茍路正,曲春浦，劉關(guān)君，楊成君

(東北林業(yè)大學(xué)林學(xué)院，黑龍江 哈爾濱 150040)

84k楊是韓國(guó)成功培育的銀白楊和腺毛楊(Populusalba×P.glandulosa)雜種無(wú)性系[1]。其具有易生根、材質(zhì)好、抗病蟲(chóng)性強(qiáng)、適應(yīng)性廣等特點(diǎn)，對(duì)加速“三北”防護(hù)林建設(shè)、平原和城市綠化、綠色屏障的鑄造、西部大開(kāi)發(fā)和生態(tài)環(huán)境的改善等將發(fā)揮重大作用[2]。同時(shí)84k楊由于生長(zhǎng)快、易出芽、繁殖迅速等特點(diǎn)逐漸成為楊樹(shù)基因工程的重要受體樹(shù)種[3]。目前關(guān)于84k楊組培技術(shù)的研究已有報(bào)道[4-6]。但現(xiàn)有的利用葉片作為外植體的組培體系中往往忽略壯苗培育這一過(guò)程，這會(huì)導(dǎo)致葉片不定芽參差不齊，生根培養(yǎng)后植株均一性差，生長(zhǎng)速度慢，培養(yǎng)周期長(zhǎng)等問(wèn)題。本研究以成熟84k楊葉片為外植體進(jìn)行不定芽的誘導(dǎo)，經(jīng)壯苗培養(yǎng)使不定芽迅速生長(zhǎng)，達(dá)到苗齊苗壯的目的，再經(jīng)生根培養(yǎng)獲得再生植株，成功地解決不定芽參差不齊、利用率低、植株均一性差等問(wèn)題，為84k楊的開(kāi)發(fā)利用提供了技術(shù)支持。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

選取生長(zhǎng)健康的當(dāng)年生84k楊成熟葉片為外植體，試驗(yàn)材料來(lái)源于東北林業(yè)大學(xué)林木遺傳育種國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室人工栽培的84k楊植株。

1.2 試驗(yàn)方法

剪取84k楊健康的幼嫩葉片，用洗衣粉液浸泡30min，自來(lái)水沖洗1h。在超凈工作臺(tái)上，用75%的酒精浸泡消毒20s，無(wú)菌水沖洗2次，再用0.5%次氯酸鈉液浸泡消毒8min，無(wú)菌水清洗5次，獲得無(wú)菌外植體材料。

培養(yǎng)基 以MS為基本培養(yǎng)基，根據(jù)試驗(yàn)?zāi)康奶砑硬煌瑵舛鹊?-BA(6-芐基腺嘌呤)、NAA(萘乙酸)和IBA(吲哚丁酸)，添加蔗糖20g/L，瓊脂5.5g/L。調(diào)培養(yǎng)基pH均為5.8，121℃高壓蒸汽滅菌25min，分裝。

培養(yǎng)條件 培養(yǎng)溫度25±2℃，光照強(qiáng)度2000-3 000Lx，光照時(shí)間16h/d。

葉片不定芽誘導(dǎo) 將消毒的葉片切成1cm2左右大小，葉面朝上，分別接種于含不同濃度6-BA(0.4mg/L、0.8mg/L、1.2mg/L)+NAA(0.05mg/L、0.10mg/L、0.15mg/L)的培養(yǎng)基上(表1)，每個(gè)培養(yǎng)皿接種6片小葉段，每組處理重復(fù)3次(3個(gè)培養(yǎng)皿)。光照培養(yǎng)，定期觀察記錄不定芽誘導(dǎo)情況。

壯苗培養(yǎng) 將生長(zhǎng)至1cm左右的不定芽塊分別接種于含不同濃度6-BA(0.05mg/L、0.10 mg/L)+IBA(0.2mg/L、0.6mg/L、1.0mg/L)的壯苗培養(yǎng)基上(表2)，每個(gè)培養(yǎng)瓶接種大小相同的3簇不定芽。

生根培養(yǎng) 將無(wú)根苗距頂部3cm處截?cái)啵謩e接種于含不同濃度IBA(0.6mg/L、0.8mg/L、1.0mg/L)和NAA(0.2mg/L、0.4mg/L)的生根培養(yǎng)基中，每瓶接種1棵無(wú)根幼苗，每組重復(fù)20次(表3)。

生根苗移栽 生根培養(yǎng)30d左右，選擇根系發(fā)育良好，株高8-10cm，根系長(zhǎng)度≧6cm的84k楊無(wú)菌苗，把根部沾附的培養(yǎng)基輕輕捏碎，在水中清洗干凈，在此過(guò)程中避免傷及根部或造成根部斷裂、脫落。移栽基質(zhì)以純的草炭土為宜，移栽前自然吸水至土壤濕潤(rùn)，苗木栽好后及時(shí)扣上培養(yǎng)瓶(工廠育苗時(shí)可以覆膜)，培養(yǎng)3d后將組培瓶?jī)A斜，開(kāi)一小口，使苗逐步適應(yīng)外部環(huán)境，培養(yǎng)7d后將瓶子摘掉，每天噴水3-5次保濕。

1.3 統(tǒng)計(jì)及分析

在不定芽誘導(dǎo)期間，記錄觀察苗木的生長(zhǎng)狀況，20d后計(jì)算不定芽誘導(dǎo)率、平均芽數(shù)、玻璃化程度(見(jiàn)表1)。不定芽誘導(dǎo)率=出芽的葉片數(shù)/接種總?cè)~片數(shù)×100%，玻璃化程度=玻璃化的不定芽/誘導(dǎo)出的不定芽總數(shù)×100%；在不定芽壯苗培養(yǎng)期間，觀察不定芽的生長(zhǎng)速度、高度(分別在培養(yǎng)的第10d、20d記錄)以及生長(zhǎng)狀態(tài)(見(jiàn)表2)；在生根培養(yǎng)期間，觀察記錄植株生長(zhǎng)情況，21d后計(jì)算生根率和平均根數(shù)(見(jiàn)表3)，生根率=生根苗總數(shù)/接種的芽苗總數(shù)×100%，平均根數(shù)=根的總條數(shù)/處理苗數(shù)。以上數(shù)據(jù)均采用Microsoft Excel軟件進(jìn)行處理分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 葉片不定芽誘導(dǎo)

將消毒后的外植體接種到葉片分化培養(yǎng)基上(圖1-A)，培養(yǎng)7d左右，外植體切口處逐漸膨大卷曲呈瘤狀，2周左右顏色由淺變深，逐漸變成深綠色并出現(xiàn)綠色不定芽點(diǎn)(圖1-B)，3-4周，不定芽生長(zhǎng)旺盛逐漸形成簇狀不定芽(圖1-C)。

A.葉片外植體接種B.培養(yǎng)14d的不定芽C.培養(yǎng)21d的不定芽

圖1葉片不定芽的誘導(dǎo)

Fig.1 Induction of adventitious buds in leaves

表1為培養(yǎng)20d的統(tǒng)計(jì)結(jié)果。可以看出不同植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑對(duì)84k楊葉片不定芽的誘導(dǎo)影響較大。在細(xì)胞分裂素6-BA濃度一定的情況下，隨著NAA濃度的升高，不定芽的誘導(dǎo)率和不定芽數(shù)相應(yīng)增高；在NAA濃度固定的情況下，隨著6-BA濃度的增高，不定芽的誘導(dǎo)率和不定芽數(shù)也相應(yīng)提高。綜合結(jié)果，培養(yǎng)基MS+6-BA 0.8mg/L+NAA 0.1mg/L不定芽的誘導(dǎo)率達(dá)100%，平均不定芽數(shù)為15.06，不定芽生長(zhǎng)速度快，生長(zhǎng)健壯，無(wú)玻璃化，為本試驗(yàn)葉片不定芽誘導(dǎo)最佳培養(yǎng)基。

表1 生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑對(duì)葉片不定芽誘導(dǎo)的影響

2.2 壯苗培養(yǎng)

將誘導(dǎo)出的不定芽接種到壯苗培養(yǎng)基上，培養(yǎng)7d左右不定芽開(kāi)始增高，10d左右芽高可達(dá)2-4cm(圖2-A)，20d左右芽高可達(dá)6-8cm(圖2-B)。表2為培養(yǎng)20d的統(tǒng)計(jì)結(jié)果。MS+IBA 0.6mg/L+6-BA 0.1mg/L對(duì)不定芽的壯苗效果最好，抽莖速度快，不定芽生長(zhǎng)健壯，莖粗壯，葉鮮綠色，無(wú)黃化現(xiàn)象。添加IBA 0.2mg/L+6-BA 0.05mg/L的培養(yǎng)基不定芽高度無(wú)變化，葉片黃化嚴(yán)重；添加IBA 0.2mg/L+6-BA 0.1mg/L、IBA 1.0mg/L+6-BA 0.05mg/L和IBA 1.0mg/L+6-BA 0.1mg/L的培養(yǎng)基不定芽生長(zhǎng)速度較慢，高度達(dá)到6cm后不再增加；添加IBA 0.6mg/L+6-BA 0.05mg/L的培養(yǎng)基不定芽長(zhǎng)勢(shì)均一，生長(zhǎng)速度快，莖粗壯，但少數(shù)出現(xiàn)葉片黃化現(xiàn)象。綜合結(jié)果，培養(yǎng)基MS+IBA 0.6mg/L+6-BA 0.1mg/L為本試驗(yàn)最佳壯苗培養(yǎng)基。

A.壯苗培養(yǎng)10dB.壯苗培養(yǎng)20d

圖2 壯苗培養(yǎng)

2.3 84k楊生根培養(yǎng)

將無(wú)根苗距頂部3cm處截?cái)?，接種在生根培養(yǎng)基上培養(yǎng)，1周左右根部生長(zhǎng)點(diǎn)突出，開(kāi)始誘導(dǎo)生根(圖3-A)，21d后根系生長(zhǎng)良好(圖3-B)，統(tǒng)計(jì)生根試驗(yàn)結(jié)果(表3)。培養(yǎng)基MS+IBA 0.6 mg/L+NAA 0.4mg/L與其他培養(yǎng)基相比差異顯著，表現(xiàn)為生根速度快，側(cè)根數(shù)量多，根系健壯，植株生長(zhǎng)旺盛，株高可達(dá)10cm以上。添加IBA 1.0mg/L+NAA 0.2mg/L和添加IBA 0.8mg/L+NAA 0.2mg/L的培養(yǎng)基生根緩慢，側(cè)根少或幾乎無(wú)側(cè)根，個(gè)別不生根，植株生長(zhǎng)慢。MS+IBA 0.8mg/L+NAA 0.4mg/L培養(yǎng)基和MS+IBA 1.0mg/L+NAA 0.4mg/L生根較快，但側(cè)根數(shù)量少，根系較短。IBA 0.6mg/L+NAA 0.2mg/L的培養(yǎng)基生根快，側(cè)根數(shù)量多，但根系細(xì)長(zhǎng)偶爾出現(xiàn)葉片發(fā)黃現(xiàn)象。綜合根的數(shù)目、長(zhǎng)度及苗的生長(zhǎng)狀況，篩選出MS+IBA 0.6mg/L+NAA 0.4mg/L為84k楊最佳生根的培養(yǎng)基。

2.4 生根苗移栽

多次試驗(yàn)證明，以純草炭土為基質(zhì)，扣瓶(或覆膜)培養(yǎng)的移栽方式非常適合84k楊組培苗的生長(zhǎng)，成活率高達(dá)97%。

A.生根培養(yǎng)7dB.生根培養(yǎng)21d

圖3 生根培養(yǎng)

3 結(jié)論與討論

目前已知的84k楊葉片組培體系一般經(jīng)過(guò)愈傷組織誘導(dǎo)-不定芽誘導(dǎo)-壯苗(有或無(wú))-生根培養(yǎng)等4個(gè)過(guò)程[7-9]，本次試驗(yàn)經(jīng)過(guò)葉片不定芽誘導(dǎo)-壯苗-生根3個(gè)培養(yǎng)過(guò)程獲得再生植株。

本試驗(yàn)中84k楊最佳葉片不定芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基為MS+6-BA 0.8mg/L + NAA 0.1mg/L，在此培養(yǎng)基中葉片易被誘導(dǎo)，1周左右葉片邊緣開(kāi)始卷曲膨大，兩周左右出現(xiàn)綠色不定芽點(diǎn)，3-4周不定芽生長(zhǎng)旺盛逐漸形成簇狀叢生芽。從試驗(yàn)結(jié)果看，較高濃度的6-BA和NAA有利于不定芽的誘導(dǎo)和生長(zhǎng)，這與張靜等研究的結(jié)論[5]一致。不定芽的玻璃化程度與細(xì)胞分裂素的濃度密切相關(guān)[10-11]，高濃度的6-BA會(huì)導(dǎo)致不定芽玻璃化現(xiàn)象嚴(yán)重，這與孫曉紅等[12]的研究結(jié)論一致。

現(xiàn)有的利用葉片作為外植體的組培體系中往往忽略壯苗這一過(guò)程。葉片誘導(dǎo)的不定芽長(zhǎng)勢(shì)不均且真正可以用來(lái)生根的不定芽數(shù)量較少，但經(jīng)壯苗培養(yǎng)后不僅能夠改善不定芽的生長(zhǎng)狀況而且可以起到第二次增殖的效果，之前較小的不定芽會(huì)迅速生長(zhǎng)達(dá)到生根培養(yǎng)的要求，再經(jīng)過(guò)統(tǒng)一截頂生根可以極大地提高生根苗均一性。本試驗(yàn)中84k楊最佳壯苗培養(yǎng)基為MS+IBA 0.6mg/L+6-BA 0.1mg/L，在此培養(yǎng)基中叢生芽生長(zhǎng)速度快，生長(zhǎng)健壯，長(zhǎng)勢(shì)均勻，莖粗壯，葉色鮮綠，而劉廣卿等[13]研究的結(jié)論表明WPM+6-BA 1.0mg/L+NAA 1.5mg/L+IBN 1.00mg/L+ZT0.05mg/L的壯苗效果較好。與6-BA相比IBA對(duì)于叢生芽壯苗的影響要更大一些，這可能與生長(zhǎng)素與細(xì)胞分裂素的作用不同有關(guān)[14-15]，壯苗過(guò)程主要是不定芽高度和粗細(xì)的增加，在這一過(guò)程中以營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)為主，頂端優(yōu)勢(shì)明顯，生長(zhǎng)素起主要作用[16-17]。

84k楊在MS+IBA 0.6mg/L+NAA 0.4mg/L的培養(yǎng)基上生根率為100%，生根速度快，側(cè)根數(shù)量多，根系健壯，植株生長(zhǎng)旺盛，為本試驗(yàn)最佳生根培養(yǎng)基，而李科友等、楊琳娜[18-19]研究的結(jié)論表明1/2MS+NAA 0.02mg/L和1/2MS+NAA 0.05mg/L+IBA 0.05mg/L的生根效果較好，與本次結(jié)果的差異主要體現(xiàn)在較低生長(zhǎng)素的濃度上。在移栽過(guò)程中，如果組培苗不經(jīng)處理直接移栽，葉片很快失水萎蔫，成活率很低，扣瓶(或覆膜)是為了讓苗木逐步適應(yīng)外部環(huán)境，提高苗木成活率[20]。

綜上，本研究以84k楊葉片為外植體，經(jīng)不定芽誘導(dǎo)，壯苗和生根培養(yǎng)形成完整植株，移栽至土壤后得到生長(zhǎng)整齊，表型一致的健壯苗木，為84k楊的開(kāi)發(fā)利用提供技術(shù)支持。

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