張莉芳，楊正修，張學(xué)文，龍炎杏，趙 燕

（湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)生物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，長(zhǎng)沙 410128）

植物雌蕊發(fā)育相關(guān)基因的表達(dá)及其調(diào)控研究是植物發(fā)育生物學(xué)研究領(lǐng)域的熱點(diǎn)。近年來，通過Ac／Ds、T－DNA插入等方法獲得的擬南芥雌蕊發(fā)育異常突變體不斷增加，為雌蕊發(fā)育過程及其調(diào)控的研究提供了豐富的材料，并取得了一些重要的研究成果［1］。雌蕊的發(fā)育最初是心皮的形成，ABCDE模型中相關(guān)C與E類基因共同作用是心皮發(fā)育必要的條件，而這些基因編碼的產(chǎn)物絕大多數(shù)都存在MADS保守區(qū)域，同時(shí)具有調(diào)控其他基因轉(zhuǎn)錄表達(dá)的能力。Alvarez等［2］發(fā)現(xiàn)，擬南芥心皮發(fā)育主要受SPATULA（SPT），CRABS CLAW（CRC）及AGAMOUS（AG）基因的控制。

在植物花器官發(fā)育的過程中，SPATULA是第一個(gè)被發(fā)現(xiàn)并起重要作用的基因，其編碼一個(gè)bHLH的轉(zhuǎn)錄因子。Alvarez等［2］通過研究發(fā)現(xiàn)，擬南芥spt突變體與野生型比較其心皮變窄變短。Heisler等通過原位雜交技術(shù)證實(shí)SPT在花的分生組織頂部開始表達(dá)，其分生組織隨后發(fā)育成雌蕊原基，SPT的表達(dá)也達(dá)到最高［3］。隨著進(jìn)一步發(fā)育成隔膜、柱頭、花柱和輸送管直至開花前，均可在隔膜、柱頭上檢測(cè)到SPT的表達(dá)，甚至在角果瓣上仍有表達(dá)［4］。Alvarez等［2］在擬南芥中發(fā)現(xiàn)SPT功能的缺少會(huì)導(dǎo)致隔膜及頂端心皮融合缺陷，影響柱頭組織的發(fā)育及傳輸束的喪失，說明SPT在植物整個(gè)雌蕊發(fā)育過程中是必不可少的。

薺菜（Capsella bursa－pastoris）與擬南芥（Arabidopsis thaliana）同為十字花科植物，兩者的生長(zhǎng)習(xí)性與植株形態(tài)具有很大的相似性，但它們?cè)谛钠ば螒B(tài)上存在顯著差異，薺菜為三角形的短角果（silicle），而擬南芥為長(zhǎng)柱形的長(zhǎng)角果（silique）。為研究薺菜雌蕊（心皮）形態(tài)建成的分子特異性，趙燕等從擬南芥、薺菜中克隆了心皮發(fā)育相關(guān)基因CRABS CLAW（CRC）CRC，對(duì)擬南芥和薺菜進(jìn)行了交互轉(zhuǎn)化［5，6］，但薺菜SPT基因的研究尚未見報(bào)道。本試驗(yàn)通過同源克隆法從野生型薺菜花蕾中克隆了薺菜的SPT基因，經(jīng)序列分析，同源比對(duì)，構(gòu)建了表達(dá)載體pWM101－35S：：CbSPT，轉(zhuǎn)化擬南芥，從篩選的轉(zhuǎn)基因擬南芥植株中觀察到了大量的心皮形態(tài)變異，為揭示十字花科植物心皮的形態(tài)建成及與關(guān)鍵基因SPT的關(guān)系提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

擬南芥（Arabidopsis thaliana）為 Columbia生態(tài)型；薺菜（Capsella bursa－posteris）為野生型。載體pMD18T－vector（TAKARA公司），大腸桿菌DH5α菌株，農(nóng)桿菌GV3101，Ti質(zhì)粒pWM101，均由湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)生物科學(xué)技術(shù)學(xué)院細(xì)胞生物學(xué)研究室保存。

1.2 方法

1.2.1 薺菜CbSPT基因的克隆

取薺菜植株主花序上的幼嫩花蕾置4℃低溫處理后，采用TAKARA公司RNA提取試劑盒分離總RNA，以總 RNA為模板，用 RT－PCR試劑盒（TAKARA公司）反轉(zhuǎn)錄成cDNA。根據(jù)GenBank收錄的擬南芥SPATULA（SPT）基因的cDNA序列設(shè)計(jì)引物：F：5＇－TGTAATGATATCACAGAGAGAAGA－3＇；R：5＇－TCAAGTAATTCGATCTTTTAGGTC－3＇（引物由華大基因合成）。PCR反應(yīng)程序?yàn)椋?5℃預(yù)變性5 min，94℃變性 30 s，55℃退火 30 s，72℃延伸 1.5 min，26個(gè)循環(huán)后72℃終延伸7 min。1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)擴(kuò)增片段大小，將回收的擴(kuò)增片段克隆到pMD18－T載體，獲得pMD18－CbSPT，并轉(zhuǎn)化大腸桿菌 DH5α，在含有 IPTG，X－gal的 LB／Amp平板上篩選白色菌落，對(duì)重組子進(jìn)行菌落PCR及酶切鑒定，序列送華大基因測(cè)序。

1.2.2 薺菜CbSPT基因的序列分析

序列比對(duì)在ClustalX軟件上進(jìn)行，ORF查找及其ORF翻譯，GenBank BLAST和核酸序列的CDD搜索在NCBI網(wǎng)站上進(jìn)行，并將獲得的基因命名為薺菜心皮發(fā)育相關(guān)的轉(zhuǎn)錄因子CbSPT（GenBank：KY210219.1）。氨基酸的比對(duì)，系統(tǒng)發(fā)育樹的構(gòu)建，親疏水性的檢測(cè)等在DNAMAN軟件上進(jìn)行。

1.2.3 植物表達(dá)載體pWM101－35S：：CbSPT的構(gòu)建及工程農(nóng)桿菌制備

利用植物表達(dá)載體pWM101所帶有的CaMV35S啟動(dòng)子及啟動(dòng)子下游的BamHI和SalI等多克隆位點(diǎn)，采用BamHI和SalI雙酶切質(zhì)粒pMD18－CbSPT和植物表達(dá)載體pWM101。試劑盒分別回收、純化獲得CbSPT的cDNA及其載體片段，將兩片段連接后轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α，在含Kan的LB培養(yǎng)基中篩選轉(zhuǎn)化菌落，通過菌落PCR及酶切檢測(cè)，證實(shí)構(gòu)建的重組質(zhì)粒pWM101－35S：：CbSPT的正確性，并通過電擊轉(zhuǎn)化法1800 V 5 ms電擊轉(zhuǎn)化根癌農(nóng)桿菌GV3101，制備工程農(nóng)桿菌。

1.2.4 擬南芥遺傳轉(zhuǎn)化及抗性植株的篩選鑒定

采用擬南芥浸花序法轉(zhuǎn)化哥倫比亞生態(tài)型擬南芥，選用盛花前期的植株為浸染材料，將整枝后的擬南芥花序浸入制備的浸染液（50 mL過夜培養(yǎng)的工程農(nóng)桿菌OD600為1.0左右，懸浮在100 mL含5 g蔗糖，20μL Silwet－77的MS中）浸染50～60 s，薄膜覆蓋，暗培養(yǎng)24 h，保持水分充足，開花期共侵染2～3次。待種子成熟后收種，并讓其充分干燥，4℃春化處理一周，經(jīng)1%升汞消毒8 min，無菌水充分沖洗后，接種到篩選培養(yǎng)基（1／2MS＋10%蔗糖＋0.8%瓊脂＋30 mg／L潮霉素）上進(jìn)行發(fā)芽篩選，每瓶培養(yǎng)基中鋪加約1000粒種子。對(duì)經(jīng)潮霉素篩選獲得的抗性擬南芥進(jìn)行插入基因片段（CbSPT）下游序列和載體上的35S啟動(dòng)子上游序列PCR聯(lián)合檢測(cè)，分離單株擬南芥基因組DNA，上下游檢測(cè)引物分別為 p35S：5＇－CTCCACTGACGTAAGGGATGAC－3＇，pR：5＇－TCAAGTAATTCGATCTTTTAGGTC－3＇，PCR反應(yīng)條件為95℃預(yù)變性5 min，94℃變性 1 min，55℃退火 1 min，72℃延伸 90 s，30個(gè)循環(huán)后，72℃保溫延伸7 min。轉(zhuǎn)基因陽性植株P(guān)CR產(chǎn)物大小約為1200 bp。

1.2.5 轉(zhuǎn)基因擬南芥的心皮形態(tài)顯微觀察

在體視顯微鏡（OLYMPUS SZX10）下觀察轉(zhuǎn)基因擬南芥心皮形態(tài)，并進(jìn)行分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 薺菜CbSPT基因的克隆及序列分析

采用TAKARA公司試劑盒提取薺菜花蕾RNA，以設(shè)計(jì)的F，R為引物從RNA反轉(zhuǎn)錄后獲得的cDNA上PCR擴(kuò)增SPT基因，電泳檢測(cè)顯示（圖1），條帶特異性高，與預(yù)期大小相符。

將測(cè)序結(jié)果經(jīng)NCBI在線BLAST分析，發(fā)現(xiàn)其與擬南芥AtSPT轉(zhuǎn)錄因子基因覆蓋率達(dá)95%，相似性達(dá)87%。通過NCBI的ORF finder進(jìn)行開放閱讀框分析并翻譯，該基因序列全長(zhǎng)1047 bp，共編碼348個(gè)氨基酸（圖2），與擬南芥AtSPT基因的核酸序列和氨基酸序列的同源性分別達(dá)到98%和93%左右，說明同源克隆所獲得的薺菜CbSPT序列是正確的。

圖1 薺菜CbSPT基因PCR擴(kuò)增電泳檢測(cè)結(jié)果Fig.1 PCR amplification of CbSPT gene from Capsella bursa-pastoris

圖2 薺菜CbSPT序列測(cè)序結(jié)果及對(duì)應(yīng)的氨基酸序列CbSPT共1047 bp，編碼348個(gè)氨基酸。Fig.2 Sequence results and corresponding amino acid sequences of CbSPT sequence from Capsella bursa-pastoris

利用ProtScale軟件進(jìn)行親疏水性預(yù)測(cè)，發(fā)現(xiàn)在第113位具有最高分值1.325，122位達(dá)1.218，這2個(gè)位點(diǎn)疏水性較強(qiáng)，在第10位具有最低分－3.812，其親水性最強(qiáng)，而在第140，210位都具有較低分－2.765，－2.963。整條多肽鏈表現(xiàn)為親水性，無明顯疏水區(qū)域，故推測(cè)該蛋白為一種親水蛋白。

2.2 薺菜CbSPT基因氨基酸同源性分析

以擬南芥（Arabidopsis thaliana丨AEE86720丨），亞麻薺（Camelina sativa丨 XP＿010437251丨），歐洲油菜（Brassica napus丨 XP＿013723019丨），甘藍(lán)（Brassica oleraceavar.capitata丨 AHK05707丨），蕪菁（Brassica rapa丨 XP＿009109363丨），梅（Prunus mume丨 XP＿008241481丨），醉碟花（Tarenaya hassleriana丨XP＿010531245丨）氨基酸殘基序列與薺菜CbSPT基因氨基酸序列進(jìn)行氨基酸同源性分析，結(jié)果如圖3所示。薺菜CbSPT氨基酸序列與近源物種擬南芥、亞麻薺、歐洲油菜、甘藍(lán)、蕪菁、梅、醉蝶花相似性分別為 98%，89%，83%，83%，79%，73%，68%。

圖3 薺菜SPT與其他物種SPT的氨基酸序列比對(duì)Fig.3 Comparison of am ino acid sequences of CbSPT and SPT with other species

通過MEGA 6.0軟件選取以上物種的SPT氨基酸序列構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，發(fā)育樹顯示薺菜與擬南芥在同一分支，其余6種為同一分支（圖4）。從氨基酸同源性對(duì)比結(jié)果來看，薺菜CbSPT與擬南芥同源性最高，為98%。亞麻薺、歐洲油菜、甘藍(lán)、蕪菁、梅、醉蝶花雖與薺菜、擬南芥不在一個(gè)分支，但薺菜CbSPT與亞麻薺、歐洲油菜、甘藍(lán)同源性皆在80%以上。因此，該基因在不同的物種間具有很強(qiáng)的保守性，他們對(duì)應(yīng)的蛋白應(yīng)屬同一家族。

圖4 7個(gè)物種基于SPT氨基酸序列的系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.4 Phylogenetic tree of seven species based on SPT amino acid sequences

2.3 植物表達(dá)載體的構(gòu)建及擬南芥遺傳轉(zhuǎn)化

以Ti質(zhì)粒pWM101為基礎(chǔ)，將CbSPT基因的cDNA片段插入到多克隆位點(diǎn)，構(gòu)建一個(gè)含潮霉素抗性選擇標(biāo)記和CaMV35S啟動(dòng)子調(diào)控的薺菜CbSPT基因 cDNA植物表達(dá)載體 pWM101－35S：：CbSPT，對(duì)重組分子進(jìn)行酶切檢測(cè)，確定構(gòu)建重組分子結(jié)構(gòu)的正確性（圖6A、B）。

采用浸花序法轉(zhuǎn)化哥倫比亞生態(tài)型擬南芥，將收獲的T0代種子在篩選培養(yǎng)基上經(jīng)40 mg／mL潮霉素篩選，7 d后，陰性苗葉片萎蔫，無根，而后慢慢黃化，白化至死亡。而陽性苗則和野生型植株一樣正常生長(zhǎng)（圖5）。當(dāng)抗性苗蓮座葉長(zhǎng)出后，移栽至營(yíng)養(yǎng)缽中，待植株生長(zhǎng)10 d左右，取單株葉片采用CTAB法提取基因組DNA，用P35S、PR引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，凝膠電泳結(jié)果顯示（圖6C），隨機(jī)挑選的10株轉(zhuǎn)化擬南芥植株中有7株均在在1200 bp處擴(kuò)增出目的基因條帶（11號(hào)孔為陽性對(duì)照，12號(hào)孔為野生型擬南芥陰性對(duì)照，第1、4、7號(hào)孔為假陽性植株）。

圖5 潮霉素平板篩選CbSPT抗性植株（Bars=10 mm）Fig.5 CbSPT-resistant plants were screened by Hygromycin plates（Bars=10 mm）

圖6 薺菜CbSPT植物表達(dá)載體的構(gòu)建Fig.6 Construction of CbSPT plant expression vector of Capsella bursa-pastoris

2.4 轉(zhuǎn)基因擬南芥心皮形態(tài)的觀察與分析

對(duì)分子檢測(cè)后的轉(zhuǎn)基因植株成熟角果進(jìn)行形態(tài)學(xué)觀察（圖7），發(fā)現(xiàn)其角果形態(tài)較野生型有明顯變化。隨機(jī)統(tǒng)計(jì)100個(gè)角果，其變異率達(dá)78%，其典型的變異趨勢(shì)為徑相變窄、軸向變短；局部彎曲；整個(gè)心皮形態(tài)相對(duì)于正常擬南芥心皮變小，軸向變短了。但是，薺菜CbSPT在擬南芥中的過表達(dá)并沒有從根本上改變其角果的形態(tài)。這可能具有兩方面的原因：一是擬南芥內(nèi)源的SPT基因與薺菜SPT基因相重疊，導(dǎo)致轉(zhuǎn)基因擬南芥植株心皮形態(tài)的復(fù)雜性；二是心皮的形態(tài)發(fā)育不是由SPT基因單基因決定，而可能與決定雌蕊發(fā)育的C類基因交互作用有關(guān)。

圖7 CbSPT轉(zhuǎn)基因植株角果觀察Fig.7 The silique shape of CbSPT transgenic plants

3 討論

十字花科心皮發(fā)育基因有特別高的保守率［7］，本試驗(yàn)對(duì)7個(gè)物種的SPT氨基酸序列分析及系統(tǒng)發(fā)育樹分析與此相符。Groszmann等［8］在擬南芥的心皮和果實(shí)發(fā)育研究中表明，SPT除了bHLH區(qū)域外包括另兩個(gè)保守結(jié)構(gòu)域：一個(gè)兩性螺旋和一個(gè)酸性區(qū)域。其中酸性域?qū)τ赟PT心皮功能是必不可少的，并且兩性螺旋也支持它的心皮功能。當(dāng)缺失SPT功能時(shí)會(huì)導(dǎo)致隔膜和心皮的內(nèi)部傳輸遭到嚴(yán)重破壞，以及兩個(gè)心皮在頂端區(qū)域無法融合。在Girin等［9］的研究中，SPT是擬南芥受精前雌蕊中心皮邊緣再生組織發(fā)育所必須的，與另外一種在擬南芥果實(shí)成熟時(shí)所必須的bHLH轉(zhuǎn)錄因子IND相互作用并通過蛋白質(zhì)－蛋白質(zhì)接觸介導(dǎo)雌蕊發(fā)育和果夾的開裂，IND直接正向調(diào)節(jié)SPT的表達(dá)。本試驗(yàn)通過對(duì)薺菜CbSPT的序列分析，發(fā)現(xiàn)其與擬南芥SPT序列相似度極高，并編碼bHLH蛋白，通過親疏水性軟件預(yù)測(cè)也與擬南芥SPT具有兩性螺旋相符。但通過轉(zhuǎn)化植株的心皮表型觀察分析，薺菜CbSPT在擬南芥心皮中過表達(dá)后形態(tài)較野生型有較大的差異，心皮明顯變小、果莢軸向變短，部分典型變異果莢徑向變窄部分彎曲，這與趙燕等研究的CbCRC基因?qū)π钠ぐl(fā)育的影響作用相似，在Girin等的研究中也證實(shí)了35：：AtSPT轉(zhuǎn)基因植株中心皮和果實(shí)會(huì)有缺陷，在一定程度上也說明薺菜CbSPT與擬南芥At-SPT基因在功能上有部分相似之處。

Groszmann等［10］研究了SPATULA和ALCATRAZ部分冗余對(duì)于擬南芥的雌蕊和果實(shí)發(fā)育的影響，表明SPT支持隔膜和柱頭的發(fā)育，而ALC參與裂果的發(fā)育和早期雌蕊的發(fā)育；spt－alc雙突變體會(huì)表現(xiàn)出早期雌蕊群的嚴(yán)重破壞和后期瓣膜邊緣缺陷。Nahar等［11］研究了SPT控制擬南芥心皮邊緣發(fā)育的機(jī)制，表明SPT促進(jìn)心皮融合成雌蕊是通過CUPSHAPED COTYLEDON1（CUC1）和CUC2的負(fù)調(diào)控表達(dá)。Pires等［12］也在相關(guān)研究中表明，SPT通過負(fù)調(diào)控CUC1和CUC2表達(dá)來指導(dǎo)心皮融合，并且SPT與CUC1、CUC2三種基因共同促進(jìn)基底區(qū)域中邊緣衍生結(jié)構(gòu)的形成。本研究中薺菜CbSPT在擬南芥心皮中過表達(dá)后沒有引起心皮融合和柱頭發(fā)育異常，說明AtSPT和CbSPT在調(diào)控心皮融合中功能相似。Schuster等［13］在 2015年的研究中發(fā)現(xiàn)，bHLH轉(zhuǎn)錄因子HEC1、HEC2、HEC3，在生殖器官發(fā)育中影響生長(zhǎng)素和細(xì)胞分裂素的反應(yīng)，HEC1與SPT相互作用來控制心皮的融合，它們都限制細(xì)胞分裂素在雌蕊中的作用。2017年，Reyes－Olalde等［14，15］研究了SPT使細(xì)胞分裂素傳導(dǎo)，并在雌蕊的內(nèi)側(cè)區(qū)域激活與生長(zhǎng)素有關(guān)的生物合成和轉(zhuǎn)運(yùn)基因。研究表明，SPT是雌蕊在內(nèi)側(cè)域的細(xì)胞分裂素信號(hào)輸出所必需的，細(xì)胞分裂素誘導(dǎo)的增值需要SPT和B型ARR，SPT調(diào)節(jié)B型ARR表達(dá)，細(xì)胞分裂素信號(hào)傳導(dǎo)依賴SPT激活生長(zhǎng)素生物合成基因，生長(zhǎng)素轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白PIN3由細(xì)胞分裂素和SPT協(xié)同激活。在本研究中CbSPT在擬南芥心皮中過表達(dá)最典型的變異是引起了擬南芥長(zhǎng)角果的變短，這或許是CbSPT在調(diào)控上述細(xì)胞分裂素和生長(zhǎng)素信號(hào)傳導(dǎo)過程中與At-SPT的調(diào)控模式存在差異。

植物的心皮形態(tài)發(fā)育不僅僅是由單基因調(diào)控，可能是多個(gè)基因形成復(fù)雜的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，上下協(xié)同作用，或是多基因的重疊作用導(dǎo)致心皮形態(tài)的差異，也正是由于花器官發(fā)育調(diào)控機(jī)理的復(fù)雜性，亦或是同源基因之間表達(dá)模式的差異造成了心皮形態(tài)的差異。隨著人們對(duì)花器官發(fā)育的分子機(jī)制以及系統(tǒng)發(fā)育研究的進(jìn)一步深入，對(duì)花器官形態(tài)建成的機(jī)理將會(huì)有更加清楚的了解。

［1］ Honma T，Goto K.Complexes of MADS－box proteins are sufficient to convert leaves into floral organs［J］.Nature，2001，409：525－529.

［2］ Alvarez J，Smyth D.CRABSCLAWandSPATULA，twoArabidopsisgenes that control carpel development in parallel with AGAMOUS［J］.Development，1999，126（11）：2377－2386.

［3］ Heisler M，Atkinson A，Bylstra Y，et al.SPATULA，a gene that controls development of carpel margin tissues inArabidopsis，encodes a bHLH protein［J］.Development，2001，128（7）：1089－1098.

［4］ Makkena S，Lamb R.The bHLH transcription factorSPATULAregulates root growth by controlling the size of the root meristem［J］.BMC Plant Biol，2013，13：1.

［5］ 趙 燕，張學(xué)文，蔣 向.擬南芥心皮發(fā)育CRABS CLAW基因的克隆與薺菜遺傳轉(zhuǎn)化［J］.湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)（自然科學(xué)版），2007，33（1）：14－17.

［6］ 趙 燕，黃麗華，蔣 向，等.薺菜CRABSCLAW的克隆與擬南芥遺傳轉(zhuǎn)化［J］.西北植物學(xué)報(bào)，2009，29（11）：2162－2167.

［7］ Pfannebecker K，Lange M，Rupp O，et al.Seed plant specific gene lineages involved in carpel development［J］.Mol Biol Evol，2017，34（4）：925－942.

［8］ Groszmann M，Paicu T，Smyth DR.Functional domains ofSPATULA，a bHLH transcription factor involved in carpel and fruit development inArabidopsis［J］.Plant J，2008，55（1）：40－52.

［9］ Girin T，Paicu T，Stephenson P，et al.INDEHISCENTandSPATULAinteract to specify carpel and valve margin tissue and thus promote seed dispersal inArabidopsis［J］.Plant Cell，2011，23（10）：3641－3653.

［10］ Groszmann M，Paicu T，Alvarez J，et al.SPATULAandALCATRAZ，are partially redundant，functionally diverging bHLH genes required forArabidopsisgynoecium and fruit development［J］.Plant J，2011，68（5）：816－829.

［11］ Nahar M，Ishida T，Smyth D，et al.Interactions ofCUPSHAPED COTYLEDONandSPATULAgenes control carpel margin development inArabidopsis thaliana［J］.Plant Cell Physiol，2012，53（6）：1134－1143.

［12］ Pires HR，Monfared MM，Shemyakina EA，et al.ULTRAPETALA trxGgenes interactwithKANADItranscription factor genes to regulateArabidopsisgynoecium patterning［J］.Plant Cell，2014，26（11）：4345－4361.

［13］ Schuster C，Gaillochet C，Lohmann JU.Arabidopsis HECATEgenes function in phytohormone control during gynoecium development［J］.Development，2015，142（19）：3343－3350.

［14］ Reyes－Olalde JI，Zuniga－Mayo VM，Serwatowska J，et al.The bHLH transcription factorSPATULAenables cytokinin signaling，and both activate auxin biosynthesis and transport genes at the medial domain of the gynoecium［J］.PLoSGenet，2017，13（4）：e1006726.

［15］ Reyes－Olalde JI，Zuniga－Mayo VM，Marsch－Martinez N，et al.Synergistic relationship between auxin and cytokinin in the ovary and the participation of the transcription factorSPATULA［J］.Plant Signal Behav，2017，12（10）：e1376158.