付金菊，王強，陳玉龍，楊清香

（河南師范大學生命科學學院，河南新鄉(xiāng)453007）

目前，色素在食品和飼料行業(yè)中的應用日益劇增，具有廣闊的市場前景。天然提取色素主要來源于有色植物，受到原料等因素的制約，植物色素含量低、品質差異大，價格昂貴[1]。人工合成色素的安全性向來受到爭議，難以在食品領域得到廣泛的應用。利用微生物生產(chǎn)色素不僅克服了上述困難，而且微生物色素通常比植物或動物源色素具有更高的穩(wěn)定性和溶解性[2]。因此，利用微生物生產(chǎn)色素受到了越來越多研究者的關注。在產(chǎn)色素的微生物中，絲狀真菌色素含量高，易培養(yǎng)，成為微生物色素的重要來源，已報道的真菌色素近600種，如紅曲紅色素、類胡蘿卜素、蝦青素等[3]。真菌色素不僅在化學結構上表現(xiàn)出多樣性，而且擁有豐富多彩的顏色，是主要的產(chǎn)色素微生物[4]。真菌不僅能在固體培養(yǎng)基中產(chǎn)生色素，在液體培養(yǎng)基中同樣能產(chǎn)生大量色素，適宜于規(guī)模化生產(chǎn)[5]。然而，目前具有市場應用價值的微生物源色素依然有限，尋找有價值的色素仍然任重道遠。

本研究從三孢布拉霉培養(yǎng)過程中的污染平板上篩選得到一株產(chǎn)紅色素的絲狀真菌，初步判斷該色素與番茄紅素完全不同。為了進一步挖掘該絲狀真菌產(chǎn)紅色素的潛在價值，我們對該真菌進行了分子生物學鑒定，并對該紅色素進行了提取和初步分離，以及對常見物理化學因素的穩(wěn)定性。

1 材料與方法

1.1 菌株的培養(yǎng)

培養(yǎng)基：麥芽汁培養(yǎng)基、pH值自然[6]。

平板培養(yǎng)：將保藏于20%甘油里的菌液接種于6°麥芽汁固體培養(yǎng)基上，28℃下培養(yǎng)4 d。

發(fā)酵液培養(yǎng)：無菌條件下，用接種環(huán)從培養(yǎng)好的平皿中挑取一環(huán)接種于6°麥芽汁液體發(fā)酵培養(yǎng)基中，28℃，180 r/min培養(yǎng)5 d。

1.2 主要儀器

高速冷凍離心機：德國Sigma公司；LRX系列生化培養(yǎng)箱：上海恒科有限公司；電熱恒溫水浴鍋：上海醫(yī)療器械廠；離心機（5415R）：德國EPPENDORF公司；電泳儀：Powerpac USA；超凈工作臺：AIR TECH蘇州凈化設備有限公司；高壓蒸汽滅菌鍋（MLS－3781L－PS）：松下健康醫(yī)療器械株式會社；紫外可見分光光度計（UV2600）：島津儀器（蘇州）有限公司。

1.3 菌株的分子生物學鑒定

從培養(yǎng)的單菌落上挑取適量的菌體，用Takara微生物細胞裂解液裂解細胞，以細胞裂解液為模板，進行PCR擴增，以ITS序列通用引物ITS1、ITS4進行PCR 擴增[7]。各引物序列如下：ITS1（5′TCCGTTAGGTGAACCTGCGG3′），ITS4（5′TCCTCCGCTTATTGATATGC3′）所有引物均由上海生工公司合成。PCR擴增的反應體系為：25 μL的總反應體積中包含1 μL DNA模板，每個引物 0.8 μL，12.5 μL Mix，加水至 25 μL。擴增條件：95℃預變性5min，然后進行35個循環(huán)的擴增（細菌 94℃ 40 s，55℃ 90 s，72℃ 90 s；真菌 94℃ 30 s，54℃30 s，72℃1min），最后72℃延伸10min，PCR反應結束后，取5 μL反應產(chǎn)物，用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測目的條帶。將目的片段的PCR產(chǎn)物送到上海生工公司進行測序，利用BLAST與GenBank數(shù)據(jù)庫中18S rRNA基因和真菌ITS序列進行比對分析，通過MEGA4.1軟件對同源序列以及相關標準菌株的序列進行多重序列比對，使用Neighbor－Joining構建系統(tǒng)發(fā)育樹法，確定菌株的分類水平。

1.4 產(chǎn)色素真菌的發(fā)酵曲線的測定

配30瓶發(fā)酵液，每瓶接種2 mL濃度為107個/mL的孢子懸液。從發(fā)酵開始，每隔12小時取3瓶發(fā)酵液，離心，上清液在495 nm波長下測定紅色素的吸光值。菌絲體用洗滌3次，105℃烘干至恒重，即為生物量。

1.5 紅色素的提取

將菌株在發(fā)酵培養(yǎng)基中培養(yǎng)5天后，取25 mL發(fā)酵液，8 000 r/min 離心 10min，取上清液，使用 0.45 μm膜過濾，留下濾液。將紅色素提取液分別與等體積的乙醇，乙酸乙酯，石油醚混合，充分搖勻后靜置，觀察互溶情況。

1.6 全波長光譜掃描與高效液相色譜分析

將發(fā)酵120 h的發(fā)酵液過0.45 μm濾膜后，利用紫外可見分光光度計－UV2600對濾液進行全波長掃描，確定最大吸收波長。

色素成分分析采用高效液相色譜法，色譜柱為ZORBAX Eclipse Plus C18 柱（250 mm×4.6 mm）。流動相為乙腈 ∶水=60∶40，流速1 mL/min，檢測波長為495 nm。

1.7 紅色素穩(wěn)定性檢測

用蒸餾水將紅色素適當稀釋，直到其吸光度范圍在0.3～0.8之間，記下此時的吸光度，稀釋過的色素用于色素的穩(wěn)定性檢測。

1.7.1 pH 值對色素穩(wěn)定性的影響

分別取稀釋后的色素樣品5 mL于9支試管中，用氫氧化鈉和鹽酸將色素溶液調成不同的pH值，靜置30min后，在波長為495 nm處測定色素吸光度。

1.7.2 溫度對色素穩(wěn)定性的影響

分別取稀釋后的色素樣品5 mL于5支試管中，置于 20、40、60、80、100℃下的恒溫水浴鍋中，每個溫度下處理30min后拿出，在波長495 nm下檢測吸光度。

1.7.3 光照時間對色素穩(wěn)定性的影響

分別取稀釋后的色素樣品5 mL于8支試管中，分別置于自然光和紫外光下，照射 0、2、4、6、8、10 h 后，在波長為495 nm下測定其吸光度。

1.7.4 過氧化氫對色素穩(wěn)定性的影響

分別取稀釋后的色素樣品5 mL于8支試管中，向試管中各添加 0、1、2、3、4、5 mL 10%的過氧化氫溶液，然后用蒸餾水定容至10 mL，充分震蕩后靜置2 h，在波長為495 nm處檢測吸光度。

1.7.5 亞硫酸鈉對色素穩(wěn)定性的影響

分別取稀釋后的色素樣品5 mL于8支試管中，向試管中各添加 0、1、2、3、4、5 mL 10%的亞硫酸鈉溶液，然后定容至10 mL，震蕩后靜置2 h，在波長為495 nm處檢測吸光度。

2 結果與分析

2.1 產(chǎn)色素真菌的分離純化及形態(tài)特征

在培養(yǎng)產(chǎn)番茄紅素的三孢布拉霉固體平板上污染一株霉菌，其菌落周圍出現(xiàn)紅色，其菌絲特征和產(chǎn)生的紅色素在培養(yǎng)基中的擴散特征均明顯不同于三孢布拉霉菌及其產(chǎn)生的番茄紅素。將該菌株分離純化，菌落形態(tài)如圖1所示。

圖1 產(chǎn)紅色素真菌的菌落特征Fig.1 Colony characteristics of red-pigment-producing fungi

從菌落形態(tài)上判斷，該霉菌與三孢布拉霉具有很大差異，菌落表面呈深綠色，并且向周圍培養(yǎng)基中滲透大量紅色素。而三孢布拉霉的菌落呈黃色，并且不會向周圍培養(yǎng)基中滲透色素。因此，該霉菌很可能是一株分泌胞外色素的真菌，具有潛在的價值，值得進一步對菌種和所產(chǎn)色素進行鑒定。

2.2 產(chǎn)色素真菌的分子生物學鑒定

為了進一步鑒定該產(chǎn)色素真菌，擴增該真菌核糖體rRNA基因的IT1－IT4序列，并測序，將該序列在NCBI上進行同源性比對，選取同源性較高的序列，并使用Neighbor－Joining構建系統(tǒng)發(fā)育樹，結果如圖2所示。

從系統(tǒng)發(fā)育樹中可以看出，菌株YW1的IT1－IT4序列與踝節(jié)菌屬（Talaromyces）的產(chǎn)紫踝節(jié)菌（Talaromyces purpurogenum）在發(fā)育樹上聚為一簇，具有99%的相似性。因此，本研究將該產(chǎn)色素真菌命名為T.purpurogenum YW1。

圖2 產(chǎn)色素真菌YW1的Neighbor-joining系統(tǒng)進化樹Fig.2 Phylogenetic tree of T.purpurogenum YW1（Neighbor-joining）

2.3 產(chǎn)色素真菌的發(fā)酵曲線

產(chǎn)色素真菌的的生長過程曲線和紅色素的合成過程曲線如圖3所示。

圖3 產(chǎn)色素真菌的發(fā)酵曲線Fig.3 Fermentation curve of pigment fungi

從圖3中可以看出，該產(chǎn)色素真菌的生長速度較快，經(jīng)過短暫的適應期后，在發(fā)酵48 h生物量達到最大值[（13.51±1.22）g/L]，隨后進入穩(wěn)定期，并在96 h后生物量開始緩慢下降。紅色素的合成是在發(fā)酵36 h后開始，在48 h～96 h內快速合成，隨后保持穩(wěn)定。從發(fā)酵曲線可以看出，紅色素的合成是在霉菌進入穩(wěn)定期后開始的，是霉菌的次級代謝產(chǎn)物，這與大多數(shù)真菌色素相似。

2.4 紅色素的提取和分離

2.4.1 紅色素在不同溶劑中的溶解性

為了確定合適的提取溶劑，本研究將發(fā)酵液與不同極性的有機溶劑混合，靜置分層后，出現(xiàn)了不同的分層情況。在極性較弱的石油醚中，明顯的分為兩層，色素集中在水相，有機相中幾乎沒有顏色。當發(fā)酵液與乙酸乙酯互溶后，有機相中呈現(xiàn)黃色，水相為紅色。當發(fā)酵液與極性較大的乙醇互溶后，沒有出現(xiàn)分層，色素均勻的分布在溶液中。據(jù)此可以推測，該紅色素是具有較強的極性，可能是多種色素混合在一起，且主要為水溶性色素。水作為色素提取溶劑，不僅無毒、價格低廉，而且操作簡單，遠遠優(yōu)越于三孢布拉霉產(chǎn)生的番茄紅素的提取。通過對發(fā)酵液離心，得到的菌絲體用水洗滌5次，菌絲體接近無色，說明色素為胞外產(chǎn)物。與三孢布拉霉產(chǎn)生的番茄紅素相比較，減少了細胞破壁過程，大大節(jié)約了時間和色素提取成本。

2.4.2 色素的光譜吸收特征和組分分析

將發(fā)酵液過0.45 μm濾膜后，利用紫外可見分光光度計－UV2600對濾液進行全波長掃描，結果如圖4（a）所示。從掃描結果可以看出，有兩個峰值，說明色素成分不是單一的，但在波長為495 nm時得到最大吸收峰。為了進一步對色素的成分進行分離，本研究利用高效液相色譜對紅色素進行分離，結果如圖4（b）所示。

圖4 紅色素的全波長掃描及高效液相色譜分離Fig.4 Whole wavelength scanning and HPLC of red pigment

2.5 理化因素對紅色素穩(wěn)定性的影響

用蒸餾水將發(fā)酵液適當?shù)狡湮舛确秶?.3～0.8之間，進而對稀釋后的色素進行pH值、溫度、光照時間、氧化還原性等性質進行穩(wěn)定性檢測。以上理化因素對紅色素穩(wěn)定性的影響如圖5所示。

圖5 理化因素對色素穩(wěn)定性的影響Fig.5 Effects of physical and chemical factors on pigment stability

2.5.1 pH 值對色素穩(wěn)定性的影響

pH值對色素穩(wěn)定性的影響如圖5（a）所示，在pH值為5.5時，測得的OD值最高。但值得注意的是，在強酸（pH1.34）和強堿（pH11.71）的條件下，該色素的吸收分別達到最大吸收峰的74.83%和76.44%，說明該色素具有很好的酸堿穩(wěn)定性。

2.5.2 溫度對色素穩(wěn)定性的影響

將色素置于不同溫度下處理30min，測定其在495 nm下的吸光值，結果如圖5（b）所示。雖然隨著溫度的升高，測得的吸光值有所下降，但整體的下降速度和下降幅度并不大。當溫度從20℃升高的100℃時，色素的吸光值從0.74下降到0.62，下降幅度僅為16.2%。因此，該色素具有較好的熱穩(wěn)定性，可適用于溫度較高的環(huán)境。

2.5.3 光照對色素穩(wěn)定性的影響

將色素分別置于自然光和紫外線下處理不同時間，測定其在495 nm下的吸光值，結果如圖5（c）所示。隨著光照時間的增加，色素溶液OD值略微減小，但與對照相比，6 h內色素的OD值下降并不顯著。這說明該色素在自然光和紫外線的照射下，含量穩(wěn)定。

2.5.4 氧化劑、還原劑對色素分解的作用

將色素分別置于不同濃度的過氧化氫和亞硫酸鈉溶液中處理2 h，測定其在495 nm下的吸光值，結果如圖5（d）所示。在低濃度的過氧化氫溶液中，該色素溶液的OD值就迅速下降，隨著過氧化氫濃度的增加，OD值進一步下降。在較低亞硫酸鈉溶液中，色素的OD值就明顯下降，但隨著亞硫酸鈉的濃度進一步升高，色素的OD值保持穩(wěn)定。這可能是因為該紅色素不是單一的成分，而是含有多種色素，其中的一種或者多種色素對過氧化氫和亞硫酸鈉較為敏感。

3 結論與討論

雖然真菌色素種類很多，但真正具有商業(yè)化價值的色素較少，尤其食品和化妝品行業(yè)對新型天然色素的需求仍然較大。三孢布拉霉是工業(yè)上生產(chǎn)番茄紅素的主要菌種，菌落呈黃色或者紅色，所產(chǎn)生的番茄紅素是一種脂溶性的胞內色素，具有抗氧化、抗衰老等生理功能。而從三孢布拉霉污染平板上分離得到的這株霉菌無論從菌落形態(tài)還是所產(chǎn)色素，都與原菌大為不同。經(jīng)鑒定，該菌株為產(chǎn)紫踝節(jié)菌（T.purpurogenum）。踝節(jié)菌屬（Talaromyces）是 1955年 Benjamin將青霉屬（Penicillium）中的部分菌株歸類后定義的，現(xiàn)在產(chǎn)紫踝節(jié)菌（T.purpurogenum）在命名上仍與產(chǎn)紫青霉（P.purpurogenum）同用[8]。該真菌不僅能夠產(chǎn)生天然紅色素[9]，還能夠產(chǎn)生木聚糖酶、纖維素酶等[10-11]，在生物技術領域具有重要作用。已報道的該真菌所產(chǎn)的色素為紅曲色素的氨基衍生物PP-V[（10Z）-12-carboxyl-monascorubramine][12]，但并沒有關于該色素功能的研究，并且本研究所獲得的色素從液相圖譜看，其出峰時間與常用的色素番茄紅素、紅曲紅胺均不同，但是否為PP-V目前還不確定。未來需要對該色素進行進一步鑒定。

相比三孢布拉霉等菌株，產(chǎn)紫踝節(jié)菌在用于色素的生產(chǎn)具有諸多優(yōu)勢，如營養(yǎng)需求簡單，生長速度快，不易受到污染，色素產(chǎn)量高等。三孢布拉霉的培養(yǎng)需要正、負兩種菌株同時存在才能大量合成色素，并且菌絲濃度高、需氧量高，在放大培養(yǎng)過程中產(chǎn)量急劇下降[6，13]。而產(chǎn)紫踝節(jié)菌僅需要一種菌就能合成大量的紅色素，培養(yǎng)更容易，產(chǎn)量更穩(wěn)定。另外，產(chǎn)紫踝節(jié)菌產(chǎn)生的色素為胞外產(chǎn)物，色素產(chǎn)量提升潛力大，而且也降低了提取成本。作為水溶性的紅色素，不僅具有廣泛的應用范圍，而且在提取過程中不需要使用有機溶劑，即節(jié)約成本，又減少了環(huán)境污染[14]。因此，無論是菌株還是所產(chǎn)的紅色素，都比三孢布拉霉和番茄紅素更易于工業(yè)化。該紅色素的穩(wěn)定性結果表明，一般的理化因素對其影響不大，但氧化劑和還原劑對其有一定的降解作用。這說明該紅色素雖然不及番茄紅素的抗氧化性強，但可能也具有一定的抗氧化性，并且性質更穩(wěn)定，更適用于產(chǎn)品的著色劑等。然而，該紅色素的結構和功能，以及該產(chǎn)紫踝節(jié)菌是否產(chǎn)生有毒代謝產(chǎn)物還需進一步的鑒定，實現(xiàn)商業(yè)化生產(chǎn)仍需更多的研究。

綜上所述，本研究從三孢布拉霉污染平板上分離得到了一株能夠產(chǎn)生水溶性紅色素的霉菌，經(jīng)鑒定，該真菌為產(chǎn)紫踝節(jié)菌。菌株在生長的穩(wěn)定期（48 h發(fā)酵）產(chǎn)生紅色素，到發(fā)酵第120 h產(chǎn)量最大。紅色素經(jīng)過水提取后，在495 nm處具有最大吸收峰，經(jīng)液相色譜分析，該紅色素為復合色素，由4種以上的單色素組成，但與目前常用的番茄紅素、紅曲紅胺等在液相色譜中的出峰時間均不同；該色素具有對紫外線等光照不敏感，耐高溫、在強酸和強堿條件下都具有很好的穩(wěn)定性，并且為胞外水溶性分泌物，因此具有很好的開發(fā)價值。但需要進一步對其生理功能、結構以及毒性進行深入研究。

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