劉秀娟，張念云，孫 飆，王 斌，徐 妍

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肌注異體脂肪間充質(zhì)干細胞對離心運動后大鼠骨骼肌調(diào)節(jié)因子的影響

劉秀娟1，張念云1，孫 飆1，王 斌1，徐 妍2

1. 南京體育學院 運動健康科學系, 江蘇 南京 210014; 2. 南京市再生醫(yī)學工程技術(shù)研究中心, 江蘇 南京 210000

目的：通過肌肉注射異體脂肪間充質(zhì)干細胞（ASCs），觀察其對一次性離心運動后不同時間點大鼠骨骼肌調(diào)節(jié)因子的影響，探討ASCs注射對離心運動后骨骼肌損傷修復(fù)的機制。方法：8周齡雄性SD大鼠一次性離心運動后，在左腿腓腸肌注射生理鹽水（PBS），右腿腓腸肌注射ASCs，然后，隨機分為運動后1天組（D1）、運動后3天組（D3）、運動后7天組（W1）和運動后14天組（W2）。透射電鏡觀察骨骼肌的超微結(jié)構(gòu)變化；測定血清IGF1、GDF8的含量及骨骼肌調(diào)節(jié)基因的表達。結(jié)果：與PBS相比，ASCs注射明顯促進肌纖維的修復(fù)。與D1組比較，W1組血清IGF1水平顯著降低（＜0.05），GDF8水平顯著降低（＜0.05），W2組血清GDF8水平顯著升高（＜0.05）。與PBS組相比，ASCs組IGF1 mRNA在W2顯著升高（＜0.05）；GDF8 mRNA在D3顯著降低（＜0.05），在W2極顯著降低（＜0.01）；Atrogin1 mRNA在D3顯著降低（＜0.05），在W1時間點極顯著降低（＜0.01）。PBS組IGF1 mRNA與血清IGF1含量、GDF8 mRNA與血清GDF8含量均顯著性正相關(guān)（＜0.05）；骨骼肌總的PCNA mRNA與總的IGF1 mRNA顯著性正相關(guān)（＜0.05）。結(jié)論：離心運動后，肌注異體ASCs可以增加骨骼肌IGF1 mRNA的表達，降低GDF8和Atrogin1的mRNA表達。肌注異體ASCs可能不影響細胞因子IGF1和GDF8的分泌，而是通過影響局部基因表達來改善離心運動后肌肉的再生修復(fù)。

離心運動；間充質(zhì)干細胞；骨骼?。籌GF1；GDF8

運動過程，尤其是急性運動，經(jīng)常會引起運動損傷，其中以肌肉的損傷最為常見[3]。如何快速修復(fù)運動損傷成為人們關(guān)心的熱點問題之一。在肌肉修復(fù)過程中，很多因子被分泌出來。胰島素樣生長因子（IGFs）可以促進肌細胞的增殖和分化，在肌肉再生和肥大過程中發(fā)揮關(guān)鍵作用[26]。而近年來有研究報道，肌肉生長抑制素（myostatin，也叫GDF8或MSTN），一個骨骼肌生長負調(diào)控因子，也影響骨骼肌的再生修復(fù)[8,11,19]。目前以干細胞為基礎(chǔ)的細胞療法正成為再生修復(fù)醫(yī)學研究領(lǐng)域中的熱點和前沿。

骨骼肌干細胞——衛(wèi)星細胞可以促進肌肉損傷后修復(fù)[12]。肌肉的再生能力隨衛(wèi)星細胞數(shù)量和功能的下降逐漸降低，衛(wèi)星細胞是直接導(dǎo)致肌肉修復(fù)的細胞。衛(wèi)星細胞通過調(diào)節(jié)MyoD1促進成肌細胞的分化[21]。由于衛(wèi)星細胞隨年齡的增長逐漸減少并且不便于提取獲得，故多用間充質(zhì)干細胞進行研究。間充質(zhì)干細胞可以改善肌肉組織再生[17]。脂肪來源的間充質(zhì)干細胞可以分化為骨骼肌衛(wèi)星細胞[14]。遇到刺激，如外傷或運動，衛(wèi)星細胞被激活并表達生肌調(diào)節(jié)因子（MRFs），如轉(zhuǎn)錄因子Myf5、MyoD1、Myogenin和MRF4等，增殖并分化為肌纖維。在離心運動引起的肌肉損傷修復(fù)過程中，局部注射間充質(zhì)干細胞是否可以改善肌肉損傷的修復(fù)？在此過程中，其對生肌調(diào)節(jié)因子和骨骼肌調(diào)節(jié)因子IGF1和GDF8有無影響，尚不清楚。本研究通過肌注異體脂肪間充質(zhì)干細胞，觀察離心運動后恢復(fù)期骨骼肌調(diào)節(jié)因子的變化，探討其在離心運動后肌肉損傷修復(fù)中的作用。

1 實驗材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物與分組

8周齡SPF級SD雄性大鼠44只，購自南京醫(yī)科大學實驗動物中心，適應(yīng)性飼養(yǎng)1周，自由進食進水，光照比為12 h:12 h。然后進行一次性離心運動，運動后隨機分為4組，分別是運動后1天組（D1）、運動后2天組（D2）、運動后7天組（W1）和運動后14天組（W2），每組11只。

1.1.2 運動方案

進行一次性跑臺運動，跑臺坡度為-20°，速度為 20 m/min，運動時間為90 min。實驗開始前，為適應(yīng)運動，首先讓大鼠從靜止慢慢加速到20 m/min，這個漸進加速過程在5 min內(nèi)完成，等速度增加至20 m/min時，開始計算時間，并且之后一直保持在這個速度，持續(xù)90 min。運動結(jié)束后30 min，在大鼠的左腿腓腸肌外側(cè)頭注射100 μL生理鹽水，右腿腓腸肌外側(cè)頭注射100 μL含間充質(zhì)干細胞數(shù)量為5×105的生理鹽水（脂肪間充質(zhì)干細胞從280～300 g雌性大鼠腹部脂肪組織分離得到），分別在注射后24 h，72 h，7天，14天后將大鼠麻醉處死，收集血液，血液經(jīng)3 000 r/min，4 ℃離心后，分離血清置于-80 ℃超低溫冰箱保存；分別收集左右兩腿的腓腸肌，部分用戊二醛和鋨酸固定，用于組織學研究，部分置于液氮速凍，后轉(zhuǎn)入-80 ℃超低溫冰箱凍存?zhèn)溆谩?/p>

1.1.3 主要儀器設(shè)備與試劑

全自動酶標儀（TECAN M200pro）、實時熒光定量PCR儀（ABI Step One Plus，AppliedBiosystems公司）。GDF8 Elisa檢測試劑盒(DGDF80, R&D Systems, USA)，IGF1 Elisa檢測試劑盒(ELR-IGF1,Rio-Biotech, USA)，購自南京福麥斯生物技術(shù)有限公司。提取組織RNA及PCR相關(guān)試劑Trizol（Invitrogen Life Technology），反轉(zhuǎn)錄試劑盒（TAKARA BIOINC, Japan），購自上海皓佳生物技術(shù)有限公司。

1.2 方法

1.2.1 脂肪間充質(zhì)干細胞（ASC）的制備

取280～300 g雌性SD大鼠的腹部脂肪組織，進行清洗剪碎，洗滌，加入膠原酶混勻后轉(zhuǎn)移到溫育搖床內(nèi)，37 ℃恒溫消化30～40 min，消化為糜狀后，1 000 r/min，離心3 min，去掉上層糜狀脂肪，添加10～20 mL消化終止液，混勻終止消化；用孔徑為100 μm的細胞篩網(wǎng)過濾，保留濾液。將濾液 1 200 r/min離心8 min，重復(fù)洗滌3次，制成細胞懸液后進行計數(shù)，按照直徑每100 mm培養(yǎng)皿5×106～2×107個細胞接種，原代培養(yǎng)24～48 h后，根據(jù)細胞的生長狀態(tài)進行細胞換液，鑒定，傳代，收集第3代脂肪間充質(zhì)干細胞進行實驗，本實驗脂肪間充質(zhì)干細胞由南京瑞吉科生物技術(shù)有限公司制備并提供。

1.2.2 腓腸肌組織超微結(jié)構(gòu)觀察

取腓腸肌組織樣，用戊二醛和鋨酸固定，送去南京醫(yī)科大學透射電鏡實驗室包埋，切片，電鏡(JEM—1010)觀察并拍照。

1.2.3 血清IGF1、GDF8的測定

血清IGF1和GDF8 的檢測嚴格按照Elisa試劑盒說明書進行測定。

1.2.4 基因檢測

腓腸肌總RNA用Trizol試劑盒提取。提取的總RNA用Nano Drop分光光度計（ND-2000）測定總RNA濃度和純度（OD260/OD280 = 1.8～2.0）。用瓊脂糖-甲醛變性凝膠電泳驗證RNA的完整性。檢測合格后，進行RT，獲得各樣品RNA的cDNA。RT產(chǎn)物經(jīng)驗證無基因組DNA污染后，保存在-20℃用于PCR檢測。根據(jù)GenBank上大鼠的相關(guān)cDNA序列采用Primer 5設(shè)計目的基因和內(nèi)參GAPDH的引物，引物由上海捷瑞生物技術(shù)有限公司合成，詳細序列見表1。實驗采用實時熒光定量PCR，以GAPDH為內(nèi)參，對目的基因的表達進行相對定量，用2-ΔΔCT法對有效性數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析。

1.2.5 統(tǒng)計方法

表1 實驗大鼠基因上下游引物序列

2 研究結(jié)果

2.1 注射干細胞與注射生理鹽水后腓腸肌形態(tài)結(jié)構(gòu)變化

由圖1可以看出，注射干細胞組在D1、D3、W1、W2任一時間點，肌纖維排列均比相應(yīng)時間點注射生理鹽水組整齊，表明間充質(zhì)干細胞注射有助于離心運動后骨骼肌的損傷修復(fù)。從時間上來看，一次性離心運動3天后，肌纖維排列最不規(guī)則，隨著時間的延長，逐漸恢復(fù)，從兩組的4個時間點比較可以看出，間充質(zhì)干細胞注射有助于一次性離心運動后肌纖維結(jié)構(gòu)的損傷恢復(fù)。

圖1 注射干細胞與注射生理鹽水后不同時間點腓腸肌形態(tài)結(jié)構(gòu)變化

Figure1. Morphological Changes of Gastrocnemius Muscle after Injection of Stem Cells and Saline Injection at Different Times

2.2 不同時間點大鼠血清IGF1和GDF8的濃度變化

由圖2可以看出，與D1組相比，W1組IGF1水平顯著降低（＜0.05），W1組GDF8水平顯著降低（＜0.05），W2組GDF8水平顯著升高（＜0.05），與D3組相比，W2組GDF8水平顯著升高（＜0.05）。

圖2 不同時間點大鼠血清IGF1和GDF8的水平變化

Figure2. Changes in Serum IGF1 and GDF8 Levels of Different Time Points

注：*表示與D1組比，＜0.05；#表示與D3組比，＜0.05。

2.3 注射干細胞后不同時間點大鼠腓腸肌基因表達的變化

由圖3可以看出，與PBS組相比，ASC組IGF1mRNA相對表達量在時間點W2顯著升高（＜0.05）；GDF8 mRNA相對表達量在時間點D3顯著降低（＜0.05），在W2時間點極顯著降低（＜0.01）；Atrogin1 mRNA相對表達量在時間點D3顯著降低（＜0.05），在W1時間點極顯著降低（＜0.01）；MyoD1、Myf5、Pax7、PCNA、MuRFmRNA相對表達量與PBS組相比在4個時間點均無統(tǒng)計學差異顯著性（＞0.05）。

2.4 IGF1、GDF8及PCNA相關(guān)性分析

如圖4所示，血清IGF1含量與GDF8含量無相關(guān)性（=0.593，圖4A）；PBS組IGF1 mRNA的表達與血清IGF1含量顯著性正相關(guān)（=0.011，圖4B）；ASC組IGF1 mRNA的表達與血清IGF1含量無相關(guān)性（=0.729，圖4C）；PBS組GDF8 mRNA的表達與血清GDF8含量顯著性正相關(guān)（=0.006，4D）；ASC組GDF8 mRNA的表達與血清GDF8含量無相關(guān)性（=0.627，圖4E）；PBS組PCNA mRNA的表達與PBS組IGF1 mRNA的表達顯著性正相關(guān)（=0.031，圖4F）；ASC組PCNA mRNA的表達與ASC組IGF1mRNA的表達顯著性正相關(guān)（=0.043，圖4G）；骨骼肌總的PCNA mRNA的表達與總的IGF1mRNA的表達顯著性正相關(guān)（=0.025，圖4H）。

3 分析與討論

骨骼肌是主要的運動器官，其生長發(fā)育及損傷修復(fù)狀況直接影響機體的運動能力。在運動過程中，肌肉損傷占所有運動型損傷的35%～55%。如何快速地進行損傷修復(fù)，不影響人們的日常生活，越來越受到關(guān)注。目前以干細胞為基礎(chǔ)的細胞療法正成為再生修復(fù)醫(yī)學研究領(lǐng)域中的熱點和前沿。干細胞具有自我更新、高度增殖和分化的能力，并可以大量移植，所以其被用于臨床組織再生的治療[4]。衛(wèi)星細胞是一種介導(dǎo)骨骼肌生長和再生的干細胞。離心運動有助于間充質(zhì)干細胞在骨骼肌中出現(xiàn)[22]。骨髓間充質(zhì)干細胞有助于離心運動后衛(wèi)星細胞的擴張，對肌肉再生修復(fù)有益。數(shù)據(jù)表明，Laminin-111補充提高骨骼肌干細胞的數(shù)量或功能，有利于離心運動損傷后骨骼肌的再生反應(yīng)[27]。這與我們的結(jié)果相似，注射干細胞后在任一時間點，肌纖維排列均比相應(yīng)時間點注射生理鹽水組整齊，表明間充質(zhì)干細胞注射有助于一次性離心運動后肌纖維結(jié)構(gòu)的損傷恢復(fù)。研究報道，骨髓間充質(zhì)干細胞在肌肉收縮后自然積聚，可增強對運動的適應(yīng)性反應(yīng)[28]，這與我們的結(jié)果類似。

已有研究顯示，間充質(zhì)干細胞可以促進肌肉的再生修復(fù)。人骨髓間充質(zhì)干細胞對小鼠骨骼肌的再生有長期的影響[1]。骨髓間充質(zhì)干細胞有助于離心運動后骨骼肌血管的生成[7]。體外研究顯示，間充質(zhì)干細胞可以促進皮膚損傷后的再生[16]。成年大鼠骨髓間充質(zhì)干細胞治療可以延緩失神經(jīng)肌肉的萎縮[9]。進一步研究發(fā)現(xiàn)，間充質(zhì)干細胞干預(yù)通過影響生肌相關(guān)基因的表達，促進骨骼肌的修復(fù)。骨髓間充質(zhì)干細胞可以促進體外成肌細胞表達肌間線蛋白（desmin），肌細胞增強因子2（MEF2），肌球蛋白重鏈2（MHC2）和α-橫紋肌肌動蛋白（α-SCA）等，使其分化為肌肉組織[24]。LO等報道，間充質(zhì)干細胞能夠增加肌源性標記物Pax7，MyoD的表達[15]。VU等也發(fā)現(xiàn)，同種異體間充質(zhì)干細胞移植可以顯著增加MyoD和Myf5的表達[23]，促進肌肉再生修復(fù)。LIU等發(fā)現(xiàn)，自體脂肪間充質(zhì)干細胞移植能增加PCNA的表達，顯著改善肝臟的再生能力[13]。HU等也發(fā)現(xiàn)，人脂肪源性間充質(zhì)干細胞可以增加成纖維細胞PCNA的表達，促進細胞增殖，增加膠原蛋白的合成[5]。本研究中我們也檢測了相關(guān)基因的表達，發(fā)現(xiàn)離心運動后注射異體脂肪間充質(zhì)干細胞，顯著增加IGF1 mRNA的表達，這一結(jié)果與KIM等的研究報道相符[10]；顯著降低了MSTN和atrogin1的mRNA表達，GEHMERT等的報道脂肪源性間充質(zhì)干細胞分泌IGF1可以保護成肌細胞對抗MSTN的負面效應(yīng)[2]，可以很好地解釋這一結(jié)果。但脂肪間充質(zhì)干細胞注射對骨骼肌MyoD1、Myf5、Pax7、PCNA、MuRF的mRNA表達均沒有顯著影響，這與以上間充質(zhì)干細胞的研究報道不符，可能是受離心運動模型的影響，也可能受研究的組織、物種及在體離體等因素的影響。由我們的結(jié)果分析，在離心運動后，骨骼肌修復(fù)過程中，脂肪間充質(zhì)干細胞注射，主要通過影響骨骼肌IGF1、MSTN和atrogin1的mRNA表達來發(fā)揮作用，其深層次的機制，尚需進一步研究。

圖3 注射干細胞后不同時間點大鼠腓腸肌基因mRNA相對表達量

Figure3. Relative Expression of mRNA Gene in Gastrocnemius Muscle of Rats at Different Time Points after Injection of Mesenchymal Stem Cells

注：A: IGF1 mRNA; B: MyoD1 mRNA; C: Myf5 mRNA; D: Pax7mRNA; E: PCNA mRNA; F:GDF8 mRNA; G:MuRF mRNA; H:Atrogin1 Mrna; *表示與PBS組比，＜0.05;#表示與PBS組比，＜0.01。

圖4 IGF1、GDF8及PCNA相關(guān)性

Figure4. Correlation between IGF1, GDF8&PCNA

注：A：血清IGF1與血清GDF8相關(guān)性（n=32，=0.593）；B：PBS組IGF1mRNA與血清IGF1相關(guān)性（n=32，=0.011）；C：ASC組IGF1 mRNA與血清IGF1相關(guān)性（n=32，=0.729）；D：PBS組GDF8 mRNA與血清GDF8相關(guān)性（n=32，=0.006）；E：ASC組GDF8 mRNA與血清GDF8相關(guān)性（n=32，=0.627）；F：PBS組IGF1 mRNA與PCNA mRNA相關(guān)性（n=32，=0.031）；G：ASC組IGF1 mRNA與PCNA mRNA相關(guān)性（n=32，=0.043）；H：總的IGF1mRNA與PCNA mRNA相關(guān)性（n=64，=0.025）。

間充質(zhì)干細胞除通過影響骨骼肌相關(guān)基因的表達促進損傷修復(fù)外，許多研究表明，其還可以通過影響細胞的分泌功能改變肌肉的再生修復(fù)。KIM等研究報道，脂肪源性間充質(zhì)干細胞可能通過胰島素樣生長因子1（IGF-1）信號通路影響肩袖肌肉的再生[10]。此外，用重組生長因子IGF-1和間充質(zhì)干細胞刺激能顯著提高肌肉祖細胞對旁分泌的影響。PUMBERGER等在一個臨床的損傷模型中發(fā)現(xiàn)，間充質(zhì)干細胞的旁分泌信號明顯改善肌肉的重塑能力[18]。此外，在除骨骼肌以外的其他組織也發(fā)現(xiàn)間充質(zhì)干細胞影響細胞的增殖和分泌功能。HUAT等發(fā)現(xiàn)，在骨髓間充質(zhì)干細胞向神經(jīng)前體細胞分化的過程中，IGF-1促進細胞的增殖和存活[6]。XIAN等報道，在骨重建過程中，骨基質(zhì)釋放IGF-1通過激活mTOR，刺激從間充質(zhì)干細胞招募的成骨細胞分化，從而保持適當?shù)墓俏⒔Y(jié)構(gòu)和質(zhì)量[25]。對營養(yǎng)不良的小鼠，IGF-1注入連同間充質(zhì)干細胞治療可明顯降低肌肉炎癥和纖維化，并顯著提高肌肉力量。IGF1和骨髓間充質(zhì)干細胞聯(lián)合治療增強肌肉的修復(fù)效率[20]。本研究中，離心運動后肌肉注射異體脂肪間充質(zhì)干細胞，未發(fā)現(xiàn)排異反應(yīng)和炎性反應(yīng)，血清IGF1水平在1周后顯著降低，兩周后恢復(fù)；GDF8在離心運動1周后顯著降低，2周后顯著升高。與骨骼肌中相應(yīng)的mRNA表達的相關(guān)性分析發(fā)現(xiàn)，無論是IGF1還是GDF8的水平，均與注射生理鹽水組的相應(yīng)的IGF1和GDF8 mRNA表達呈顯著相關(guān)，而與注射間充質(zhì)干細胞組的IGF1和GDF8 mRNA表達無顯著相關(guān)，而血清中IGF1的水平與兩組骨骼肌中PCNA mRNA表達均呈顯著相關(guān)。推測，在離心運動后骨骼肌損傷修復(fù)過程中，間充質(zhì)干細胞局部注射可能不影響細胞因子IGF1和GDF8的分泌，而只是在注射局部起作用，在腓腸肌其對PCNA影響不大，推測，間充質(zhì)干細胞可能通過影響骨骼肌調(diào)節(jié)因子IGF1、GDF8和Atrogin1的表達發(fā)揮作用。間充質(zhì)干細胞干預(yù)可以促進離心運動后骨骼肌的損傷修復(fù)，其詳細機制仍需進一步研究。

4 小結(jié)

1. 離心運動后，肌注異體脂肪間充質(zhì)干細胞可以增加骨骼肌IGF1mRNA的表達，降低GDF8和Atrogin1的mRNA表達。

2. 肌注異體脂肪間充質(zhì)干細胞可能不影響細胞因子IGF1和GDF8的分泌，而是通過影響局部基因表達來改善離心運動后肌肉的再生修復(fù)。

[1] DELG A S, VAND V I,BOERSMA H,. Long-term contribution of human bone marrow mesenchymal stromal cells to skeletal muscle regeneration in mice[J]. Cell Transplant, 2011, 20(2): 217-231.

[2] GEHMERT S, WENZEL C, LOIBL M,. Adipose tissue-derived stem cell secreted IGF-1 protects myoblasts from the negative effect of myostatin[J]. Biomed Res Int, 2014, 2014: 129048.

[3] GURRIARAN-RODRIGUEZ U, SANTOS-ZAS I, GONZALEZ-SANCHEZ J,. Action of obestatin in skeletal muscle repair: stem cell expansion, muscle growth, and microenvironment remodeling[J]. Mol Ther, 2015, 23(6): 1003-1021.

[4] HU F, WANG X, LIANG G,. Effects of epidermal growth factor and basic fibroblast growth factor on the proliferation and osteogenic and neural differentiation of adipose-derived stem cells[J]. Cell Reprogram, 2013, 15(3): 224-232.

[5] HU L, WANG J, ZHOU X,. Exosomes derived from human adipose mensenchymal stem cells accelerates cutaneous wound healing via optimizing the characteristics of fibroblasts[J]. Sci Rep, 2016, 6: 32993.

[6] HUAT T J, KHAN A A, PATI S,. IGF-1 enhances cell proliferation and survival during early differentiation of mesench-ymal stem cells to neural progenitor-like cells[J]. BMC Neurosci, 2014, 15: 91.

[7] HUNTSMAN H D, ZACHWIEJA N, ZOU K,. Mesenchymal stem cells contribute to vascular growth in skeletal muscle in response to eccentric exercise[J]. Am J Physiol Heart Circ Physiol, 2013, 304(1): H72-H81.

[8] JEONG J, CONBOY M J, CONBOY I M. Pharmacological inhibition of myostatin/TGF-beta receptor/pSmad3 signaling rescues muscle regenerative responses in mouse model of type 1 diabetes[J]. Acta Pharmacol Sin, 2013, 34(8): 1052-1060.

[9] JIANG J, YAO P, GU Y,. Adult rat mesenchymal stem cells delay denervated muscle atrophy[J]. Cell Mol Neurobiol, 2012, 32(8): 1287-1298.

[10] KIM S H, CHUNG S W, OH J H. Expression of insulin-like growth factor type 1 receptor and myosin heavy chain in rabbit's rotator cuff muscle after injection of adipose-derived stem cell[J]. Knee Surg Sports Traumatol Arthrosc, 2014, 22(11): 2867-2873.

[11] KNIPE D W, FRASER A, LAWLOR D A,. Is interpregnan-cy interval associated with cardiovascular risk factors in later life? A cohort study[J]. BMJ Open, 2014, 4(3): e4173.

[12] LEG F, GRIFONE R, MOURIKIS P,. Six1 regulates stem cell repair potential and self-renewal during skeletal muscle regeneration[J]. J Cell Biol, 2012, 198(5): 815-832.

[13] LIU T, MU H, SHEN Z,. Autologous adipose tissuederived mesenchymal stem cells are involved in rat liver regeneration following repeat partial hepatectomy[J]. Mol Med Rep, 2016, 13(3): 2053-2059.

[14] LIU Y, YAN X, SUN Z,. Flk-1+ adipose-derived mesenchymal stem cells differentiate into skeletal muscle satellite cells and ameliorate muscular dystrophy in mdx mice[J]. Stem Cells Dev, 2007, 16(5): 695-706.

[15] LO S C, REVERBERI D, BALBI C,. Mesenchymal Stem cell-derived extracellular vesicles as mediators of anti-Inflamma-tory effects: Endorsement of macrophage polarization[J]. Stem Cells Transl Med, 2017, 6(3): 1018-1028.

[16] PARK S, CHOI Y, JUNG N,. Myogenic differentiation potential of human tonsil-derived mesenchymal stem cells and their potential for use to promote skeletal muscle regeneration[J]. Int J Mol Med, 2016, 37(5): 1209-1220.

[17] PINHEIRO C H, DE QUEIROZ J C, GUIMARAES-FERREIRA L,. Local injections of adipose-derived mesenchymal stem cells modulate inflammation and increase angiogenesis ameliorat-ing the dystrophic phenotype in dystrophin-deficient skeletal muscle[J]. Stem Cell Rev, 2012, 8(2): 363-374.

[18] PUMBERGER M, QAZI T H, EHRENTRAUT M C,. Synthetic niche to modulate regenerative potential of MSCs and enhance skeletal muscle regeneration[J]. Biomaterials, 2016, 99: 95-108.

[19] ROSSI G, ANTONINI S, BONFANTI C,. Nfix regulates temporal progression of muscle regeneration through modulat-ion of myostatin expression[J]. Cell Rep, 2016, 14(9): 2238-2249.

[20] SECCO M, BUENO C J, VIEIRA N M,. Systemic delivery of human mesenchymal stromal cells combined with IGF-1 enhances muscle functional recovery in LAMA2 dy/2j dystrophic mice[J]. Stem Cell Rev, 2013, 9(1): 93-109.

[21] TIERNEY M T, AYDOGDU T, SALA D,. STAT3 signaling controls satellite cell expansion and skeletal muscle repair[J]. Nat Med, 2014, 20(10): 1182-1186.

[22] VALERO M C, HUNTSMAN H D, LIU J,. Eccentric exercise facilitates mesenchymal stem cell appearance in skeletal muscle[J]. PLoS One, 2012, 7(1): e29760.

[23] VU N B, LE HT, DAO T T,. Allogeneic adipose-derived mesenchymal stem cell transplantation enhances the expression of angiogenic factors in a mouse acute hindlimb ischemic model[J]. Adv Exp Med Biol, 2017.

[24] WITT R, WEIGAND A, BOOS A M,. Mesenchymal stem cells and myoblast differentiation under HGF and IGF-1 stimulation for 3D skeletal muscle tissue engineering[J]. BMC Cell Biol, 2017, 18(1): 15.

[25] XIAN L, WU X, PANG L,. Matrix IGF-1 maintains bone mass by activation of mTOR in mesenchymal stem cells[J]. Nat Med, 2012, 18(7): 1095-1101.

[26] ZANOU N, GAILLY P. Skeletal muscle hypertrophy and regeneration: interplay between the myogenic regulatory factors (MRFs) and insulin-like growth factors (IGFs) pathways[J]. Cell Mol Life Sci, 2013, 70(21): 4117-4130.

[27] ZOU K, DEL M, HUNTSMAN H D,. Laminin-111 improves skeletal muscle stem cell quantity and function following eccentric exercise[J]. Stem Cells Transl Med, 2014, 3(9): 1013-1022.

[28] ZOU K, HUNTSMAN H D, CARMEN V M,. Mesenchymal stem cells augment the adaptive response to eccentric exercise[J]. Med Sci Sports Exerc, 2015, 47(2): 315-325.

Effects of Allogeneic Adipose Mesenchymal Stem Cells Injected Intramuscularly on Skeletal Muscle Regulatory Factors in Rats after Eccentric Exercise

LIU Xiu-juan1, ZHANG Nian-yun1, SUN Biao1, WANG Bin1, XU Yan2

1. Nanjing Sports Institute, Nanjing 210014 China; 2. Nanjing Regenerative Medicine Engineering Technology Research Center, Nanjing 210000 China.

Objective: To observe the effect of allogeneic adipose mesenchymal stem cells (ASCs) on skeletal muscle growth factor in rats at different time points after a single eccentric exercise, and to investigate the mechanism of ASCs injection in repairing skeletal muscle injury after eccentric exercise. Methods: After a one-off eccentric exercise in 8-week-old male SD rats, normal saline was injected into the gastrocnemius muscle in the left leg, and ASCs were injected into the gastrocnemius muscle of the right leg. The rats were randomly divided into four groups: one day（D1）, three days（D3）, seven days（W1）and fourteen days（W2）after exercise. Skeletal muscle ultrastructure was observed by electron microscopic. The content of IGF1 and GDF8 in serum was determined, andskeletal muscle regulatory factors was determined. Results:Compared with group PBS, the structure of muscle fiber was improved obviously in group ASCs. Compared with group D1, the serum IGF1 and GDF8 contents in group W1 were significantly decreased (＜0.05), the serum IGF1 and GDF8 content in group W2 was remarkably increased (＜0.05). Compared with group PBS, the expression IGF1 mRNA in group ASCs were notably enhanced at time point W2 (＜0.05), the expression of GDF8 mRNA were significantly decreased at time point D3 (＜0.05) and which were extremely significantly down-regulated at time point W2 (＜0.01). The expression of Atrogin1 mRNA were significantly decreased at time point D3 (＜0.05) and which were extremely significantly down-regulated at time point W1 (＜0.01). The expression of IGF1 mRNA in skeletal muscle showed significantly positive correlation with serum IGF1 content (＜0.05) in group PBS, that of GDF8 mRNA had higher correlation with serum GDF8 content in group PBS (＜0.01); and that of PCNA mRNA in skeletal muscle showed significant positive correlation with IGF1mRNA both in group PBS and in group ASCs (＜0.05). Conclusion: After eccentric exercise, allogeneic adipose mesenchymal stem cells injected intramuscularly can increase the transcription of IGF1 and decreased the transcription of GDF8 and Atrogin1 in skeletal muscle. Allogeneic adipose mesenchymal stem cells injected intramuscularly may not affect the secretion of IGF1 and GDF8, but it may improve the regeneration and repair of skeletal muscle after eccentric exercise through affecting local gene expression.

1002-9826(2018)03-0079-08

10.16470/j.csst.201803010

G804.2

Ａ

2018-01-02；

2018-03-18

江蘇省高校自然科學基金資助項目(17KJB180008);江蘇高校品牌專業(yè)建設(shè)工程資助項目(PPZY2015C255);江蘇高?！扒嗨{工程”資助。

劉秀娟,女,副教授,博士,主要研究方向為運動鍛煉的生物學基礎(chǔ),E-mail:lxjmqb2006@163.com。