華梅,陳劍,畢瑋,孔繼君,呼延麗,李云琴,楊宇明,王娟

(1.云南省林業(yè)科學(xué)院,云南 昆明 650201;2.云南省森林植物培育與開發(fā)利用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室/國(guó)家林業(yè)局云南珍稀瀕特森林植物保護(hù)和繁育實(shí)驗(yàn)室,云南 昆明 650201;3.西南林業(yè)大學(xué),云南 昆明 650224)

叢生竹稈形高大，單稈出材率最高，竹叢稈數(shù)多，單位面積產(chǎn)量遠(yuǎn)高于散生竹林，是優(yōu)良特性最突出、最具推廣和開發(fā)利用潛力的竹種[1-3]。叢生竹類資源生長(zhǎng)快、生物量大，在我國(guó)林業(yè)資源中所占的地位日益重要[4]。竹子目前主要用來發(fā)展竹建筑、竹造紙、竹食品及竹工藝品產(chǎn)業(yè)，絕大部分竹葉未能得到充分利用，造成竹葉資源的浪費(fèi)[1]。竹葉具有較好的醫(yī)療保健作用，苦竹〔Pleioblastusamarus(Keng)keng〕葉具有明目利九竅、治不睡、止消渴、解酒毒等作用，淡竹(Phyllostachysnigravar.henon)葉具有鎮(zhèn)靜、解熱、止咳和止血的功效[5-6]。竹葉中具有豐富的次生代謝產(chǎn)物，近年研究表明，竹葉提取物具有優(yōu)良的抗自由基、抗氧化、抗衰老、抗菌、殺蟲、調(diào)節(jié)血脂等生物活性[7-10]。目前對(duì)竹葉化學(xué)成分的研究主要集中在散生竹[11-13]，對(duì)叢生竹研究的相對(duì)較少，李水芳等[14]以蘆丁為標(biāo)準(zhǔn)品對(duì)箬竹〔Indocalamustessellatus(Munro)Keng f.〕葉中的總黃酮含量進(jìn)行了紫外分光光度計(jì)測(cè)定。因叢生竹資源化學(xué)成分的研究和開發(fā)利用的需要，對(duì)更多種類的叢生竹竹葉中化學(xué)成分的分析變得迫切。本研究以勃氏甜龍竹〔Dendrocalamusbrandisii(Munro)Kurz〕、箬竹、浦竹仔(IndosasahispidaMcClure)、椅子竹(DendrocalamusbambusoidesHsueh et D.Z.Li)4種叢生竹為研究對(duì)象，采用高效液相色譜法(HPLC)，建立叢生竹竹葉中總黃酮及牡荊苷、異牡荊苷、葒草苷、異葒草苷含量測(cè)定方法。同時(shí)考察了勃氏甜龍竹超聲提取的最佳方法，為叢生竹資源的開發(fā)利用奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

以勃氏甜龍竹、箬竹、浦竹仔及椅子竹4種叢生竹的葉子作為分析樣品，樣品采自于云南省林業(yè)科學(xué)院樹木園(2017年3月20日)。將采集的竹葉樣品清洗，自然晾干，粉碎，過40目篩備用。

1.2 試劑與儀器

主要試劑 色譜甲醇、無水乙醇、甲醇、丙酮、石油醚(所用試劑均為分析純)、標(biāo)準(zhǔn)品為蘆丁、牡荊苷、異牡荊苷、葒草苷、異葒草苷，購自于上海安譜實(shí)驗(yàn)科技公司。

主要儀器 高效液相色譜儀(安捷倫1260)、超聲儀、旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

(1)竹葉黃酮超聲提取方法 精密稱取1.00g勃氏甜龍竹樣品，置于具塞三角瓶中，加入1︰10的溶劑，于40℃超聲提取1h。提取液用3倍石油醚萃取3次，去除上層石油醚相，收集，用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀旋蒸至干，稱量重量，計(jì)算樣品總黃酮得率。

(2)最適提取溶劑的確定 精密稱量1.00g勃氏甜龍竹樣品4份，分別加入1︰10的70%甲醇溶液、70%乙醇溶液、70%丙酮溶液及水，采用超聲提取法提取，分別計(jì)算不同提取溶劑的總黃酮得率，以篩選最佳的提取溶劑。

(3)最適料液比的確定 精密稱量1.00g勃氏甜龍竹樣品，分別加入料液比為1︰1,1︰5,1︰10,1︰20,1︰30的70%甲醇溶液，采用超聲提取法提取，分別計(jì)算不同提取溶劑的總黃酮得率，以篩選最佳的料液比。

(4)最適提取時(shí)間的確定 精密稱量1.00g勃氏甜龍竹樣品，分別加入1︰20的70%甲醇溶液，采用超聲提取法提取，提取時(shí)間分別為20min、40min、60min、80min、120min，分別計(jì)算不同提取溶劑的總黃酮得率，以篩選最佳的提取時(shí)間。

(5)最適提取溫度的確定 精密稱量1.00g勃氏甜龍竹樣品，分別加入1︰20的70%甲醇溶液，采用超聲提取法提取，提取時(shí)間60min，提取溫度分別為0℃、10℃、20℃、40℃、60℃，分別計(jì)算不同提取溶劑的總黃酮得率，以篩選最佳的提取溫度。

(6)叢生竹竹葉黃酮的提取 按照超聲提取的方法，對(duì)勃氏甜龍竹、箬竹、浦竹仔、椅子竹4種叢生竹中竹葉總黃酮進(jìn)行提取，過濾后，濾液經(jīng)3倍石油醚進(jìn)行萃取，除去石油醚相，剩余提取液經(jīng)0.45μm的濾膜過濾，用于HPLC分析。

(7)蘆丁及竹葉黃酮標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制 準(zhǔn)確稱取0.004 5g蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品，用色譜純甲醇定容至10mL，配制成0.45mg/mL的蘆丁標(biāo)準(zhǔn)溶液。分別取0.1mL、0.2mL、0.4mL、0.6mL、0.8mL及1.0mL母液，分別定容至1.0mL，配制成濃度分別為0.045mg/mL、0.09mg/mL，0.18mg/mL、0.27mg/mL、0.36mg/mL、0.45mg/mL的標(biāo)準(zhǔn)溶液，經(jīng)HPLC分析后，相應(yīng)結(jié)果用于標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制。準(zhǔn)確稱取牡荊苷0.007 2g，異牡荊苷0.006 4g，葒草苷0.009 3g，異葒草苷0.005 8g，用色譜純甲醇定容至10mL，配制成標(biāo)準(zhǔn)溶液。分別取不同體積的母液混合，定容至1.0mL，配制成不同濃度的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，經(jīng)HPLC分析后，相應(yīng)結(jié)果用于標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制。

(8)HPLC條件 高效液相色譜儀為安捷倫1260，色譜柱為Eclipse plus C18 column(4.6mm×150mm,5μm),流動(dòng)相0.5%磷酸(A)和甲醇(B)為洗脫劑。洗脫條件為0-30min,90%A，10%B。檢測(cè)波長(zhǎng)為330nm；流速為1.0mL/min；柱溫為35℃；進(jìn)樣量為10μL。紫外吸收掃描波長(zhǎng)范圍為200-400nm。

(9)叢生竹竹葉黃酮含量的測(cè)定 將配好的不同濃度的蘆丁標(biāo)準(zhǔn)溶液按照HPLC的方法進(jìn)行上樣分析，所得結(jié)果用于繪制蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品的標(biāo)準(zhǔn)曲線。將提取處理好的4種叢生竹提取液按照HPLC的方法上樣分析，分析結(jié)果采用外標(biāo)法結(jié)合標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算叢生竹中竹葉總黃酮含量。

(10)叢生竹中牡荊苷、異牡荊苷、葒草苷、異葒草苷含量的測(cè)定 將配好的不同濃度的竹葉黃酮標(biāo)準(zhǔn)品溶液按照HPLC的方法上樣分析，進(jìn)行分別上樣和混合上樣，所得結(jié)果用于繪制標(biāo)準(zhǔn)品的標(biāo)準(zhǔn)曲線。將提取處理好的4種叢生竹提取物按照HPLC的方法上樣分析，分析結(jié)果結(jié)合混合標(biāo)品中各竹葉黃酮標(biāo)準(zhǔn)曲線，采用外標(biāo)法對(duì)叢生竹中牡荊苷、異牡荊苷、葒草苷、異葒草苷含量進(jìn)行計(jì)算。

2 結(jié)果與分析

2.1 叢生竹竹葉黃酮超聲提取工藝

研究考察了勃氏甜龍竹的超聲提取工藝，以竹葉總黃酮得率為指標(biāo)，分別考察了提取溶劑、料液比、提取溫度及超聲提取時(shí)間對(duì)得率的影響，確定其最佳的超聲提取工藝為:以70%甲醇作為提取溶劑，料液比1︰10，提取溫度40℃，超聲提取1h(圖1)。

圖1勃氏甜龍竹提取工藝

Fig.1 Extraction process ofD.brandisii(Munro)Kurz

2.2 HPLC測(cè)定竹葉黃酮中總黃酮的含量

2.2.1 叢生竹樣品HPLC色譜圖

采用叢生竹樣品的提取方法，將勃氏甜龍竹(a)、箬竹(b)、浦竹仔(c)、椅子竹(d)4種叢生竹中竹葉黃酮進(jìn)行提取，處理后進(jìn)行HPLC分析。4種叢生竹葉黃酮提取物的HPLC色譜圖見圖2。

圖24種叢生竹樣品HPLC色譜圖

注：勃氏甜龍竹〔Dendrocalamusbrandisii(Munro)Kurz〕，箬竹〔Indocalamustessellatus(Munro)Keng f.〕，浦竹仔(IndosasahispidaMcClure)，椅子竹(DendrocalamusbambusoidesHsueh et D.Z.Li)

Fig.2 HPLC chromatogram of four cluster bamboo

2.2.2 4種叢生竹竹葉總黃酮含量

以峰面積A為縱坐標(biāo)對(duì)蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)樣濃度C(mg/mL)進(jìn)行線性回歸，回歸方程為，A=12 589.67 C(mg/mL)+80.37，R2=0.998 7。根據(jù)蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線及各樣品HPLC總峰面積(A≥50)，采用外標(biāo)法，對(duì)4種叢生竹樣品中的總黃酮含量進(jìn)行測(cè)定，結(jié)果見表1。4種叢生竹竹葉總黃酮含量，從高到低依次為箬竹>椅子竹>勃氏甜龍竹>浦竹仔。

2.3 HPLC測(cè)定叢生竹中牡荊苷、異牡荊苷、葒草苷、異葒草苷的含量

2.3.1 4種標(biāo)準(zhǔn)品混合的HPLC色譜圖

圖3為4種竹葉黃酮標(biāo)準(zhǔn)品同時(shí)進(jìn)樣分析的HPLC色譜圖。從圖3可以看出，4種標(biāo)準(zhǔn)品的色譜峰均能被同時(shí)檢測(cè)到，并且各色譜峰之間實(shí)現(xiàn)了基線分離。葒草苷、異葒草苷、牡荊苷、異牡荊苷標(biāo)準(zhǔn)品的保留時(shí)間(RT)分別為13.978min、14.286min、15.007min、15.887min。此方法的建立，為后續(xù)叢生竹樣品中4種黃酮的同時(shí)測(cè)定奠定基礎(chǔ)。

表1 竹葉總黃酮含量

圖3 混合標(biāo)準(zhǔn)品HPLC色譜圖

2.3.2 4種叢生竹中牡荊苷、異牡荊苷、葒草苷、

異葒草苷含量測(cè)定

以峰面積A為縱坐標(biāo)分別對(duì)牡荊苷、異牡荊苷、葒草苷及異葒草苷標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)樣濃度C(mg/mL)進(jìn)行線性回歸，回歸方程分別為：牡荊苷A1=32 880.40 C(mg/mL)-257.80，R2=0.998 1；異牡荊苷A2=29 567.56 C(mg/mL)+405.8，R2=0.998 9；葒草苷A3=22 193.4 C(mg/mL)+183.59，R2=0.996 2；異葒草苷A4=23 969.14 C(mg/mL)+658.19，R2=0.994 4。根據(jù)4種竹葉黃酮標(biāo)準(zhǔn)品的標(biāo)準(zhǔn)曲線及各樣品HPLC總峰面積(A≥50)，采用外標(biāo)法，對(duì)4種竹葉樣品中牡荊苷、異牡荊苷、葒草苷、異葒草苷含量進(jìn)行測(cè)定，結(jié)果見表2。

表2 4種叢生竹中牡荊苷、異牡荊苷、葒草苷、

3 結(jié)論與討論

本研究采用超聲提取法對(duì)勃氏甜龍竹中竹葉黃酮進(jìn)行提取，并考察了提取溶劑、料液比、提取時(shí)間及提取溫度對(duì)竹葉黃酮總得率的影響，篩選出勃氏甜龍竹最佳的提取工藝為70%甲醇作為提取溶劑、料液比為1:10、超聲時(shí)間60min、溫度40℃。在最佳條件下勃氏甜龍竹中總黃酮得率能達(dá)到4.63%。超聲提取方法所需時(shí)間較短，操作較為簡(jiǎn)單，能實(shí)現(xiàn)擴(kuò)大化生產(chǎn)。

采用HPLC法及外標(biāo)法，對(duì)勃氏甜龍竹、箬竹、浦竹仔、椅子竹4種叢生竹中竹葉總黃酮及牡荊苷、異牡荊苷、葒草苷、異葒草苷的含量進(jìn)行測(cè)定。蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為A=12 589.67 C(mg/mL)+80.37，R2=0.998 7，4種叢生竹中總黃酮含量分別為0.795 2%、1.166 9%、0.092 6%、0.897 2%。其中箬竹中總黃酮含量最高，浦竹仔中總黃酮含量較低。HPLC法測(cè)定箬竹總黃酮的結(jié)果與采用紫外分光光度法進(jìn)行測(cè)定的相差不大(箬葉總黃酮含量在1.38%-1.92%)[15]，但采用HPLC操作更為簡(jiǎn)單，效率高，并且葉綠素對(duì)結(jié)果干擾小，結(jié)果更準(zhǔn)確。4種標(biāo)準(zhǔn)品的標(biāo)準(zhǔn)曲線分別為，牡荊苷A1=32 880.40 C(mg/mL)-257.80，R2=0.998 1；異牡荊苷A2=29 567.56 C(mg/mL)+405.8，R2=0.998 9；葒草苷A3=22 193.4 C(mg/mL)+183.59，R2=0.996 2；異葒草苷A4=23 969.14 C(mg/mL)+658.19，R2=0.994 4。勃氏甜龍竹、箬竹和椅子竹中均含有牡荊苷、異牡荊苷、葒草苷及異葒草苷，浦竹仔中僅含有牡荊苷和異牡荊苷。本研究采用HPLC并分別以蘆丁及牡荊苷、異牡荊苷、葒草苷、異葒草苷對(duì)4種叢生竹中總黃酮及黃酮單體的含量進(jìn)行了測(cè)定，使得測(cè)定結(jié)果更加準(zhǔn)確。

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