李曉春 王莉芳 鄭旭 徐長根 馬麗

1 陜西省食品藥品監(jiān)督檢驗研究院 （陜西 西安 710065）2 咸陽市中心醫(yī)院藥學(xué)部 （陜西 咸陽 712000）

自2014年6月1日起開始施行的《醫(yī)療器械監(jiān)督管理條例》中明確提出國家對醫(yī)療器械按照風(fēng)險程度實行分類管理。第一類是風(fēng)險程度低，實行常規(guī)管理可以保證其安全、有效的醫(yī)療器械。第二類是具有中度風(fēng)險，需要嚴(yán)格控制管理以保證其安全、有效的醫(yī)療器械。第三類是具有較高風(fēng)險，需要采取特別措施嚴(yán)格控制管理以保證其安全、有效的醫(yī)療器械[1]。根據(jù)2017年8月頒布的醫(yī)療器械分類目錄，直腸黏膜修復(fù)敷料屬于無源植入器械中的組織工程支架材料，屬Ⅲ類器械[2]。按照GB/T系列標(biāo)準(zhǔn)[3-6]對直腸黏膜修復(fù)敷料進(jìn)行了細(xì)胞毒性、遲發(fā)型過敏及刺激等生物學(xué)評價，以期為進(jìn)一步的臨床研究提供依據(jù)，現(xiàn)報道如下。

1.資料與方法

1.1 一般資料

供試品：直腸黏膜修復(fù)敷料，A、B、C三個廠家生產(chǎn)，共三批。

材料、藥品、試劑：①高密度聚乙烯，批號：K0M357，美國藥典委員會；②氯化鈉注射液，批號：160130 3G，西安京西雙鶴藥業(yè)有限公司；③優(yōu)級胎牛血清，貨號：TBD21HY，天津市灝洋生物制品科技有限責(zé)任公司；④RPMI培養(yǎng)基，批號：AB10125297，HyClone；⑤青鏈霉素混合液（100×），批號：20170503，Solarbio；⑥胰蛋白酶，批號：SLBP8607V，Sigma；⑦苯酚，批號：20160317，國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

細(xì)胞及動物：①細(xì)胞株，L929細(xì)胞，武漢博士德生物工程有限公司。②白化豚鼠、新西蘭兔，由西安市迪樂普生物資源開發(fā)有限公司提供，實驗動物生產(chǎn)許可證號：SCXK（陜）2014-001。飼養(yǎng)環(huán)境：溫度22～26?C，相對濕度40%～70%，實驗動物使用許可證號：SYXK（陜）2013-00。

儀器：①電子天平，BS2202S，賽多利斯儀器有限公司；②生化培養(yǎng)箱，BSP-250，上海博訊實業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠；③低速臺式離心機(jī)，KA-1000，上海安亭科學(xué)儀器廠；④醫(yī)用凈化工作臺，SW-CJ-2F，蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司；⑤CO2培養(yǎng)箱，HF151，上海力康醫(yī)療設(shè)備有限公司；⑥倒置相差顯微鏡，XSZ-D2，重慶光學(xué)儀器廠。

1.2 方法

1.2.1 遲發(fā)型超敏反應(yīng)封閉貼敷試驗[4]

誘導(dǎo)：試驗前剔除豚鼠背部被毛。豚鼠30只作為試驗組，5只作為對照組。取供試品用吸收性紗布浸透1mL，貼敷于如圖1所示誘導(dǎo)部位，紗布覆蓋，繃帶固定，貼敷6h。1周中連續(xù)3d重復(fù)該操作，同法操作3周。對照組以氯化鈉注射液同法操作。見圖1。

激發(fā)：最后一次誘導(dǎo)后14d，對所有豚鼠于圖1中的激發(fā)部位進(jìn)行激發(fā)，方法同①，貼敷6h。24h后剔除激發(fā)部位及周圍被毛，溫水洗凈擦干，脫毛后至少2h，按表1對試驗部位評分，并于48h再次評分。見表1。

1.2.2 體外細(xì)胞毒性試驗（MTT法）[3,5,6]

試驗樣品及試液的制備：①供試液：無菌條件下將直腸黏膜修復(fù)敷料與含血清培養(yǎng)基按0.2g/mL的比例于37?C浸提24h后2000r/min離心3min，取上清。②陰性對照液：取高密度聚乙烯（厚度為1mm）36cm2，剪成5mm×25mm的小塊，加12mL細(xì)胞生長培養(yǎng)液，37?C浸提24h，過濾除菌。③陽性對照液：5g/L苯酚溶液，過濾除菌，現(xiàn)用現(xiàn)配。④空白對照液：同細(xì)胞生長培養(yǎng)液。

方法：取6塊96孔培養(yǎng)板，每板各設(shè)6孔，每孔接種100μL處于對數(shù)生長期狀態(tài)良好的L929細(xì)胞混懸液，密度為1×104個/mL。置5%CO2培養(yǎng)箱37?C培養(yǎng)24h后，棄去原生長培養(yǎng)液。1-3#板各加100μL供試液，作為供試品組；4#板加100μL空白對照液，作為空白對照組；5#板加100μL的陽性對照液，作為陽性對照組，6#板加100μL的陰性對照液，作為陰性對照組，置CO2培養(yǎng)箱繼續(xù)培養(yǎng)72h。72h后，取出各板，置顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)，每孔加入20μL質(zhì)量濃度為5g/L的MTT溶液，繼續(xù)培養(yǎng)4h后棄去孔內(nèi)液體，每孔加入150μL DMSO，振蕩10min，在酶標(biāo)儀570nm和630nm波長下測定吸光度，按下式計算相對增值率（RGR）。

表1.Magnusson和Kligman分級

注：RGR——相對增值率，%；A——供試品組（陽性及陰性對照組）在570nm和630nm波長下的吸光度的差值；A0——空白對照組吸光度。

根據(jù)RGR按表2判定毒性反應(yīng)分級。見表2。

1.2.3 黏膜刺激試驗[4]

表2.細(xì)胞毒性反應(yīng)分級(%)

表3.口腔、陰莖、直腸和陰道組織反應(yīng)顯微鏡計分系統(tǒng)(分)

選取直腸無明顯刺激癥狀、無缺陷和無損傷的家兔12只，供試品組及對照組各3只。供試品組將受試物原液1mL注入至直腸內(nèi)，對照組以氯化鈉注射液1mL同法處理。每隔24h連續(xù)重復(fù)上述操作，連續(xù)5d。觀察記錄會陰溢液、紅斑及刺激情況。給藥結(jié)束后解剖出直腸組織，觀察黏膜上皮組織。于注射部位取材，常規(guī)石蠟包埋切片，HE染色，LEICA生物顯微鏡觀察。按表3記錄每只動物病理反應(yīng)評分，按表4進(jìn)行刺激反應(yīng)程度分級。見表3、表4。

表4.刺激指數(shù)

2.結(jié)果

2.1 遲發(fā)型超敏反應(yīng)試驗結(jié)果

于激發(fā)后24h及48h觀察，供試品組及對照組中豚鼠的反應(yīng)等級均為0，表明三批直腸黏膜修復(fù)敷料在本試驗條件下對豚鼠皮膚無致敏反應(yīng)，結(jié)果見表5。

2.2 體外細(xì)胞毒性試驗結(jié)果

結(jié)果表明在本實驗室條件下，陽性對照組細(xì)胞毒性反應(yīng)級別為4級，陰性對照組細(xì)胞毒性反應(yīng)級別為0級，直腸黏膜修復(fù)敷料A和C的細(xì)胞毒性反應(yīng)級別≤2級，B的細(xì)胞毒性反應(yīng)級別≤1級，結(jié)果見表6。

2.3 黏膜刺激性試驗結(jié)果

病理檢查結(jié)果顯示：對照組黏膜層上皮結(jié)構(gòu)完整，固有層可見輕到中度炎細(xì)胞浸潤及極輕度水腫，未見明顯血管充血，平均刺激指數(shù)為3.33；試驗組黏膜層上皮結(jié)構(gòu)完整，固有層可見重度炎細(xì)胞浸潤，少數(shù)血管充血及極輕度水腫，平均刺激指數(shù)為試驗組（A）5.33，試驗組（B）6.67，試驗組（C）5.33。

結(jié)果表明在本實驗室條件下，三批直腸黏膜修復(fù)敷料均具輕度刺激，對照組具極輕度刺激。病理檢查結(jié)果見圖2，反應(yīng)計分及程度見表7。

表5.遲發(fā)型超敏反應(yīng)試驗結(jié)果

表6.細(xì)胞毒性試驗結(jié)果

表7.黏膜刺激性試驗結(jié)果(n)

圖2.直腸黏膜修復(fù)敷料病理切片圖

3.討論

醫(yī)療器械的生物學(xué)評價是在器械應(yīng)用于人體之前先模擬體內(nèi)、體外生物學(xué)試驗，再根據(jù)實際需要進(jìn)行動物體內(nèi)實驗，經(jīng)數(shù)據(jù)分析和信息匯總后進(jìn)行安全性評估，最終對該器械應(yīng)用于人體的風(fēng)險性做出預(yù)判。其意義在于預(yù)測醫(yī)療器械在與人體接觸使用過程中的潛在危害，將風(fēng)險性減少到最低的程度，確保使用的安全性[7]。醫(yī)療器械的生物學(xué)評價是確保人體應(yīng)用安全的重要前提，但其本質(zhì)是一項預(yù)測性工作，由于體外與體內(nèi)的情況不能完全等同，動物與人體也存在差異，因此用體外試驗的結(jié)果來推測體內(nèi)的應(yīng)用狀況，用動物試驗得來的結(jié)果去推測人體應(yīng)用的安全與否，是有可能會出現(xiàn)某些偏差的[8]。正是由于醫(yī)療器械生物學(xué)評價的特殊性及局限性，所以不能簡單地只以某一項試驗結(jié)果就做出判斷，而是應(yīng)該建立在綜合考慮分析的基礎(chǔ)上去做整體評價。雖然現(xiàn)在業(yè)內(nèi)已有了一系列的評價標(biāo)準(zhǔn)及方法，但是由于材料科學(xué)和醫(yī)學(xué)科學(xué)的迅猛發(fā)展，各種類型的醫(yī)用產(chǎn)品不斷問世，現(xiàn)有的標(biāo)準(zhǔn)或方法還不足以完全適應(yīng)安全性評價的需求，這將是當(dāng)下醫(yī)療器械的安全性評價領(lǐng)域需要面對和思考的問題。

本文綜合了GB/T16886及GB/T14233的系列標(biāo)準(zhǔn)，對三批直腸黏膜修復(fù)敷料進(jìn)行了生物安全性評價，結(jié)果均符合規(guī)定。初步認(rèn)為三批直腸黏膜修復(fù)敷料用于臨床是安全的。

[1]國務(wù)院.醫(yī)療器械監(jiān)督管理條例[Z].2014-03-07.

[2]國家食品藥品監(jiān)督管理條例.醫(yī)療器械分類規(guī)則[Z].2015-07-14.

[3]中華人民共和國國家質(zhì)量監(jiān)督檢驗檢疫總局/中國國家標(biāo)準(zhǔn)化管理委員會.中華人民共和國國家標(biāo)準(zhǔn)醫(yī)療器械生物學(xué)評價 第12部分:樣品制備與參照樣品[S].2005:4-8.

[4]中華人民共和國國家質(zhì)量監(jiān)督檢驗檢疫總局/中國國家標(biāo)準(zhǔn)化管理委員會.中華人民共和國國家標(biāo)準(zhǔn)醫(yī)療器械生物學(xué)評價 第10部分:刺激與遲發(fā)型超敏反應(yīng)試驗[S].2005:14-16,25-30.

[5]中華人民共和國國家質(zhì)量監(jiān)督檢驗檢疫總局/中國國家標(biāo)準(zhǔn)化管理委員會.中華人民共和國國家標(biāo)準(zhǔn)醫(yī)療器械生物學(xué)評價 第5部分:體外細(xì)胞毒性試驗[S].2003:84-88.

[6]中華人民共和國國家質(zhì)量監(jiān)督檢驗檢疫總局/中國國家標(biāo)準(zhǔn)化管理委員會.中華人民共和國國家標(biāo)準(zhǔn)醫(yī)用輸液、輸血、注射器具檢驗方法第2部分:生物學(xué)試驗方法[S].1993:7-10.

[7]李學(xué)敏.膠原基復(fù)合組織修復(fù)材料的研制及應(yīng)用基礎(chǔ)研究[D].北京:中國協(xié)和醫(yī)科大學(xué),2007.

[8]孫皎.生物材料和醫(yī)療器械的生物學(xué)評價[J].中國醫(yī)療器械雜志,2003,27(1):1-3,8.