèi)膜萎縮的比例為40%,IUA的比例為60%,由此說(shuō)明A造模術(shù)式對(duì)子宮內(nèi)膜損傷較為徹底,采用子宮內(nèi)膜全層切除法造模后可形成IUA模型和子宮內(nèi)膜萎縮模型。分析可能的原因有:(1)與子宮內(nèi)膜切除程度相關(guān),當(dāng)內(nèi)膜切除較為徹底時(shí),因殘留的間質(zhì)成分少,無(wú)明顯纖維蛋白形成,子宮內(nèi)膜術(shù)后30天則表現(xiàn)為萎縮狀態(tài),不形成粘連;(2)與不同時(shí)期病理變化不同有關(guān),子宮內(nèi)膜切除法造模后30天之前的病理表現(xiàn)可能主要以纖維化為主,而造模30天后以子宮內(nèi)膜萎縮為主。這與組織再生修復(fù)過(guò)程相關(guān),造模后3天為急性炎癥期,7～15天為纖維化形成期,造模后30天,損傷部位過(guò)深的內(nèi)膜雖然可由周邊內(nèi)膜爬行覆蓋,但因局部微血管密度低,缺乏血供,從而逐漸萎縮。該實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步表明不孕癥的機(jī)制除了與IUA有關(guān),還可能與子宮內(nèi)膜的萎縮、稀薄有關(guān),正如臨床上刮宮后導(dǎo)致的不孕,并不一定都是由IUA造成的,也有可能與子宮內(nèi)膜萎縮、不生長(zhǎng)有關(guān)。

目前,IUA動(dòng)物模型的造模方法及模型評(píng)估尚無(wú)統(tǒng)一標(biāo)準(zhǔn)。在動(dòng)物造模過(guò)程中,造模后分不同時(shí)間點(diǎn)評(píng)估內(nèi)膜損傷后的形態(tài)學(xué)改變,進(jìn)行IUA形態(tài)學(xué)評(píng)分及纖維化半定量評(píng)分,并評(píng)估妊娠結(jié)局,是目前較為常用的模型評(píng)估方法。綜合以上實(shí)驗(yàn)結(jié)果,本研究采用子宮內(nèi)膜全層切除法建立了較為滿意的大鼠IUA模型,該模型的建立可以從基因、蛋白以及干細(xì)胞等多個(gè)層面深入研究IUA的發(fā)病機(jī)制,并且可以作為一個(gè)平臺(tái)從細(xì)胞因子、生物材料以及干細(xì)胞移植等方面探求新的治療方法并檢測(cè)其有效性及安全性。對(duì)研究臨床IUA發(fā)病機(jī)制及防治方法具有積極意義。

由于大鼠的子宮結(jié)構(gòu)與人類差異較大,且相同品系動(dòng)物間仍存在異質(zhì)性,如何選擇更為合適的動(dòng)物或更為優(yōu)良的造模方法,建立標(biāo)準(zhǔn)化動(dòng)物造模流程,使損傷后的子宮內(nèi)膜病變程度更具標(biāo)準(zhǔn)性和可控性,值得進(jìn)一步探索。與生物及化學(xué)造模方法相比較,本實(shí)驗(yàn)采用的子宮內(nèi)膜全層切除法尚存在一定的不足:沒(méi)有統(tǒng)一切除標(biāo)準(zhǔn),具有一定經(jīng)驗(yàn)性,對(duì)子宮內(nèi)膜切除深度的控制以及內(nèi)膜去除的徹底程度因?qū)嶒?yàn)者操作熟練程度的不同而具有一定差異。因此,本實(shí)驗(yàn)造模全部由一人完成,通過(guò)大量的訓(xùn)練以及擴(kuò)大樣本量來(lái)降低組內(nèi)和組間誤差,后續(xù)如何建立統(tǒng)一化的造模標(biāo)準(zhǔn),尚待進(jìn)一步探索與研究。

參 考 文 獻(xiàn)

[1] ASHERMAN JG.Amenorrhoea traumatica(atretica)[J].ObstetGynaecolBrEmp,1948,55(1):23-30.

[2] GARGETT CE,Masuda H.Adult stem cells in the endometrium[J].MolHumReprod,2010,16(11):818-834.

[3] BOSTEELS J,KASIUS J,WEYERS S,etal.Hysteroscopy for treating subfertility associated with suspected major uterine cavity abnormalities[J].CochraneDatabaseSystRev,2013(1):CD009461.

[4] MAE WH,BRIAN S,MATTHEW T,et al.Intrauterine adhesion prevention after hysteroscopy:a systematic review and meta-analysis[J].AmJObstetGynecol,2016,215(3):267-275.

[5] YU D,WONG YM,CHEONG Y,etal.Asherman syndrome-one century later[J].FertilSteril,2008,89(4):759-779.

[6] GAMBADADAURO P,GUDMUNDSSON J,TORREJON R.Intrauterine adhesions following conservative treatment of uterine fibroids[J]ObstetGynecolInt,2012:853269.doi:10.1155/2012/853269.

[7] AL-INANY H.Intrauterine adhesions.An update [J].ActaObstetGynecolScand,2001,80(11):986-893.

[8] CONFORTI A,ALVIGGI C,MOLLO A,etal.The management of Asherman syndrome:a review of literature[J].ReprodBiolEndocrinol,2013,11:118.

[9] KHROUF M,MOREL O,HAFIZ A,etal.Evaluation of the rabbit as an experimental model for human uterine synechia[J].HumReprodSci,2012,5(2):175-180.

[10] 陳芳,段華,張穎,等.不同水平雌激素在宮腔粘連形成中的作用及相關(guān)機(jī)制[J].中華婦產(chǎn)科雜志,2010,45(12):917-920.

[11] HUBERLANT S,FERNANDEZ H,VIELLE P,etal.Application of a hyaluronic acid gel after intrauterine surgery may improve sponta-neous fertility:A randomized controlled trial in New Zealand white rabbits[J].PLoSOne,2015,10(5):e125610.

[12] HU J,ZENG B,JIANG X,etal.The expression of marker for endo-metrial stem cell and fibrosis was increased in intrauterine adhesious[J].IntJClinExpPathol,2015,8(2):1525-1534.

[13] 胡曉曉.小鼠子宮內(nèi)膜電熱損傷模型的建立[D].浙江大學(xué),2013.

[14] 曲軍英,呂一帆,林茵,等.建立小鼠子宮內(nèi)膜損傷模型的研究[J].福建醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào),2011,45(1):34-36.

[15] SCHENKER JG,POLISHUK WZ.Regeneration of rabbit endometrium following intrautine instillation of chemical agents[J].GynecolInvest,1973,4(1):1-13.

[16] POLISHUK WZ,SCHENKER JG.Induction of intrauterine adhesions in the rabbit with autogenous fibroblast implants[J].AmJObstetGynecol,1973,115(6):789-794.

[17] LIU F,ZHU ZJ,LI P,etal.Creation of a female rabbit model for intrauterine adhesions using mechanical and infectious injury[J].SurgRes,2013,183(1):296-303.

[18] IN′T ANKER PS,SCHERJON SA,KLEIJBURG-VAN DER KEUR C,etal.Isolation of mesenchymal stem cells of fetal or maternal origin from human placenta[J].StemCells,2004,22(7):1338-1345.

[19] SCHENKER JG,MARGALIOTH EJ.Intrauterine adhesions:an updated appraisal[J].FertilSteril,1982,37(5):593-610.

[20] SALZANI A,YELA DA,GABIATTI JR,etal.Prevalence of uterine synechia after abortion evacuation curettage[J].SaoPauloMedJ,2007,125(5):261-264.

[21] MARCH CM.Management of Asherman’s syndrome[J].RepBiomedOnline,2011,23(1):63-76.