王 頡 劉 鋒

(復(fù)旦大學(xué)生物醫(yī)學(xué)研究院醫(yī)學(xué)系統(tǒng)生物學(xué)研究中心 上海 200032)

結(jié)直腸癌是最常見(jiàn)的一類消化系統(tǒng)惡性腫瘤,發(fā)病原因復(fù)雜,由多種因素共同影響,位居我國(guó)惡性腫瘤發(fā)病率第4位,死亡率第5位[1-2]。由于尚未發(fā)現(xiàn)有效的診斷方法,難以早期準(zhǔn)確診斷結(jié)直腸癌,當(dāng)患者由于明顯的腹部病癥而確診時(shí)大多數(shù)已到中晚期[3]。

COL3A1作為一種Ⅲ型膠原,主要存在于細(xì)胞外基質(zhì)中,在人體內(nèi)皮膚、血管內(nèi)膜、肌肉等結(jié)締組織中含量豐富。Ⅲ型膠原缺乏會(huì)導(dǎo)致機(jī)體內(nèi)與結(jié)締組織相關(guān)的結(jié)構(gòu)穿孔、撕裂、折斷甚至破碎[4-6]。COL3A1基因全長(zhǎng)約44 kb,共有52個(gè)外顯子,位于人2號(hào)染色體q24.3～q3區(qū)域。COL3A1基因存在明顯的多態(tài)性,具有多種等位基因[7]。COL3A1基因多態(tài)性及表達(dá)量與動(dòng)脈瘤的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān),COL3A1表達(dá)失衡將會(huì)導(dǎo)致動(dòng)脈瘤樣的擴(kuò)大從而嚴(yán)重影響患者的生存率[6]。肺部成纖維細(xì)胞中COL3A1高表達(dá)將會(huì)增加癌變風(fēng)險(xiǎn)[8-9]。COL3A1的膜上受體GPR56與其相互作用可抑制神經(jīng)元的移行,并且GPR56下調(diào)表達(dá)可促進(jìn)黑色素瘤細(xì)胞的轉(zhuǎn)移[10-13]。部分小分子RNA(如mir-29 a、mir-29b、mir-29c、let-7d)以COL3A1為靶向分子參與腫瘤的發(fā)生發(fā)展[14-19]。與配對(duì)的正常組織相比,結(jié)腸癌中COL3A1的轉(zhuǎn)錄水平明顯增高,且轉(zhuǎn)錄水平隨腫瘤惡化程度的增高而增加,表明COL3A1和腫瘤的發(fā)展相關(guān)。

我們研究發(fā)現(xiàn),與結(jié)腸癌腫瘤組織的中心區(qū)域和正常組織相比,結(jié)腸癌肝轉(zhuǎn)移的邊緣組織中COL3A1表達(dá)量顯著增加,COL3A1可能在腫瘤轉(zhuǎn)移過(guò)程中發(fā)揮作用。COL3A1在腫瘤發(fā)展過(guò)程中的作用和機(jī)制尚未得到明確闡釋,COL3A1高表達(dá)與臨床病理參數(shù)及預(yù)后的關(guān)系需要進(jìn)一步探索。本文旨在進(jìn)一步了解COL3A1蛋白在結(jié)直腸癌增殖過(guò)程中的作用,為結(jié)直腸癌的診斷治療提供支持。

材 料 和 方 法

主要實(shí)驗(yàn)儀器CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱(美國(guó)Thermo Fisher Scientific公司);多功能酶標(biāo)儀Synergy H4 (美國(guó)BioTek公司);細(xì)胞計(jì)數(shù)儀(美國(guó)Beckman Coulter公司);電泳系統(tǒng)(美國(guó)Bio-rad公司);LAS-3000成像系統(tǒng)(日本Fujifilm株式會(huì)社);倒置拍照顯微鏡DP70 (日本Olympus株式會(huì)社)。

材料和試劑人結(jié)直腸癌細(xì)胞系Lovo、HCT116、SW480、SW620、Hela及HEK293T細(xì)胞(中國(guó)科學(xué)院上海細(xì)胞庫(kù));細(xì)胞培養(yǎng)皿/板(美國(guó)Corning公司);細(xì)胞培養(yǎng)基DMEM高糖、DMEM/F12、低血清培養(yǎng)基Opti-MEM及胎牛血清(美國(guó)Gibco公司);0.25%胰蛋白酶及Lipofectamine 2000轉(zhuǎn)染試劑(美國(guó)Invitrogen公司);限制性核酸內(nèi)切酶、T4DNA連接酶及PCR聚合酶(美國(guó)NEB公司);感受態(tài)細(xì)胞DH5α(北京天根生化科技有限公司);PCR產(chǎn)物回收試劑盒、DNA凝膠回收試劑盒及質(zhì)粒小抽試劑盒(德國(guó)QIAGEN公司)。

細(xì)胞培養(yǎng)HCT116、SW480、SW620、Hela及HEK293T細(xì)胞系使用DMEM高糖培養(yǎng)基培養(yǎng),Lovo細(xì)胞使用DMEM/F12培養(yǎng)基培養(yǎng),所有細(xì)胞培養(yǎng)基含10%胎牛血清和1%青霉素/鏈霉素,置于37 ℃、5% CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

瞬時(shí)過(guò)表達(dá)載體pcDNA3.1A-COL3A1構(gòu)建及擴(kuò)增使用pcDNA3.1A構(gòu)建COL3A1表達(dá)載體,通過(guò)NCBI在線數(shù)據(jù)庫(kù)獲取COL3A1[Homo sapiens (human),Gene ID:1281]序列,根據(jù)載體信息,設(shè)計(jì)酶切位點(diǎn),合成引物,pcDNA3.1-COL3A1-F:5’-CTAGCTAGCTAGATGATGAGCTTTGT-GCAAAA-3’;pcDNA3.1-COL3A1-R:5’-ATTTG-CGGCCGCTTTATTATAAAAAGCAAACAGGG-C-3’。使用人正常成纖維細(xì)胞系CCD18CO全cDNA為模板,經(jīng)PCR后進(jìn)行產(chǎn)物回收,對(duì)PCR回收產(chǎn)物和空載體進(jìn)行雙酶切并連接,隨后轉(zhuǎn)染DH5α感受態(tài)細(xì)胞,涂板培養(yǎng)并進(jìn)行菌落PCR,挑選陽(yáng)性菌落測(cè)序驗(yàn)證,測(cè)序正確后擴(kuò)大培養(yǎng),待菌液D600達(dá)到0.5～0.8時(shí)提取質(zhì)粒,保存并備用。

siRNA瞬時(shí)干擾基因表達(dá)實(shí)驗(yàn)使用siRNA對(duì)貼壁腫瘤細(xì)胞系進(jìn)行瞬時(shí)基因表達(dá)干擾操作。siRNA序列如下:si1正義鏈,5’-GCUGAAGGAA-AUAGCAAAUTT-3’;si2正義鏈,5’-CGGUCCU-AAAGGAAAUGAUTT-3;si3正義鏈,5’-CCUG-GUGGUAAAGGCGAAATT-3’;陰性對(duì)照(NC)正義鏈,5’-UUCUCCGAACGUGUCACGUTT-3’。將轉(zhuǎn)染試劑與siRNA溶液加入Opti-MEM降血清培養(yǎng)基中,輕輕混勻,室溫靜置20 min后滴加到細(xì)胞培養(yǎng)板中,繼續(xù)培養(yǎng)48 h。

MTT法檢測(cè)細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期狀態(tài)良好的待處理細(xì)胞,胰蛋白酶消化計(jì)數(shù);按實(shí)驗(yàn)需求使用完全培養(yǎng)基稀釋并重懸細(xì)胞,以每孔1 000個(gè)細(xì)胞數(shù)接種于96孔板中,共接種5塊板,置于37 ℃、5%CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中持續(xù)培養(yǎng),每天取出1塊板,加入20μL MTT工作液(5 mg/mL),37 ℃孵育4 h后去除上清,加入200μL DMSO,震蕩溶解10 min。酶標(biāo)儀在490 nm波長(zhǎng)下測(cè)定吸光度(D),繪制細(xì)胞生長(zhǎng)曲線,連續(xù)檢測(cè)5天。

平板克隆形成實(shí)驗(yàn)取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期狀態(tài)良好的待處理細(xì)胞,胰酶消化計(jì)數(shù),按實(shí)驗(yàn)需求使用完全培養(yǎng)基稀釋并重懸細(xì)胞,以每孔200個(gè)細(xì)胞接種于6孔板中,置于37 ℃、5%CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中持續(xù)培養(yǎng),2周后去除培養(yǎng)基,PBS溶液洗滌3遍,使用0.05%結(jié)晶紫溶液染色15 min,PBS溶液洗滌3遍,自然干燥后拍照記錄,計(jì)算細(xì)胞克隆數(shù)目。

Westernblot檢測(cè)當(dāng)對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞至90%匯合度時(shí),去除培養(yǎng)基,使用預(yù)冷PBS溶液洗滌2次,加入SDS細(xì)胞裂解液冰上裂解20 min,提取蛋白質(zhì)并使用BCA法進(jìn)行蛋白質(zhì)定量。進(jìn)行SDS-PAGE并轉(zhuǎn)膜后孵育抗體,ECL化學(xué)發(fā)光檢測(cè)抗體。

統(tǒng)計(jì)學(xué)方法所有數(shù)據(jù)采用SPSS 11.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)處理。對(duì)照組與實(shí)驗(yàn)組間采用t檢驗(yàn),差異顯著性檢驗(yàn)水平設(shè)為雙尾0.05。

結(jié) 果

COL3A1調(diào)控細(xì)胞的增殖及克隆形成使用siRNA瞬時(shí)干擾及瞬時(shí)過(guò)表達(dá)載體轉(zhuǎn)染結(jié)直腸癌細(xì)胞系HCT116、SW480、SW620,下調(diào)或上調(diào)COL3A1蛋白質(zhì)水平(圖1)。

Lane 1:pcDNA3.1;Lane 2:pcDNA-COL3A1;Lane 3:NC-COL3A1;Lane 4:si-COL3A1.

圖1在結(jié)腸癌細(xì)胞系HCT116、SW480和SW620中瞬時(shí)沉默及過(guò)表達(dá)COL3A1的Westernblot結(jié)果
Fig1WesternblotresultsoftransientsilencingandoverexpressionofCOL3A1incoloncancercelllinesHCT116,SW480andSW620

在結(jié)直腸癌細(xì)胞系HCT116、SW480及SW620中,使用siRNA瞬時(shí)干擾COL3A1表達(dá),并進(jìn)行MTT實(shí)驗(yàn),結(jié)果發(fā)現(xiàn)與轉(zhuǎn)染陰性對(duì)照相比,下調(diào)COL3A1表達(dá)將抑制腫瘤細(xì)胞增殖(HCT116,P=0.014;SW480,P=0.007;SW620,P=0.005;圖2)。

在結(jié)直腸癌細(xì)胞系HCT116、SW480及SW620中,使用siRNA瞬時(shí)過(guò)表達(dá)COL3A1,并進(jìn)行MTT實(shí)驗(yàn),結(jié)果發(fā)現(xiàn)與轉(zhuǎn)染空載體相比,上調(diào)COL3A1表達(dá)將促進(jìn)腫瘤細(xì)胞增殖(HCT116,P=0.003;SW480,P=0.010;SW620,P=0.014;圖3)。

使用siRNA瞬時(shí)干擾或瞬時(shí)過(guò)表達(dá)改變結(jié)腸癌細(xì)胞系中COL3A1表達(dá)水平,在SW480及SW620中進(jìn)行平板克隆實(shí)驗(yàn),結(jié)果發(fā)現(xiàn)下調(diào)COL3A1表達(dá)可顯著抑制腫瘤細(xì)胞克隆形成,而上調(diào)COL3A1表達(dá)可顯著促進(jìn)克隆形成(圖4)。以上結(jié)果表明COL3A1能夠調(diào)控結(jié)直腸癌細(xì)胞的增殖。

COL3A1通過(guò)調(diào)控激活細(xì)胞Akt/mTOR通路促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的增殖Akt及mTOR處于多條信號(hào)通路的重要交叉點(diǎn),在真核生物的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)中普遍存在,與多種疾病的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)[20]。Akt/mTOR信號(hào)通路的激活可顯著影響腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)、增殖、分化及細(xì)胞周期調(diào)控等[21-23]。COL3A1蛋白質(zhì)水平提高將顯著促進(jìn)細(xì)胞的增殖能力,在HCT116、SW480及SW620細(xì)胞中過(guò)表達(dá)COL3A1,同時(shí)使用siRNA干擾COL3A1表達(dá),Western blot檢測(cè)結(jié)果發(fā)現(xiàn),過(guò)表達(dá)COL3A1激活A(yù)kt/mTOR信號(hào)通路,其中的關(guān)鍵分子mTOR、AKT和PDK1磷酸化程度顯著增高,同時(shí)促進(jìn)下游基因p21和P70S6K的表達(dá);而COL3A1沉默后,mTOR、AKT及PDK1磷酸化程度顯著降低,同時(shí)抑制下游基因p21和P70S6K的表達(dá)(圖5)。

討 論

腫瘤微環(huán)境是腫瘤組織發(fā)生發(fā)展過(guò)程中所處的局部病理環(huán)境,該區(qū)域是癌細(xì)胞與非癌細(xì)胞成分之間相互作用的場(chǎng)所。腫瘤微環(huán)境由包括基質(zhì)細(xì)胞及其所分泌的生化分子在內(nèi)的非癌細(xì)胞成分所構(gòu)成[24]。膠原分子是細(xì)胞外基質(zhì)的主要成分之一,微環(huán)境中的基質(zhì)成分與腫瘤細(xì)胞相互作用,隨著腫瘤的進(jìn)展,膠原分子在基質(zhì)中重組并呈現(xiàn)出相關(guān)動(dòng)態(tài)變化特征。在胃癌細(xì)胞中,COL1A1及COL1A2表 達(dá)量上調(diào)并可作為預(yù)測(cè)胃癌的潛在分子標(biāo)志物[25];在結(jié)腸癌細(xì)胞中,COL6A3可促進(jìn)腫瘤細(xì)胞增殖,并與患者預(yù)后密切相關(guān)[26];COL1A1可促進(jìn)胃癌細(xì)胞的增殖與移行[27];在纖維化肝癌細(xì)胞中,ⅩⅧ型膠原是一種Wnt/β-catenin信號(hào)通路的胞外抑制劑,其免疫反應(yīng)與活化的Wnt信號(hào)負(fù)相關(guān),能夠在胞外與Wnt3α相互結(jié)合從而抑制Wnt依賴的β-catenin信號(hào)的活化[28]。

圖2下調(diào)COL3A1表達(dá)可抑制細(xì)胞增殖
Fig2Down-regulationofCOL3A1expressioninhibitedcellproliferation

圖3上調(diào)COL3A1表達(dá)可促進(jìn)細(xì)胞增殖
Fig3Up-regulationofCOL3A1expressionpromotedcellproliferation

圖4下調(diào)COL3A1表達(dá)可抑制細(xì)胞克隆的形成
Fig4Down-regulationofCOL3A1expressioninhibitedcellcolonyformationability

Lane 1:NC-pcDNA3.1;Lane 2:pcDNA3.1-COL3A1;Lane 3:NC-si;Lane 4:si-COL3A1.

圖5COL3A1激活A(yù)KT/mTOR信號(hào)通路
Fig5COL3A1activatestheAKT/mTORsignalingpathway

COL3A1在乳腺癌、頭頸部腫瘤、腎癌、肺癌、結(jié)直腸癌中高表達(dá),但其在膀胱癌、某些結(jié)直腸癌及部分淋巴瘤中存在下調(diào)趨勢(shì),這提示COL3A1在不同腫瘤中可能存在不同的功能,甚至在同一種類型腫瘤中COL3A1可能在腫瘤的不同發(fā)生階段也會(huì)產(chǎn)生不同的作用。有研究顯示COL3A1 在mRNA水平的上調(diào)將縮短結(jié)直腸癌患者的生存期,同時(shí)結(jié)直腸癌上皮細(xì)胞中COL3A1的高表達(dá)可導(dǎo)致患者的不良預(yù)后。部分研究結(jié)果表明COL3A1的mRNA和蛋白質(zhì)可以作為結(jié)直腸癌的預(yù)后指標(biāo),COL3A1 mRNA及結(jié)直腸癌上皮特異表達(dá)的蛋白質(zhì)水平的增高將增大結(jié)直腸癌患病風(fēng)險(xiǎn)[19,29-31]。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)內(nèi)源過(guò)表達(dá)COL3A1能夠顯著促進(jìn)結(jié)直腸癌細(xì)胞系HCT116、SW480和SW620的生長(zhǎng),平板克隆形成的實(shí)驗(yàn)結(jié)果證實(shí)COL3A1對(duì)腫瘤細(xì)胞的促增殖能力,使用siRNA干擾COL3A1的表達(dá)后,腫瘤細(xì)胞增殖能力減弱。

我們通過(guò)Western blot分析發(fā)現(xiàn),瞬時(shí)過(guò)表達(dá)COL3A1后,mTOR、AKT、PDK1及下游分子p21蛋白質(zhì)水平均有明顯上升。前期的研究也發(fā)現(xiàn),在穩(wěn)定沉默COL3A1后,AKT及mTOR的磷酸化程度明顯降低,由此認(rèn)為在腫瘤細(xì)胞中,COL3A1通過(guò)AKT/mTOR磷酸化信號(hào)通路發(fā)揮作用。這種具有促增殖作用的生物大分子是如何調(diào)控Akt/mTOR通路還需進(jìn)一步研究。

參 考 文 獻(xiàn)

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