夏文龍， 余樹培， 吳 植， 郭長明， 盧會鵬， 孫懷昌， 朱善元

(1.江蘇農牧科技職業(yè)學院/江蘇省獸用生物制藥高技術研究重點實驗室，江蘇泰州 225300；2.揚州大學獸醫(yī)學院/江蘇省重要動物疫病與人獸共患病協(xié)同創(chuàng)新中心，江蘇揚州 225009)

豬繁殖與呼吸綜合征(porcine reproductive and respiratory syndrome，PRRS)是由PRRS病毒(PRRSV)引起的一種高度接觸性傳染病，以母豬繁殖障礙和仔豬及育肥豬呼吸道疾病為主要特征[1]。該病于1987年在美國和加拿大首次發(fā)現(xiàn)并迅速蔓延到世界各地，給全球養(yǎng)豬業(yè)造成了巨大經濟損失[2]。2006年，我國大規(guī)模暴發(fā)以高熱、高死亡率為主要特征的PRRS疫情，研究表明其主要病原為高致病性PRRSV變異株[3]，鑒于PRRSV具有復雜的感染及免疫逃避機制[4]，目前防控手段無法將其凈化和根除。

PRRS主要依靠疫苗接種進行預防控制，近年來，有許多學者利用micro-RNA[5]、干擾素[6]、受體阻斷[2]等新策略進行抗病毒研究，而這些研究前提是具備穩(wěn)定、可靠的動物模型，以便評價其保護效果。目前，PRSSV人工感染仔豬主要是通過肌肉注射和滴鼻方式接種[7-8]，缺少接觸感染的相關研究資料，為了模擬PRRSV在豬群內的自然擴散，本試驗通過同居飼養(yǎng)方式在健康豬中引入PRRS病豬，并建立熒光定量RT-PCR方法，動態(tài)監(jiān)測感染仔豬的病毒血癥和排毒水平，為進一步了解PRRSV的傳播機制和建立防治PRRSV感染的仔豬模型提供了參考依據。

1 材料與方法

1.1 主要試劑

AxyPrep質粒DNA小提試劑盒和DNA凝膠回收試劑盒購自AXYGEN公司；rTaqDNA聚合酶、pMD-18T載體、MiniBEST Viral RNA/DNA Extraction Kit、PrimeScript RT Master Mix、SYBR Premix ExTaqⅡ為日本TaKaRa公司產品；PRRS ELISA檢測試劑盒為美國IDEXX公司產品；引物由上海生工生物工程有限公司合成。

1.2 病毒和試驗動物

豬圓環(huán)病毒2型(PCV2)、豬偽狂犬病毒(PRV)、豬瘟病毒(CSFV)、高致病性PRRSV JXA1毒株均由筆者所在實驗室保存；PRRS陰性仔豬購于江蘇省如東某養(yǎng)殖場，動物試驗在江蘇農牧科技職業(yè)學院新獸藥研發(fā)臨床試驗中心進行。

1.3 標準品制備

按照TaKaRa MiniBEST Viral RNA/DNA Extraction Kit操作說明，從PRRSV JXA1病毒液中提取RNA，參考TaKaRa PrimeScript RT Master Mix試劑盒提供的反應體系進行反轉錄，將獲得的cDNA作為模板，利用針對PRRSV ORF7編碼序列的特異性引物(F：5′-GGGGAATGGCCAGYCAGTCAA-3′，R：5′-GCCAGRGGAAAATGKGGCTTCTC-3′)，進行PCR擴增，回收目的片段后，連接pMD-18T載體，轉化DH5α感受態(tài)細胞，挑選陽性克隆并送測序，鑒定正確的重組質粒作為標準品。

1.4 標準曲線繪制

將標準品10倍梯度倍比稀釋作為模板，按照TaKaRa SYBR Premix ExTaqⅡ試劑盒說明書配制反應體系并在ABI 7300儀器上進行熒光定量PCR反應條件的設置，優(yōu)化后的反應程序為：95 ℃預變性30 s；95 ℃變性5 s，60 ℃退火并延伸31 s，共擴增40個循環(huán)，延伸結束收集熒光信號；最后于60～95 ℃過程中制作熔解曲線。

1.5 重復性試驗

為驗證該方法重復性，隨機選取3個不同稀釋度的標準質粒作為模板，重復3次擴增，記錄各模板CT值，計算其變異系數(shù)，變異系數(shù)=標準偏差/平均數(shù)。

1.6 敏感性、特異性試驗

將不同稀釋度的標準品作為模板，分別進行常規(guī)RT-PCR擴增以及實時熒光PCR試驗，以確定2種方法所能檢測的最低拷貝數(shù)，進行靈敏度比較；分別以豬繁殖與呼吸綜合征病毒(PRRSV)和豬瘟病毒(CSFV)RNA反轉錄得到的cDNA，豬圓環(huán)病毒2型(PCV2)和豬偽狂犬病毒(PRV)DNA為模板，并設立空白對照，在相同條件下進行實時熒光PCR反應，分析擴增曲線及CT值，驗證本方法的特異性；將PRRSV cDNA和標準品質粒作為模板進行熒光定量PCR反應后，觀察溶解曲線，確保無引物二聚體及非特異擴增。

1.7 動物試驗分組

將8頭28日齡斷奶仔豬平均分為2組，每組4頭，置于2個負壓隔離器中飼養(yǎng)3～5 d，觀察無異樣表現(xiàn)，前腔靜脈采集血液并分離血清，經ELISA檢測PRRSV特異性抗體為陰性；提取RNA后，通過上述RT-PCR方法檢測PRRSV抗原陰性。第1組作為攻毒組，隨機選擇1頭仔豬肌肉注射和滴鼻接種PRRSV JXA1(1×105TCID50)，與其余3頭健康仔豬同居飼養(yǎng)；第2組作為空白對照組，接種相同量DMEM細胞培養(yǎng)液；試驗期間每日觀察并記錄各仔豬臨床癥狀。

1.8 病毒血癥檢測

在同居飼養(yǎng)后1、3、5、7、10、13 d，前腔靜脈采集每組仔豬血液5 mL并分離血清，取200 μL提取病毒RNA，根據上述定量RT-PCR方法，檢測各血清樣品中病毒基因組拷貝數(shù)。

1.9 糞便排毒檢測

在同居飼養(yǎng)后1、3、5、7、10、13 d，采集每組仔豬糞便1 g并用10 mL PBS溶液重懸，8 000g離心10 min后取200 μL上清，根據上述定量RT-PCR方法，檢測各糞便樣品中PRRSV基因組拷貝數(shù)。

2 結果與分析

2.1 標準質粒鑒定

通過常規(guī)RT-PCR成功擴增預期大小的130 bp目的片段(圖1)，克隆至pMD-18T載體，獲得重組質粒pMD-ORF7，測序結果表明，擴增的cDNA基因片段和已發(fā)表PRRSV ORF7(GenBank登錄號：EF112445)編碼序列的同源性為99.7%。利用紫外分光光度計測其D260 nm值，根據計算公式[9]：質?？截悢?shù)(拷貝/μL)=6.02×1023×質粒濃度/平均分子量，換算標準質粒拷貝數(shù)為2.18×109拷貝/μL。

2.2 標準曲線建立和重復性試驗

將標準質粒連續(xù)10倍系列稀釋，分別取2.18×101～2.18×106拷貝/μL共6個稀釋度作為模板進行熒光定量PCR反應，以CT值為縱坐標、模板拷貝數(shù)為橫坐標，獲得標準曲線(圖2-a)，回歸方程為y=33.855-3.16x，r2=0.996，結果表明，其線性關系良好、相關系數(shù)較高。隨機選取3個不同稀釋度作為模板重復擴增3次，結果表明，每個稀釋度之間的CT值誤差非常小(圖2-b)，變異系數(shù)均小于 0.005，表明該方法具有較高的準確性和重復性。

2.3 靈敏度比較

以不同稀釋度的標準質粒為模板，分別進行常規(guī)RT-PCR和熒光定量RT-PCR試驗，結果表明，常規(guī)RT-PCR方法的最小檢出量為2.18×104拷貝(圖3-a)，熒光定量PCR方法的最小檢出量為2.18×101拷貝(圖3-b)，比常規(guī)方法高1 000倍。

2.4 特異性分析

分別以PRRSV、CSFV RNA反轉錄產物，PCV2和PRV的DNA為模板，相同條件下進行定量RT-PCR反應，結果顯示：僅PRRSV基因組出現(xiàn)擴增曲線，其余樣品檢測結果均為陰性(圖4-a)；隨后以PRRSV反轉錄產物和標準質粒作為模板進行熒光PCR擴增，反應后的熔解曲線波峰單一，無引物二聚體或非特異擴增(圖4-b)，說明本方法具有較好的特異性。

2.5 臨床癥狀觀察

人工接種豬于攻毒后2 d開始即出現(xiàn)體溫升高，并于5 d左右出現(xiàn)呼吸困難、咳嗽等PRRS典型癥狀，持續(xù)至11d死亡； 同居接觸后仔豬于4～5d開始體溫升高，7～8d表現(xiàn)出相應臨床癥狀，并分別于12、13 d全部死亡。

2.6 病毒血癥檢測

定期采集仔豬血清樣品，利用建立的熒光定量RT-PCR方法對病毒血癥進行檢測，檢測結果見圖5。人工接種仔豬在1 d時即為PRRSV檢測陽性，隨后病毒載量逐漸上升，并維持較高水平，病毒載量為108.4～108.7拷貝/mL直至11 d死亡；接觸感染后仔豬在3 d首次檢出PRRSV，7 d內迅速升高至 108.5拷貝/mL，并穩(wěn)定在較高含量，至13 d時3頭仔豬全部死亡；空白對照組仔豬全部血清樣品均檢測為PRRSV陰性。

2.7 糞便排毒檢測

定期采集試驗仔豬糞樣，熒光定量RT-PCR檢測結果見圖6。人工接種后仔豬在3 d為PRRSV檢測陽性，隨后病毒含量呈上升趨勢并維持較高水平，病毒載量為104.5拷貝/g至 11 d 死亡；同居后感染仔豬于5 d PRRSV檢測陽性，7 d排毒量迅速上升至104.0拷貝/g，并穩(wěn)定在較高水平至13 d死亡；空白對照組仔豬糞便檢測結果均為陰性。

3 討論

常規(guī)RT-PCR方法檢測PRRSV在動物體內動態(tài)分布時，僅能做定性或半定量分析，而熒光定量PCR(FQ-PCR)可以確定病毒在動物組織內的精確拷貝數(shù)，因此該技術已越來越多地應用于病毒定量分析的研究中[10]，另外，相比傳統(tǒng)的TCID50法檢測病毒含量，F(xiàn)Q-PCR方法更加快速、穩(wěn)定[11]。本試驗建立的PRRSV FQ-PCR檢測方法靈敏度比常規(guī)RT-PCR高1 000倍，并且特異性強，和其他常見病毒無交叉反應，具有良好的重復性和穩(wěn)定性，為PRRSV接觸感染仔豬后的增殖動態(tài)檢測提供了技術支持。

PRRSV動物感染試驗不易成功，與宿主、病毒和試驗環(huán)境等方面密切相關[12]。豬是PRRSV感染和出現(xiàn)臨床癥狀的唯一宿主，用于PRRSV動物試驗的理想模型是SPF、CDCD(cesarean-derived colostrum-deprived)豬和PRRS陰性豬[13]，前2種試驗豬獲取比較困難，因此，本試驗首先通過RT-PCR和ELISA方法從某PRRS非免疫豬場篩選獲得PRRSV抗原和抗體雙陰性豬，用于感染試驗，而所用PRRSV毒株為高致病代表株JXA1[14]，能夠引起PRRS典型病變；另外，動物試驗均在負壓隔離器中進行，免受外界環(huán)境干擾。以上因素均保證了PRRSV能夠通過接觸傳播感染仔豬。

為模擬自然狀態(tài)下的PRRSV傳播，本試驗首先向1頭易感仔豬肌肉注射和滴鼻接種PRRSV JXA1，隨后將其和另外3頭健康仔豬同居飼養(yǎng)，研究結果表明，人工接種豬于攻毒后2 d開始即出現(xiàn)體溫升高，并于5 d左右出現(xiàn)呼吸困難、咳嗽等PRRS典型癥狀，至11 d死亡，同居接觸仔豬的發(fā)病時間推遲2～3 d，并分別于12、13 d全部死亡；通過熒光定量RT-PCR對接觸感染仔豬的病毒血癥和糞便排毒進行動態(tài)監(jiān)測，結果表明，其血清和糞便分別于3、5 d首次檢測PRRSV陽性，相比人工接種豬推遲2 d左右，病毒在仔豬體內增殖動態(tài)和人工接種豬相似，感染后7 d迅速上升并維持在較高水平，說明仔豬確實死于PRRSV感染。綜上所述，本試驗為建立PRRSV接觸感染仔豬模型奠定了基礎，為高致病性PRRS新型疫苗的研發(fā)及免疫效果評價等研究提供了參考數(shù)據。

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