陳歷水，沈雪梅，劉蕾，張明，鄭曉衛(wèi)，楊海鶯，*，王冶，趙洪一，陳博

（1.中糧營養(yǎng)健康研究院，北京102209；2.營養(yǎng)健康與食品安全北京市重點實驗室，北京102209；3.老年營養(yǎng)食品研究北京市工程實驗室，北京102209；4.邵陽學院，湖南邵陽422200；5.北京工商大學食品學院，北京 100048）

黃酒是我國的傳統(tǒng)發(fā)酵食品，富含多種氨基酸和功能成分，營養(yǎng)豐富，與啤酒、葡萄酒并稱世界三大古酒[1]。通常以糯米為原料，經浸米、蒸煮、加曲、糖化發(fā)酵、壓榨、過濾、煎酒、貯存、勾兌而成。在酒的生產過程中，小曲（酒藥）和麥曲中含有的多種微生物，包括細菌、酵母和霉菌等在釀造的不同階段發(fā)揮著重要作用[2－3]。生物胺（Biogenic amines，BA）是黃酒在發(fā)酵過程中產生的一類低分子量含氮有機化合物，有研究發(fā)現(xiàn)過量外源生物胺的攝入會引起血管、動脈和微血管的擴大，導致生物體的不良反應，如高血壓、頭疼，腹部痙攣、腹瀉和嘔吐等[4]。飲用含有過量生物胺的發(fā)酵法生產的酒精類產品，如黃酒就會產生此類反應[5]。由于黃酒發(fā)酵是糖化、酵母發(fā)酵與乳酸桿菌發(fā)酵同時協(xié)同進行的三邊發(fā)酵[6]。發(fā)酵酒醪中的乳酸桿菌主要是從外界環(huán)境的微生物菌群和發(fā)酵用米帶入[7]，而且在酒醪發(fā)酵過程中，65%的雜菌是乳酸桿菌[8]。發(fā)酵過程中，曲霉分泌的蛋白酶和羧肽酶作用于蒸煮后原料米中的蛋白質，產生的氨基酸或寡肽為生物胺的形成提供了豐富的前體[9]，加上乳酸桿菌生長旺盛，將會造成生物胺的大量生成。因此，了解黃酒生產過程中菌群結構變化有助于生物胺含量的控制[10]。

本文以黃酒原米、小曲、麥曲以及發(fā)酵過程中的發(fā)酵液為研究對象，采用Illumina Miseq測序平臺對細菌的16S rRNA序列V3－V4區(qū)進行測序分析，研究黃酒麥曲及其發(fā)酵過程中細菌組成及變化，并對其產生的生物胺含量進行分析，旨在揭示黃酒發(fā)酵中細菌群落結構與生物胺含量的關系，為黃酒的釀酒工藝優(yōu)化及安全生產提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

黃酒用原米，黃酒酒藥（小曲）、黃酒麥曲、生產過程中的黃酒樣品（包括落缸、前酵、后酵、壓榨、清酒和煎酒后樣品）：中糧紹興酒有限公司。樣品采集完后立即于－80℃保存，備用。

DNA 提取試劑盒、KOD 酶、引物、Marker：上海生工生物工程有限公司；PCR產物Axy PrepDNA凝膠回收試劑盒：AXYGEN 公司；Quant－iTPicoGreen 熒光定量試劑盒：美國Life Technologies公司；TruSeq DNA建庫試劑盒、MiSeq上機試劑盒：美國Illumina公司。

1.2 儀器與設備

5810R臺式高速冷凍離心機：德國Eppendorf公司；ABI GeneAmp?9700型PC儀：美國ABI公司；DYY－12型電泳儀：北京六一儀器廠；UVPCDS－8000凝膠成像分析系統(tǒng)：美國伯樂公司；SpectraMax M5酶標儀：美國Molecular Device公司；Miseq基因組測序儀：美國 Illumina公司；藍色熒光定量系統(tǒng)：美國Promega公司。

1.3 方法

1.3.1 生物胺測定

測定方法參照GB/T 5009.208－2008《食品中生物胺含量的測定》。

1.3.2 小曲、麥曲及生產過程中黃酒樣品中細菌群落結構測定

1.3.2.1 總 DNA 提取

以提取的總DNA為模板，采用上游引物338F（ACTCCTACGGGAG GCAGCA） 和下游引物 806R（GGACTACHVGGGTWTCTAAT），進行 16S rRNA的V3－V4區(qū)域擴增。PCR采用Trans Start Fast Pfu DNA聚合酶（TransGen Biotech），反應條件為：95℃預變性3min；95℃變性 30 s，55℃退火 30 s，72℃延伸 45 s，30個周期；72℃延伸10min。擴增后PCR產物使用AxyPrepDNA凝膠回收試劑盒切膠回收，Tris－HCl洗脫；2%瓊脂糖電泳檢測。

1.3.2.2 文庫構建和上機測序使用

根據(jù)電泳結果，對PCR產物進行定量分析，之后按照比例調整到相同濃度，用于構建文庫。采用MiSeq平臺雙端PE300測序策略，使用上機試劑盒將文庫加入Miseq測序儀進行測序。

1.3.3 生物信息學分析和數(shù)據(jù)分析

同一階段的樣品數(shù)不少于3個。針對黃酒數(shù)據(jù)，對原始數(shù)據(jù)進行過濾拼接處理后，得到優(yōu)化序列。然后在97%的相似水平下，利用Usearch（vsesion 7.1 http：//drive5.com/uparse/）軟件平臺，劃分可操作分類單元（Operational Taxonomic Units，OTU），并挑取 OTU的代表序列[11]。采用RDP classifier貝葉斯算法[12]，設置置信度閾值為0.7，基于Silva數(shù)據(jù)庫（Release123 http：//www.arb-silva.de）[13]，對OTU代表序列進行分類學分析，并在各個水平（界、門、綱、目、科、屬、種）統(tǒng)計每個樣品的群落組成?；贠TU聚類分析結果，在Origin中繪制群落結構組分圖，同時利用R語言gplots包，繪制物種豐度的熱圖。通過R語言cor函數(shù)計算生物胺含量與所選物種的相關系數(shù)，然后采用corrplot包進行可視化。

2 結果與分析

2.1 黃酒小曲中細菌群落結構分析

黃酒小曲俗稱酒藥、酒餅，是我國特有的釀酒用糖化劑和發(fā)酵劑，同時具有糖化和發(fā)酵功能，包含細菌、酵母、霉菌等各種微生物，直接影響黃酒的質量。本研究使用高通量測序技術對小曲中細菌群落結構進行了分析，結果見圖1。

圖1 黃酒小曲中細菌群落結構（屬水平）Fig.1 Bacteria community structure in Xiao Qu（genus）

從圖1中可以看出，在屬水平上，小曲中主要包含13個屬的細菌，分別是芽孢桿菌屬（Bacillus）、魏斯氏屬（Weissella）、乳桿菌屬（Lactobacillus）、泛菌屬（Pantoea）、腸桿菌屬（Enterobacter）、克雷伯菌屬（Klebsiella）、沙雷氏菌屬（Serratia）、葡萄球菌屬（Staphylococcus）、短波單胞菌屬（Brevundimonas）、檸檬酸桿菌屬（Citrobacter）、不動桿菌屬（Acinetobacter）、片球菌屬（Pediococcus）和變形綱門（Mitochondria norank）。其中優(yōu)勢菌是芽孢桿菌屬（69.21%）、魏斯氏屬（14.07%）、乳桿菌屬（5.37%）、腸桿菌（2.43%）和克雷伯菌屬（2.68%），而未檢測到糖多孢菌屬（Saccharopolyspora）細菌。芽孢桿菌屬的細菌之所以能在小曲中占較高比例，原因可能是芽孢桿菌能夠在不利的環(huán)境中以芽孢的方式生存，具有一定的耐強酸堿，耐高溫的特點[2]。

2.2 麥曲中細菌群落結構分析

麥曲是黃酒中重要的糖化劑，含有細菌、酵母、霉菌等微生物[14]。麥曲在投料時這些微生物會一并帶入發(fā)酵液，是黃酒發(fā)酵微生物的重要來源[15-16]。通過高通量測序分析得到麥曲中細菌群落結構結果，見圖2。

由圖2顯示，在屬水平上，麥曲中豐度大于0.1%的細菌來自藍細菌（Cyanobacteria norank）、變形綱門（Mitochondria norank）、糖多孢菌屬（Saccharopolyspora）、泛菌屬（Pantoea）、芽孢桿菌屬（Bacillus）、腸桿菌科（Enterobacteriaceae unclassified）、沙雷氏菌屬（Serratia）以及鏈霉菌屬（Streptomyces）。其中藍細菌、變形綱門和糖多孢菌屬細菌的豐度分別為33.19%，27.86%和24.22%。糖多孢菌屬細菌是一類分布在土壤、河流和湖泊中安全的生物資源菌，同時發(fā)現(xiàn)，在麥曲中乳桿菌屬細菌豐度僅為0.02%。這與劉蕓雅等[3]的報道不一致，原因可能是麥曲原料的來源地不同引起的。

圖2 黃酒麥曲中細菌群落結構（屬水平）Fig.2 Bacteria community structure in Wheat Qu（at genus level）

2.3 黃酒生產過程中細菌群落結構分析

2.3.1 黃酒生產過程中不同階段的OTU數(shù)變化

本研究采用Illumina Miseq測序平臺對原米、浸米和發(fā)酵過程中細菌的16S rRNA的V3-V4區(qū)域進行分析，通過對數(shù)據(jù)優(yōu)化處理，得到不同樣品中的OTU數(shù)。結果表明，不同生產階段發(fā)酵液中的OTU數(shù)在122～474不等，表明黃酒生產過程中各個階段細菌物種豐富，并且物種多樣性變化明顯，具體結果如圖3所示。

圖3 黃酒生產過程中細菌OTU變化Fig.3 Changes in bacterial OTU during the production of rice wine

由圖3可見，原料原米和浸米樣品中OTU數(shù)為120左右，從前酵開始，OTU數(shù)升高，達200，呈上升趨勢，說明前酵后細菌多樣性增加，加入的酒藥和麥曲開始起作用，微生物種類增加。壓榨后，OTU數(shù)整體減小，物種多樣性逐漸降低，這與劉蕓雅等[3]的報道一致，也與白酒中細菌的變化情況一致[17-19]。原因可能是在發(fā)酵開始階段，原米、釀造水、外部環(huán)境都會帶入一部分細菌，加之發(fā)酵初期黃酒醪液中的營養(yǎng)成分豐富，有利于這些細菌中的部分細菌生長；隨著發(fā)酵的繼續(xù)進行，酒精度的升高、氧氣含量的降低以及酸度增加，使得一部分無法適應此環(huán)境條件的微生物生長受到抑制[3]。

2.3.2 黃酒生產過程中細菌群落結構在門水平上的變化

進一步對原米、浸米和不同生產階段發(fā)酵液中細菌群落結構進行分析，將測序樣品的序列進行比對，在生物分類學門的水平進行分類，分析結果見圖4。

圖4 黃酒生產過程中細菌群落結構變化（門水平）Fig.4 Changes in bacterial community structure during the production of rice wine（at kingdom level）

由圖4可以看出，原米與浸米及發(fā)酵液中主要由5個門構成：厚壁菌門（Firmicutes）、變形菌門（Proteobacteria）、藍藻門（Cyanobacteria）、擬桿菌門（Bacteroidetes）和放線菌門（Actinobacteria），這 5 大類細菌在整個發(fā)酵過程中均一直存在，且豐度變化比較顯著。比較原米和浸米的細菌群落結構，浸米中大量引入了厚壁菌門細菌，隨后蒸飯中該門細菌豐度有所降低。不過在后期的工藝流程中豐度逐漸增加，在清酒期間達到最高豐度，成為發(fā)酵液中的優(yōu)勢菌。

2.3.3 黃酒生產過程中細菌群落結構在屬水平上的變化

進一步對不同發(fā)酵階段中細菌群落結構進行分析，將豐度前30的細菌數(shù)據(jù)（屬水平）進行豐度相似性聚類，然后將其表示在熱圖上（圖5）。

圖5 黃酒生產過程中細菌屬水平上各工藝流程物種豐度變化熱圖Fig.5 Species abundance change heat map at genus level during the process of rice wine

通過顏色深淺梯度及相似程度來反映多個樣本在各分類水平上群落組成的相似性和差異性。在整個工藝流程中藍細菌的豐度呈下降趨勢，直到清酒過程達到最低，但最后的煎酒結束，發(fā)現(xiàn)其豐度有所上升。同時，變形綱門細菌也具有表型相同的趨勢。原米經過浸泡后，微生物群落發(fā)生顯著變化，乳桿菌屬和乳球菌屬（Lactococcus）微生物成為群落中的優(yōu)勢種屬，同時浸米水中醋酸桿菌屬（Acetobacter）也達到了20%的豐度。狹義的梭菌屬（Clostridium sensu stricto）在清酒的發(fā)酵液中豐度出現(xiàn)井噴式增加，由占上一階段壓榨結束后的不到1%增加到30%左右。假單胞菌屬（Pseudomonas）微生物在原米中的豐度為3.4%，在發(fā)酵過程中豐度維持在1%左右，在最后的煎酒檢測中，其成為群落中的優(yōu)勢種屬之一，由前期的1%左右增加到7.6%。而藍細菌、變形綱門以及芽孢桿菌屬細菌豐度降低。

2.4 黃酒生產過程中生物胺含量與菌群變化

2.4.1 黃酒生產過程生物胺含量變化分析

通過測定麥曲和小曲及不同生產過程中生物胺的含量變化，結果如表1所示。

表1 黃酒生產過程中生物胺含量變化Table 1 Changes of biogenic amine during the production of rice wine

從表1可以看出，腐胺（Putrescine）是黃酒生物胺中的主要成分，其次是色胺（Tryptamine）、酪胺（Tyramine）、苯乙胺（Phenethylamine）、亞精胺（Spermidine）、尸胺（Cadaverine）、精胺（Spermine），而未檢測到組胺（Histamine）。浸米體系中腐胺含量高達26.47 mg/kg，但隨著浸米水的去除以及淋米環(huán)節(jié)，落缸后體系中的腐胺含量顯著下降。從落缸到壓榨，腐胺的含量逐漸上升，后酵結束壓榨階段其含量高達29.08 mg/L；壓榨后其含量逐漸下降。

通過測定麥曲和小曲及不同生產階段生物胺的含量變化可以看出，在麥曲中，生物胺含量比較高，總量為56.53 mg/L，小曲中生物胺總量為18.34 mg/L，與張鳳杰等[20]報道一致。在生產階段，從落缸到壓榨，腐胺的含量逐漸上升，壓榨后進行高溫殺菌，微生物不再起作用了，所以腐胺含量逐漸下降。色胺、酪胺、亞精胺和精胺在前酵結束后含量最高，然后下降。

黃酒中的生物胺主要來自微生物代謝，釀酒工藝（如不同基質）通過影響這些微生物的生長和代謝而影響生物胺含量。另外，試驗發(fā)現(xiàn)有些乳酸菌不產生物胺，甚至能分解部分生物胺。在不影響黃酒口味和營養(yǎng)的前提下，通過調整釀造工藝，使這部分優(yōu)勢菌株發(fā)揮其優(yōu)良的釀造特性，并抑制其他菌株的代謝，可以控制和降低黃酒生物胺。黃酒的機械化和現(xiàn)代化釀造是行業(yè)發(fā)展的方向，利用安全性好且發(fā)酵性能優(yōu)良的菌株或菌群可以從根本上控制生物胺。有研究已證明將植物乳桿菌應用于浸米過程，可降低浸米水中的生物胺[21－22]。

2.4.2 生物胺含量變化與菌群結構的相關性分析

在落缸后整個生產過程中，比較生物胺含量與細菌豐度的相關性如圖6。由圖6可知腐胺的積累與乳桿菌屬、明串珠菌屬（Leuconostoc）、鞘氨醇桿菌屬（Sphingobacterium）、不動桿菌屬和穩(wěn)桿菌屬（Empedobacter）細菌豐度的增加呈顯著相關性（P＜0.05），也就是說以上5類細菌對腐胺的產生做出了重要貢獻。腐胺和尸胺的變化具有一定的相關性，與腐胺呈正相關的細菌同時與尸胺的變化具有一致的相關性。酪胺的含量變化與乳桿菌屬、魏斯氏屬和片球菌屬的豐度呈正相關，其中與片球菌屬的相關系數(shù)為0.92?？傮w而言，生物胺的積累與乳桿菌屬、明串珠菌屬、魏斯氏屬、鞘氨醇桿菌屬、片球菌屬、新鞘氨醇桿菌屬（Novosphingobium）、梭菌屬（Clostridium）以及腸菌科細菌豐度的增加具有一定的相關性。Hong等發(fā)現(xiàn)[23]，黃酒酸敗是由于發(fā)酵前期乳桿菌屬細菌，特別是短乳桿菌（L.brevis）大量繁殖導致的，此時發(fā)酵液中有益微生物多樣性和豐度均顯著降低。結合本研究發(fā)現(xiàn)浸米中乳桿菌屬細菌顯著增加，推測浸米中腐胺含量顯著增加與乳桿菌屬細菌迅速繁殖密切相關。Beatriz del Rio等[24]研究發(fā)現(xiàn)，乳酸乳球菌（L.lactis）在酸性條件下轉錄激活腐胺的生物合成。同時該實驗室證實，可以通過NaCl抑制細胞的生長和基因的表達從而降低腐胺的產量[25]。結合研究顯示，整個黃酒生產過程中生物胺的產生不僅來自細菌，某些真菌，如檸檬形克勒克氏酵母（Kloeckera apiculata）、美極梅奇酵母菌（Metschnikowia pulcherrima）和釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae），同樣具有生物胺轉化能力[26]。

圖6 黃酒釀造過程中生物胺含量與微生物群落結構相關性Fig.6 Correlation between biogenic amine content and change of microbial community structure during the process

3 結論

本研究采用Illumina Miseq測序平臺對黃酒麥曲及其發(fā)酵過程中的細菌群落結構進行系統(tǒng)分析，同時對不同階段生物胺含量采用高效液相色譜法進行精準測定。結果表明，黃酒小曲、麥曲及發(fā)酵過程中的發(fā)酵液中細菌具有豐富的物種多樣性，且發(fā)酵過程中細菌多樣性整體呈減少趨勢。麥曲中最主要優(yōu)勢菌為芽孢桿菌屬、糖多孢菌屬，發(fā)酵過程中的微生物組成與麥曲有一定的相關性，投料后細菌群落結構變化較大。在屬水平上，優(yōu)勢菌包括糖多胞菌屬、芽孢桿菌屬、葡萄球菌屬、乳桿菌屬、明串珠菌屬、乳球菌屬和腸桿菌屬，且不同類群細菌的變化情況呈現(xiàn)多樣性。其中，乳桿菌屬、明串珠菌屬、魏斯氏屬、鞘氨醇桿菌屬、片球菌屬以及腸菌科細菌豐度的增加與生物胺的產生具有顯著相關性。通過菌群結構與生物胺含量變化的相關性分析，為紹興黃酒產品質量控制提供科學依據(jù)。

[1]XU Y,WANG D,FAN W L.Traditional chinese biotechnology[J].Adv Biochem Eng Biotechnol,2010,122:189-233

[2]張鳳杰,薛潔,王異靜.黃酒中生物胺的形成及其影響因素[J].食品與發(fā)酵工業(yè),2013,39(2):62-65

[3]劉蕓雅,毛健,孟祥勇,等.紹興黃酒麥曲及發(fā)酵過程中細菌群落結構分析[J].中國食品學報,2017,17(1):201-208

[4]SANTOS MHS.Biogenic Amines:Their Importance in Foods[J].International Journal of Food Microbiology,1996,29(2):213-231

[5]BUSTO O,MIRACLE M,GUASCH J,et al.Determination of biogenic amines in wines by high-performance liquid chromatography with on-column fluorescence derivatization[J].J Chrornatogr A,1997,757(1/2):311-318

[6]毛青鐘,魯瑞剛,陳寶良,等.黃酒發(fā)酵醪抑制霉菌生長的初步探討[J].中國釀造,2006,25(9):56-59

[7]毛青鐘,俞關松.黃酒浸米漿水中優(yōu)勢細菌的不同對發(fā)酵的影響[J].釀酒,2010,37(5):69-73

[8]XIA X L,ZHANG Q W,ZHANG B.Insights into the biogenic amine metabolic landscape during industrial semidry Chinese rice wine fermentation[J].J Agric Food Chem,2016,64:7385-7393

[9]汪建國,汪琦.黃酒醪酸敗原因分析及預防措施[J].中國釀造,2005,24(8):36-39

[10]汪建國.黃酒中色、香、味、體的構成和來源淺析[J].中國釀造,2004,23(4):6-10,18

[11]EDGAR R C.UPARSE:highly accurate OTU sequences from microbial amplicon reads[J].Nat Methods,2013,10:996-988

[12]WANG Q,GARRITY G M,TIEDJE J M.Naive Bayesian Classifer for Rapid Assignment of rRNA Sequences into the New Bacterial Taxonomy[J].Appl Envir Microbiology,2007,73(16):5261-5267

[13]張中華,管政兵,梁小剛,等.PCR-DGGE分析紹興黃酒麥曲中細菌群落方法的建立[J].食品工業(yè)科技,2012,33(14):206-209

[14]陳亮亮.黃酒麥曲制曲工藝的優(yōu)化研究[D].無錫:江南大學,2013

[15]吳徐建.醬香型白酒固態(tài)發(fā)酵過程中酵母與細菌群落結構變化規(guī)律的研究[D].無錫:江南大學,2013

[16]張中華.紹興黃酒麥曲中微生物群落結構的研究[D].無錫:江南大學,2012

[17]SHALABY A R.Significance of biogenic amines to food safety and human health[J].Food Res Int,1996,29(7):675-690

[18]XIANG W L,LI K,LIU S,et al.Microbial succession in the traditional Chinese Luzhou-flavor liquor fermentation process as evaluated by SSU rRNA profiles[J].World J Microb Biot,2013,29(3):559-567

[19]陳林.醬香型白酒發(fā)酵過程中微生物群落結構分析[D].北京:北京林業(yè)大學,2012

[20]張鳳杰,薛潔,王異靜,等.黃酒中生物胺的形成及其影響因素[J].食品與發(fā)酵工業(yè),2013,39(2):61-68

[21]謝廣發(fā),曹鈺,程斐,等.應用生物酸化浸米技術生產黃酒[J].食品與生物技術學報,2014,33(2):217-223

[22]俞劍燊,張鳳杰,王德良,等.釀酒工藝對黃酒中生物胺的影響[J].中國釀造,2015,34(4):123-127

[23]HONG X T,CHEN J,LIU L,et al.Metagenomic sequencing reveals the relationship between microbiota composition and quality of Chinese Rice Wine[J].Sci Rep,2016,6:1-11

[24]DEL RIO B,LINARES D,Ladero V,et al.Putrescine biosynthesis in Lactococcus lactis is transcriptionally activated at acidic pH and counteracts acidification of the cytosol[J].Int J Food Microbiol,2016,236:83-89

[25]DEL RIO B,REDRUELLO B,LADERO V,et al.Putrescine production by Lactococcus lactis subsp.cremoris CECT 8666 is reduced by NaCl via a decrease in bacterial growth and the repression of the genes involved in putrescine production[J].Int J Food Microbiol,2016,232:1-6

[26]CARUSO M,C FIORE M,CONTURSI G,et al.Formation of biogenic amines as criteria for the selection of wine yeasts[J].WORLD J MICROB BIOT,2002,18(2):159-163