熊佳偉 顧紀鋒 石碗如 吳甦潛 麥爾哈巴·肖開提 朱依諄 莫曉芬△

(1復(fù)旦大學(xué)附屬眼耳鼻喉科醫(yī)院眼科, 2藥劑科 上海 200031; 3澳門科技大學(xué)藥學(xué)院 澳門 999078;4復(fù)旦大學(xué)藥學(xué)院藥理學(xué)與生物化學(xué)教研室 上海 201203)

益母草堿(leonurine,SCM-198)作為益母草主要活性成分之一,最初因其在心腦血管系統(tǒng)疾病中能夠發(fā)揮抑制血小板聚集、降低外周血管阻力、減輕氧化應(yīng)激損傷、調(diào)節(jié)L型Ca2+通道活性等作用而受到關(guān)注[1-3]。進一步研究發(fā)現(xiàn),它還能通過下調(diào)TLR4及NF-κB活化,影響一系列下游信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路,在全身多種炎癥性疾病中發(fā)揮強大的抗炎作用,且無明顯不良反應(yīng)[4-6]。眼科多種疾病(如葡萄膜炎等)均與炎癥關(guān)系密切。由于血-房水屏障(blood-aquaous-barrier,BAB)、血-視網(wǎng)膜屏障(blood-retina-barrier,BRB)等血-眼屏障的存在,全身給藥的抗炎治療效果不明顯、不良反應(yīng)大,而局部治療(如眼內(nèi)注射等)又存在并發(fā)癥風(fēng)險等問題,故亟需尋找抗炎作用穩(wěn)定、給藥方便、不良反應(yīng)可控的新藥。SCM-198在急性乳腺炎、急性腎損傷等動物模型的前期研究中已被證實具有穩(wěn)定的抗炎作用[5-6],且作為小分子化合物,其可透過血-眼屏障,由此帶來其在眼科疾病治療方面潛在的應(yīng)用前景。本研究系首次在葡萄膜炎大鼠模型上開展益母草堿作用的研究,通過灌胃方式給藥,研究了 SCM-198在SD大鼠急性內(nèi)毒素性葡萄膜炎(endotoxin induced uveitis,EIU)模型中的保護作用,并初步探討可能的作用機制。

材 料 和 方 法

動物、主要試劑及儀器SPF級雄性SD大鼠36只(上海西普爾-必凱實驗動物有限公司),初始體重180～200 g。0.9% NaCl注射液(浙江天瑞藥業(yè)有限公司);地塞米松磷酸鈉注射液(山東辰欣藥業(yè)股份有限公司);SCM-198(復(fù)旦大學(xué)藥學(xué)院朱依諄教授課題組惠贈);甲苯塞嗪鹽酸鹽(美國Sigma Aldrich公司);鹽酸氯胺酮注射液(福建古田藥業(yè)有限公司);S.typhiLPS(美國Sigma Aldrich公司);TNF-α、IL-1β、IL-6、ICAM-1一抗,對應(yīng)二抗(英國Abcam公司),BCA試劑盒(美國Sigma Aldrich公司)。33 Ga顯微注射器(瑞士Hamilton公司);Espion E2小動物ERG檢測系統(tǒng)(美國Diagnosys公司);眼科顯微手術(shù)系統(tǒng)(蘇州六六視覺科技股份有限公司)。

實驗方法及檢測指標(biāo)記錄體重后將全部大鼠隨機分為3組:陰性對照組6只,每日0.9% NaCl注射液10 mL/kg體重灌胃;陽性對照組6只,每日50 mg/L地塞米松磷酸鈉溶于生理鹽水注射液10 mL/kg體重灌胃;實驗組4個亞組、每個亞組6只,分別以每日每千克體重10、20、40、80 mg的SCM-198生理鹽水灌胃。共21天,組間飼養(yǎng)無差異,其間每7天記錄體重。第18天灌胃結(jié)束后,各組大鼠以加入0.018 75 g/mL甲苯塞嗪鹽酸鹽的0.05 g/mL鹽酸氯胺酮注射液4 mL/kg體重腹腔注射麻醉、充分暗適應(yīng)(2 h)后行ERG檢測;第21天灌胃后以1 g/L的傷寒沙門氏菌(S.typhi) LPS生理鹽水溶液0.1 mL于全部大鼠左足底注射建立EIU模型[7],造模后24 h再次如上麻醉并行ERG檢測;之后由2位有經(jīng)驗的眼科醫(yī)師于雙盲下行裂隙燈下雙眼炎癥評分[8],方法如表1,33 Ga顯微注射器于手術(shù)顯微鏡下取左眼房水(-80 ℃保存)后處死動物。即刻取右眼眼球,固定后石蠟包埋切片,HE染色,光學(xué)顯微鏡下圖像采集觀察,留取白片,免疫組織化學(xué)(immunohistochemistry,IHC)染色檢測TNF-α、ICAM-1的表達。對留取的房水解凍、BCA法測定蛋白濃度,Western blot檢測腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factor-α,TNF-α)、白細胞介素-1β(interleukin-1β,IL-1β)、IL-6、細胞間黏附分子-1 (intercellular cell adhesion molecule-1,ICAM-1)表達。

表1 大鼠葡萄膜炎臨床評分指標(biāo)Tab 1 Scoring system for clinical evaluation of uveitis [8]

結(jié) 果

TimeSCM-198 (mgkg-1d-1)80 402010Negative control Positive control Before235±27235±28235±32221±29230±29234±277th day274±19277±11272±34255±49260±29216±2914th day269±31286±27276±32268±53271±37209±2621st day265±25296±32277±27285±54278±34188±16

ItemSCM-198 (mgkg-1d-1)80 402010Negative controlPositive controlOS3.29±1.073.50±1.243.25±1.983.00±1.763.36±1.801.75±0.89OD3.21±1.373.50±1.243.38±1.773.10±1.793.27±1.901.88±1.13

OS:Oculus sinister;OD:Oculus dexter.

圖1 各組大鼠虹膜睫狀體(A)和玻璃體視網(wǎng)膜(B) HE染色結(jié)果Fig 1 The HE staining results of iris and ciliary body (A),retina and vitreous (B) in rats

圖2各組大鼠TNF-α(A)和ICAM-1(B)IHC檢測結(jié)果
Fig2TheIHCresultsofTNF-α(A)andICAM-1(B)inrats

圖3各組大鼠房水Westernblot結(jié)果
Fig3TheWesternblotresultsofaqueoushumorinrats

討 論

與炎癥相關(guān)的眼部病變是不可逆性致盲的重要原因,如葡萄膜炎,好發(fā)于中青年人群,多與自身免疫因素相關(guān)、可伴或不伴全身疾病,可復(fù)發(fā)緩解,臨床治療較為棘手?；A(chǔ)和臨床研究亦證實,糖尿病視網(wǎng)膜病變發(fā)病過程中,長期低度炎癥反應(yīng)刺激是病情進展的重要原因[9-10]。傳統(tǒng)抗炎治療以激素、免疫抑制劑等藥物為主,局部或全身應(yīng)用均有較為明顯的不良反應(yīng),眼部長期應(yīng)用激素可致激素性青光眼、白內(nèi)障,免疫抑制劑局部應(yīng)用刺激性較強;全身應(yīng)用激素可致體型改變、骨質(zhì)疏松、消化道潰瘍等,免疫抑制劑長期應(yīng)用影響生育功能、升高惡性腫瘤發(fā)病風(fēng)險等。綜上,傳統(tǒng)藥物治療炎癥相關(guān)性眼病受到較大限制。本研究中,雖然地塞米松能在EIU模型大鼠中發(fā)揮較強的抗炎作用,但該組大鼠處于高分解代謝狀態(tài)、體重顯著減輕且顯著低于其他各組,存在明顯不良反應(yīng),該項結(jié)果也與既往研究結(jié)果一致。造模前ERG檢測結(jié)果顯示,各組大鼠視網(wǎng)膜功能未見異常,亦未見其他不良反應(yīng),可見SCM-198和地塞米松以本研究所用劑量灌胃21天,眼部安全性良好。

SCM-198近年來被證實可在多器官、系統(tǒng)中發(fā)揮明顯的抗炎作用。其作用機制主要有兩種途徑,一是以直接下調(diào)TLR4活化為核心,TLR4廣泛存在于巨噬細胞等炎癥細胞表面,下調(diào)其活化可降低多種炎癥介質(zhì)表達[5,11-12];二是以下調(diào)NF-κB活性為核心,進而下調(diào)IκB水平,抑制PI3K/Akt、ERK/MAPK、AP-1等多條下游通路,降低多種炎癥因子表達[4-6]。本研究所采用的EIU模型中,LPS誘導(dǎo)急性內(nèi)毒素性葡萄膜炎的發(fā)病機制主要是LPS經(jīng)血液循環(huán),作用于葡萄膜固有組織巨噬細胞表面TLR4,激活巨噬細胞釋放TNF-α、IL-1β等炎癥因子,并進一步上調(diào)其他炎癥因子如IL-6的表達,IL-6進一步激活巨噬細胞、淋巴細胞和中性粒細胞等[13];同時LPS誘導(dǎo)的感染應(yīng)激狀態(tài)下ROS大量產(chǎn)生,進而激活NF-κB,升高下游炎癥介質(zhì)的表達[6,14]。因此,SCM-198針對性下調(diào)上述通路的激活,進而下調(diào)對應(yīng)炎癥因子表達,這種變化在本研究中也得到了形態(tài)學(xué)變化的佐證,因此SCM-198在EIU模型中的抗炎作用是明確的。然而,人類葡萄膜炎病理生理機制仍待明確,遠比EIU模型復(fù)雜。已證實的包括BAB和BRB破壞導(dǎo)致的炎癥細胞浸潤、多種炎癥介質(zhì)過表達,周圍炎癥細胞暴露于細胞因子和趨化因子環(huán)境中引發(fā)的級聯(lián)反應(yīng),及ROS激活導(dǎo)致的多條下游信號通路激活產(chǎn)生的級聯(lián)反應(yīng)等。因此SCM-198在臨床工作中的價值有待深入研究。

本研究采用的模型是LPS介導(dǎo)的急性全葡萄膜炎。既往文獻報道,大鼠造模后4 h內(nèi)出現(xiàn)虹膜血管擴張、睫狀充血,6 h出現(xiàn)前房閃輝、細胞和纖維素滲出、18～24 h炎癥反應(yīng)達到最高峰[7,15],48 h左右炎癥反應(yīng)開始緩解并在4～7天后完全消失[15]。炎癥因子中表達最先上升的是TNF-α和IL-1β,二者能夠上調(diào)IL-6的表達,造模后24 h IL-6表達顯著升高;炎癥恢復(fù)期則表現(xiàn)為IL-10、IL-12、TGF-β等保護性因子表達上升[13,16]。本研究取樣的時點是造模后24 h的炎癥反應(yīng)最高峰。因此裂隙燈下和組織病理學(xué)形態(tài)均觀察到明顯變化。由于TNF-α和IL-1β是最先出現(xiàn)的炎癥因子,故其表達變化和SCM-198對其產(chǎn)生的抑制作用最為明顯,甚至表達低于陽性對照組;IL-6出現(xiàn)晚于兩者,故雖觀察到SCM-198的和DEX對其表達的抑制作用,但各組間差距不如前兩者明顯。

眼科炎癥相關(guān)性疾病一直以來是治療難點和研究熱點。近年來傳統(tǒng)藥物單體、單克隆抗體研發(fā)成為熱點研究方向。日本學(xué)者報道茜草素在EIU模型抗炎中取得良好效果[19-20],其作用機制也與減輕氧化應(yīng)激損傷及后續(xù)級聯(lián)反應(yīng)相關(guān),與本研究異曲同工。多個TNF-α單克隆抗體治療HLA-B27相關(guān)性葡萄膜炎的臨床試驗也取得成效[21]。此類藥物與傳統(tǒng)抗炎藥物作用機制不同,靶向更精準,因而不良反應(yīng)更輕微、可控,未來發(fā)展前景廣闊。本研究中選取的SCM-198已是應(yīng)用于臨床的成熟藥物,未來如能應(yīng)用于眼科領(lǐng)域,將為此類疾病治療作出貢獻。

下一步研究中,我們將致力于對SCM-198應(yīng)用于眼部抗炎的最佳給藥方式、給藥劑量給出更深入的回答。總之,SCM-198灌胃給藥對EIU模型大鼠具有保護作用,SCM-198作為潛在的眼科抗炎藥物,值得進一步研究。

參 考 文 獻

[1] YIN J,WANG HL.Effect on blood rheology and thrombosis in rata myocardial ischemia by motherwort herb[J].ChinJThrombHemos,2001,7(1):13-15.

[2] LIU XH,PAN LL,ZHU YZ.Active chemical compounds of traditional Chinese medicine Herba Leonuri:implications for cardiovascular diseases[J].ClinExpPharmacolPhysiol,2012,39(3):274-282.

[3] XIN H,GU M,WANG WW,etal.Effects of Leonurine on L-type calcium channel in rat ventricular myocytes[J].BiolPharmBull,2012,35(8):1249-1256.

[4] YUAN FL,XU RS,JIANG DL,etal. Leonurine hydrochloride inhibits osteoclastogenesis and prevents osteoporosis associated with estrogen deficiency by inhibiting the NF-κB and PI3K/Akt signaling pathways[J].Bone,2015,75(7):128-137.

[5] SONG X,WANG T,ZHANG Z,etal. Leonurine exerts anti-inflammatory effect by regulating inflammatory signaling pathways and cytokines in LPS-induced mouse mastitis[J].Inflammation,2015,38(1):79-88.

[6] XU D,CHEN M,WU X,etal.Leonurine ameliorates LPS-induced acute kidney injury via suppressing ROS-mediated NF-κB signaling pathway[J].Fitoterapia,2014,97(9):148-155.

[7] 馬翠萍,金浩麗,楊培增,等.傷寒桿菌內(nèi)毒素誘導(dǎo)的SD大鼠全葡萄膜炎[J].中山醫(yī)科大學(xué)學(xué)報,2001,22(6):451-453.

[8] HOEKZEMA R,MURRAY PI,VAN HAREN MA,etal.Analysis of interleukin-6 in endotoxin-induced uveitis[J].InvestOphthalmolVisSci,1991,32(1):88-95.

[9] VAGAJA NN,BINZ N,MCLENACHAN S,etal.Influence of endotoxin-mediated retinal inflammation on phenotype of diabetic retinopathy in Ins2 Akita mice[J].BrJOphthalmol,2013,97(10):1343-1350.

[11] LIU XH,PAN LL,DENG XY,etal.Leonurine (SCM-198) attenuates myocardial fibrotic response via inhibition of NADPH oxidase 4[J].FreeRadicBioMed,2013,54(1):93-104.

[12] LIU XH,PAN LL,YANG HB,etal.Leonurine attenuates lipopolysaccharide-induced inflammatory responses in human endothelial cells:Involvement of reactive oxygen species and NF-κB pathways[J].EurJPharmaco,2012,680(1-3):108-114.

[13] SMITH JR,HART PH,WILLIAMS KA.Basic pathogenic mechanisms operating in experimental models of acute anterior uveitis[J].ImmunolCellBiol,1998,76(6):497-512.

[14] ZHA L,CHEN J,SUN S,etal.Soyasaponins can blunt inflammation by inhibiting the reactive oxygen species-mediated activation of PI3K/Akt/NF-kB pathway[J].PLoSOne,2014,9(9):e107655.

[15] KELES S,HALICI Z,ATMACA HT,etal.The ocular endothelin system:a novel target for the treatment of endotoxin-induced uveitis with bosentan[J].InvestOphthalmolVisSci,2014,55(6):3517-3524.

[16] LENNIKOV A,KITAICHI N,NODA K,etal.Amelioration of endotoxin-induced uvetitis treated with an Iκ B kinase β inhibitor in rats[J].MolVis,2012,18:2586-2597.

[17] YU K,LI XM,XU XL,etal.Eupatilin protects against tumor necrosis factor-α-mediated inflammation in human umbilical vein endothelial cells[J].IntJClinExpMed,2015,8(12):22191-22197.

[18] VAN HOVE I,LEFEVERE E,DE GROEF L,etal.MMP-3 deficiency alleviates endotoxin-induced acute inflammation in the posterior eye segment[J].IntJMolSci,2016,17(11):pii:E1825.

[19] SATO K,MIHARA Y,KANAI K,etal.Tyrosol ameliorates lipopolysaccharide-induced ocular inflammation in rats via inhibition of nuclear factor (NF)-κB activation[J].JVetMedSci, 2016,78(9):1429-1438.

[20] KANAI K,NAGATA S,HATTA T,etal.Therapeutic anti-inflammatory effects of luteolin on endotoxin-induced uveitis in Lewis rats[J].JVetMedSci,2016,78(8):1381-1384.

[21] GUEUDRY J,THORNE JE,BANSIE R,etal.Biologic therapy for HLA-B27-associated ocular disorders[J].OculImmunolInflamm,2017,25(2):169-178.