江 艷， 桑維鈞， 曾爾玲， 王 勇， 王德鳳， 覃 可

(1.貴州大學(xué)農(nóng)學(xué)院，貴州貴陽 50025； 2.貴州大學(xué)煙草學(xué)院，貴州貴陽 550025；3.貴州山地農(nóng)業(yè)病蟲害重點實驗室，貴州貴陽 550025)

煙草約于17世紀(jì)初傳入我國[1-2]，是我國重要的經(jīng)濟作物。煙草行業(yè)在世界各產(chǎn)煙國經(jīng)濟中占有非常重要的地位，我國更是世界上的煙草產(chǎn)銷大國。在生產(chǎn)上，煙草病害是制約煙葉產(chǎn)量提高的重要因素。至2002年，已報道的煙草病害有116種，其中侵染性病害有79種，非侵染性病害37種[3-4]。2016年7月筆者于貴州大學(xué)煙草實習(xí)基地及貴州省遵義市播州區(qū)樂山鎮(zhèn)發(fā)現(xiàn)疑似煙草莖點病，但目前對該病害的報道不多[5-8]。鑒于此，本研究對該病原菌進行形態(tài)學(xué)鑒定，并經(jīng)柯赫氏法則對其致病性進行驗證，分析其rDNA-ITS及LSU基因序列，以明確煙草莖點病的致病菌，為煙草莖點病后期的相關(guān)研究提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 病害癥狀觀察

2016年7月通過對貴州省多個主要產(chǎn)煙區(qū)煙草病害的調(diào)查及采樣，于貴州大學(xué)煙草實習(xí)基地及貴州省遵義市播州區(qū)樂山鎮(zhèn)K326上發(fā)現(xiàn)煙草莖點病，采集具有典型癥狀的煙株莖稈，觀察并記錄病害癥狀。

1.2 病原菌的分離、純化及形態(tài)特征觀察

將所采病莖放在體視顯微鏡下觀察并挑取單個分生孢子器，置于無菌水中制成孢子懸浮液，涂布到水瓊脂(WA)平板上。挑取單孢接種到馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基(PDA)上，28 ℃ 恒溫培養(yǎng)2～3 d，然后進行純化保存，之后轉(zhuǎn)入試管中置于4 ℃條件下保存?zhèn)溆?。如果單孢子不長菌落，則直接挑取單個分生孢子器接種到平板上進行分離。

將保存好的菌株接種于PDA培養(yǎng)基上，于28 ℃恒溫避光培養(yǎng)7 d，觀察記錄菌落形態(tài)及培養(yǎng)特性，觀察分生孢子器和分生孢子的形態(tài)，并測量其大小，參照文獻[9-14]確定煙草莖點病菌的分類地位。

1.3 病原菌的致病性測定

根據(jù)柯赫氏法則，對分離得到的菌株進行致病性測定。選取K326健康的伸根期和旺長期煙株，用經(jīng)滅菌后的接種針刺傷莖稈以造成傷口。刮取在PDA平板上生長7 d的菌絲，接種于2個生長期的莖稈傷口處，同時以不接菌絲為對照。將生長7 d的菌落用打孔器打取直徑為5 mm的菌絲圓片，接種于葉片上，同時以無菌的PDA培養(yǎng)基圓片為對照。莖稈和葉片均用塑料袋保濕48 h，置于28 ℃人工氣候箱中。接種48 h后移去菌絲和菌絲圓片。定期觀察并記載發(fā)病情況和癥狀特點，對病組織進行鏡檢并再次分離，觀察描述病原菌的形態(tài)特征，確定致病菌。

1.4 病原菌的分子生物學(xué)鑒定

參照Cubero等的方法[15]提取菌絲的總DNA。采用引物ITS1/ITS4(5′-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3′/5′-TCCTC CGCTTATTGATATGC-3′)、LROR/LROR5(5′-ACCCGCTGA ACT TAAGC-3′/5′-TCCTGAGGGAAACTTCG-3′)對菌株的DNA進行PCR擴增，分別獲得ITS、LSU2段基因。

擴增ITS基因的PCR反應(yīng)程序：94 ℃ 5 min；94 ℃ 30 s，53 ℃ 30 s，72 ℃ 90 s，共40個循環(huán)；72 ℃延伸10 min。擴增LSU基因的PCR反應(yīng)程序：94 ℃ 5 min；94 ℃ 1 min，48 ℃ 45 s，72 ℃ 1 min，共40個循環(huán)；72 ℃延伸10 min。

所獲得的PCR產(chǎn)物經(jīng)1%瓊膠糖凝膠電泳檢測后送往北京諾賽基因組研究中心有限公司進行測序。采用MAFFT[16]對病原菌的ITS和LSU序列與在GenBank下載的相關(guān)序列進行比對。為實現(xiàn)排序匹配的最優(yōu)化，采用手工校對。比對后的序列采用MrBayes 3.1.2[17]軟件以貝葉斯法[18]構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。

2 結(jié)果與分析

2.1 煙草莖點病癥狀觀察

田間觀察發(fā)現(xiàn)，該病害多發(fā)生在煙株的生育后期，主要危害莖稈部位。發(fā)病初期在煙株莖桿上形成邊緣明顯的近橢圓形或不規(guī)則形灰白色或褐色病斑(圖1-A)，病斑稍凹陷、粗糙。發(fā)病后期多個病斑融合成長條潰瘍，有時甚至擴展至頂部，病部凹陷，上面密生小黑點，即為病菌的分生孢子器(圖1-B)。病重時莖部組織大面積干枯，造成水分和養(yǎng)分的運輸受阻，影響葉片的產(chǎn)量和品質(zhì)。病菌易從打頂抹杈和采葉傷口處侵入。

2.2 病原菌培養(yǎng)性狀與形態(tài)特征

病菌在PDA、麥芽汁瓊脂培養(yǎng)基(MEA)和燕麥瓊脂培養(yǎng)基(OA)上生長良好，25 ℃黑暗條件下培養(yǎng)5 d，菌落直徑分別為4.5、3.7、4.6 cm。由圖2可知，菌落在PDA培養(yǎng)基上呈圓形或近圓形，邊緣整齊，菌落菌絲細(xì)長且密，初期菌絲白色，后變成灰褐色，菌落邊緣為白色。26 ℃黑暗條件下培養(yǎng)6 d可產(chǎn)生大量分生孢子器。分生孢子器散生或聚生，褐色，橢圓形或近球形，器壁薄且內(nèi)壁無色，有孔口，具乳突，大小為82.72 μm×243.93 μm～91.12 μm×255.12 μm。產(chǎn)孢細(xì)胞由分生孢子器內(nèi)壁細(xì)胞生出，呈瓶梗狀，透明。分生孢子無色透明，單胞，有1～2個油球，無隔膜，近圓柱形或橢圓形，壁薄，無附屬物，大小為1.55 μm×3.39 μm～2.82 μm×5.50 μm。

2.3 病原菌致病性測定

由圖3可知，采用菌絲接種盆栽伸根期和旺長期的煙株莖稈7 d后，均出現(xiàn)明顯的病斑。伸根期病斑為淺灰色至淺褐色，粗糙且凹陷，病斑隨后逐漸擴大，回接所產(chǎn)生的癥狀與田間癥狀一致，但短期內(nèi)未在病斑處產(chǎn)生分生孢子器。將 5 mm 菌絲圓片接種于伸根期和旺長期葉片，6 d后均在葉片上形成明顯病斑，病斑黃褐色，近圓形或不規(guī)則形，病斑邊緣有黃色暈圈。病斑處較薄、質(zhì)脆、易破，部分病斑擴大連成片。從接種發(fā)病的莖稈及葉片上再次分離的病原菌與原接種菌株形態(tài)相同，表明接種菌株為致病菌。

2.4 病原菌的分子生物學(xué)鑒定

對煙草莖點病菌株HGUP8001的ITS和LSU序列進行PCR擴增，分別獲得528、856 bp的片段。將測序得到的序列提交至GenBank(登錄號為：ITS，MF192850；LSU，MF192851)。利用Blast進行同源性比較，結(jié)果顯示與HGUP8001的ITS基因序列同源性達(dá)99%的菌株均為莖點霉，進一步比對LSU基因序列，也與多個莖點酶屬菌株同源性為99%，表明HGUP8001菌株屬于莖點霉屬真菌。圖4系統(tǒng)發(fā)育樹顯示，煙草莖點病菌株與廣生莖點酶(P.omnivirensCBS 654.77、P.omnivirensCBS991.95)聚在一起，結(jié)合其形態(tài)學(xué)特征將其鑒定為廣生莖點霉。

3 結(jié)論與討論

本研究于2016年7月在貴州省2地發(fā)現(xiàn)煙草莖點病，分離得到病原菌，采用形態(tài)學(xué)和分子生物學(xué)相結(jié)合的方法將病原菌確定為廣生莖點霉。該病害僅在吉林[5-6，8]、陜西[7]2省有過報道，目前尚未有在貴州省發(fā)生的相關(guān)報道。于莉等曾描述了煙草莖點病的病原為P.tabaci，但該病原菌回接時僅能使煙桿發(fā)病，而葉片不產(chǎn)生任何癥狀[5]。該菌還能引起其他植物產(chǎn)生病害，如龜背竹莖點霉葉斑病[19]，說明廣生莖點霉沒有寄主特異性。除本研究中的廣生莖點霉外，莖點霉屬還有多個種可引起其他作物產(chǎn)生病害，如P.adianticola引起茶樹褐芽病[20]、苜蓿莖點霉(P.medicaginis)引起苜蓿莖點霉葉斑病[21]、莖點霉屬真菌能引起紫莖澤蘭褐斑病[22]、P.herbicola引起核桃莖點霉黑斑病[23]、向日葵莖點霉(P.macdonaldii)引起向日葵黑莖病菌[24]、南方莖點霉菌(P.jolyana)引起香蕉莖點霉鞘腐病[25]等。

前人報道煙草莖點病菌一般不直接侵染葉片， 且易從打頂抹杈和采葉傷口處侵入[26]。在測定病原菌致病性的試驗中，筆者分別對與采集樣本同品種的K326伸根期及旺長期葉片和莖稈進行回接。煙桿刺傷后較易發(fā)病，而煙葉無傷口也易發(fā)病，表明廣生莖點霉不僅能侵染煙草莖稈，也能侵染葉片，可侵染的煙株生長期也更廣范。在進行煙田耕作時建議減少煙株機械損傷，以減少該病菌侵染煙株引發(fā)煙草莖點病。

本研究對煙草莖點病在貴州省2個地區(qū)的發(fā)病情況進行調(diào)查，初步確定該病在貴州省2地確有發(fā)生。對病原菌進行分離，并根據(jù)柯赫氏法則確定分離菌株為致病菌。進一步對病原菌的rDNA-ITS序列及LSU基因進行分析，并建立基于rDNA-ITS序列和LSU基因的系統(tǒng)發(fā)育樹，最終將引起貴州省煙草莖點病的病原鑒定為半知菌亞門球殼孢目莖點霉屬廣生莖點霉，但關(guān)于該病菌是否能引起其他烤煙品種發(fā)病還須繼續(xù)探究。

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