韓穎 徐玉茵 周靜 田林奇 柳小軍 張嬌嬌 河南省醫(yī)療器械檢驗檢測工程研究中心 （河南 鄭州 450000）

手術性粘連現(xiàn)象普遍存在于外科手術后，不僅給患者帶來了一定的軀體痛苦而且加重了患者的經(jīng)濟負擔[1]。研究表明，殼聚糖作為一種生物材料，具有止血、抗炎、抑制成纖維細胞生長等作用，是預防傷口粘連的理想材質(zhì)[2]。羧氨基葡聚多糖鈉生物膠體液屬于殼聚糖類衍生物，為無色透明或微黃色澄清液體，常用于術后傷口沖洗，具有防止創(chuàng)面粘連，促進傷口愈合的作用[3]。為了保障其臨床應用的安全性，本研究按照GB/T 16886《醫(yī)療器械生物學評價標準》的要求，對羧氨基葡聚多糖鈉生物膠體液進行生物學安全性評價。

1.資料與方法

1.1 一般資料

實驗材料：小鼠成纖維細胞L-929（ATCC），胎牛血清（Gibco），胰蛋白酶（Gibco），MTT（Sigma），MEM（Gibco），完全弗氏佐劑（Sigma），成年新西蘭兔（華蘭生物疫苗有限公司，合格證號：41001700005019），質(zhì)量2.2～2.7kg，健康初成年白化豚鼠（華蘭生物疫苗有限公司，合格證號：41001700005096），質(zhì)量300～500g。

1.2 方法

1.2.1 體外細胞毒性試驗[4]

無菌條件下取樣品，按照0.1g/mL的浸提比例制備樣品浸提液。將處于對數(shù)生長期的L-929細胞用胰酶消化后，加入細胞培養(yǎng)液，調(diào)整細胞濃度為1×104個/mL。將配置好的細胞懸液接種于96孔板中，每孔100μL。置5%CO2培養(yǎng)箱37?C，培養(yǎng)24h后，棄去原培養(yǎng)液。空白對照組加入新鮮MEM細胞培養(yǎng)液，供試品組加入樣品浸提液，陰性對照組加入高密度聚乙烯浸提液，陽性對照組加入含5%二甲基亞砜的培養(yǎng)液，每孔100μL，置CO2培養(yǎng)箱繼續(xù)培養(yǎng)72h。更換培養(yǎng)液72h后，將上述各組置于顯微鏡下觀察細胞形態(tài)，并在每孔加入5g/L的MTT溶液20μL。繼續(xù)培養(yǎng)4h后棄去孔內(nèi)液體，加入150μL的DMSO，振蕩10min后，在570nm和630nm波長下用酶標儀測定吸光度，并計算相對增值率（試驗組吸光值/空白對照組吸光值×100%）。按表1進行分級標準判定。

表1.細胞毒性反應分級(%)

表2.試驗樣品的細胞相對增值率

1.2.2 皮內(nèi)反應試驗[5]

取新西蘭兔3只，于試驗前12h，剃除家兔背部脊柱兩側被毛。在每只兔脊柱一側的5個點皮內(nèi)注射0.2mL生理鹽水制備的樣品浸提液，脊柱同一側后5個點注射生理鹽水對照液。在每只兔的脊柱另一側注射植物油制備的樣品浸提液和植物油對照液，操作步驟同上。注射后即刻并在24h、48h、72h觀察記錄各注射部位狀況，按標準給出的記分系統(tǒng)對每一觀察期各注射部位的紅斑和水腫的組織反應評分，并記錄試驗結果。在72h評分后，分別將每一試驗樣品和溶劑對照的全部紅斑與水腫記分相加，再除以18 [3（動物數(shù)）×3（觀察期）×2（記分類型）]，計算出每一試驗樣品和每一對應溶劑對照的綜合平均記分。

1.2.3 遲發(fā)型超敏反應試驗[5]

取豚鼠15只，分為試驗組10只，對照組5只，分別剃除動物肩胛骨后側被毛。試驗組在去毛區(qū)域的上、中、下部位分別注射A液（弗氏完全佐劑與生理鹽水1:1混合乳化劑）、樣品浸提液、樣品浸提液與A液（1:1）的混合液，左右對稱各2點。陰性對照組使用同批號生理鹽水，操作同試驗組。皮內(nèi)誘導7d后，用用浸透樣品浸提液和陰性對照液的濾紙片覆蓋誘導注射點。用封閉式繃帶固定濾紙片，并于48h后去除包扎。局部誘導后14d后，剃除豚鼠上腹部被毛，將浸透樣品浸提液和陰性對照液的濾紙片敷貼于去毛部位，封閉固定24h。解除包扎后24h和48h觀察兩組動物激發(fā)部位的皮膚反應情況。按標準中的分級對每一激發(fā)部位和每一觀察時間皮膚紅斑和水腫反應進行描述并分級。

2.結果

2.1 細胞毒性試驗

倒置顯微鏡下觀察可見，陽性組細胞數(shù)量少，形態(tài)呈球形?？瞻讓φ战M和陰性對照組的細胞生長狀態(tài)良好，細胞呈梭形。試驗樣品組可見少量圓形細胞，MTT檢測結果為細胞的相對增值率為80%。說明羧氨基葡聚多糖鈉生物膠體液為極輕的細胞毒性。詳細結果見表2。

2.2 皮內(nèi)反應試驗

試驗結果表明，樣品的兩組浸提液與其相應溶劑對照液的平均記分之差均為0，所以在本試驗條件下，試驗樣品無皮內(nèi)刺激反應。

2.3 遲發(fā)型超敏反應試驗

試驗結果表明，試驗組和對照組動物的皮膚均未出現(xiàn)紅斑和水腫現(xiàn)象。因而，試驗樣品等級評分為0，即在本試驗條件下，樣品無致敏反應。

3.討論

在外科手術后發(fā)生組織粘連是臨床上一種常見的現(xiàn)象，特別是在腹部手術后的粘連常帶來嚴重的并發(fā)癥，如腸梗阻、盆腔炎等，這種現(xiàn)象給患者的身心帶來極大傷害，使患者的生活質(zhì)量下降，因此降低術后粘連的發(fā)生率顯得至關重要。理想的防粘連材料應具有良好的生物相容性、自動黏附性、促進傷口愈合并將纖維組織增生降至最低程度等特性。

本研究按照GB/T 16886《醫(yī)療器械生物學評價標準》的要求，采用細胞毒性、皮內(nèi)反應、遲發(fā)型超敏反應對羧氨基葡聚多糖鈉生物膠體液進行生物學安全性評價。結果表明羧氨基葡聚多糖鈉生物膠體液具有良好的生物相容性。

[1]Moris D, Chakedis J, Rahnemai-Azar AA, et al.Postoperative Abdominal Adhesions: Clinical Significance and Advances in Prevention and Management[J].J Gastrointest Surg.2017,21(10):1713-1722.

[2]Zhu L, Peng L, Zhang YQ.The processing of chitosan and its derivatives and their application for postoperative anti-adhesion[J].Mini Rev Med Chem,2015,15(4):330-337.

[3]蘇朝暉,譚潔銀.羧氨基葡聚多糖鈉生物膠體液在婦產(chǎn)科腹盆腔手術后的應用效果[J].北方藥學,2016,13(4):10-11.

[4]國家藥品監(jiān)督管理局.GB/T16886.10-2005《醫(yī)療器械生物學評價第5部分:體外細胞毒性試驗》[S].北京:中國標準出版社,2003.

[5]國家藥品監(jiān)督管理局.GB/T16886.10-2005《醫(yī)療器械生物學評價第10部分:刺激與遲發(fā)型超敏反應試驗》[S].北京:中國標準出版社,2005.