羅 莉，鞏毓剛，李 靈，

(1.西南醫(yī)科大學臨床醫(yī)學院，四川 瀘州 646000；2.四川省醫(yī)學科學院·四川省人民醫(yī)院皮膚病性病研究所，四川 成都 610072)

斑禿(alopecia areata，AA)是由一系列細胞和細胞因子介導(dǎo)的慢性炎性免疫性疾病[1，2]，組織病理以生長期毛囊周圍CD4+、CD8+T細胞浸潤為特征[3]。本病致病機理至今未明，大部分學者認為與毛囊免疫豁免狀態(tài)解除有關(guān)[4]。T細胞是AA發(fā)病的關(guān)鍵，CD4+T細胞通過分泌細胞因子，吸引其他炎癥細胞聚集、局部炎癥破壞和導(dǎo)致毛囊退行性變，而CD8+T 細胞可直接攻擊和破壞毛囊，導(dǎo)致毛囊退行性改變[5，6]。CD4+T細胞通常分為Th1、Th2、Th17、Treg細胞。Th1細胞分泌干擾素-γ(IFN-γ)、白介素2(IL-2)和白介素12(IL-12)，主要介導(dǎo)細胞免疫；Th2細胞分泌白介素4(IL-4)、白介素5(IL-5)、白介素10(IL-10)和腫瘤壞死因子-α(TNF-α)，主要介導(dǎo)體液免疫。Th1和Th2型細胞因子的平衡在AA發(fā)病中舉足輕重[7]，代表性細胞因子的相對變化已被用作反映Th1型和Th2型免疫應(yīng)答之間平衡的指標。局部或循環(huán)中的Thl/Th2細胞因子表達狀態(tài)是調(diào)控CD4+T細胞分化的關(guān)鍵因素[8]，探討AA發(fā)病時局部和全身存在的細胞因子水平將有助于了解AA發(fā)病機制。目前國內(nèi)對AA細胞因子的檢測多采用外周血，頭皮皮損處細胞因子表達水平的研究少見。本研究我們通過檢測重型AA患者外周血及頭皮細胞因子的表達水平，并與正常對照組比較，從而將外周血和局部皮損結(jié)合起來，以進一步探討細胞因子在AA發(fā)病中的作用。

1 資料與方法

1.1一般資料2015年12月至2017年10月就診于四川省人民醫(yī)院的33例重型AA患者，男18例，女15例，年齡9.3～61.7歲[(25.1±12.3)歲]，發(fā)病年齡5.4～60.2歲[(19.7±14.5)]歲，病程0.4～26年[(5.9±3.5)年]。納入標準：脫發(fā)面積大于頭皮面積的1/3或病程超過1年仍無好轉(zhuǎn)的AA[9]。AA的診斷參照臨床皮膚病學的診斷標準[10]。排除標準：①1月內(nèi)使用系統(tǒng)性糖皮質(zhì)激素、免疫抑制劑及免疫調(diào)節(jié)劑治療；②1周內(nèi)有外用藥物史；③1周內(nèi)有吸煙、飲酒；④脫發(fā)區(qū)存在明顯炎癥反應(yīng)；⑤先天性脫發(fā)、靜止期脫發(fā)、藥物性脫發(fā)及拔毛癖、頭癬、二期梅毒、系統(tǒng)性紅斑狼瘡、甲亢等疾病所致脫發(fā)；⑥伴有炎癥性疾病及嚴重內(nèi)科疾??；⑦孕婦、哺乳期婦女。征集健康體檢者20例作為正常對照組，年齡及性別與重型AA組差異無統(tǒng)計學意義。本研究通過四川省人民醫(yī)院倫理委員會批準，實驗前均簽署知情同意書。

1.2酶聯(lián)免疫吸附試驗法收集33例重型AA患者及20例健康體檢者外周血標本10 ml，采用雙位點夾心酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)檢測外周血血清IFN-γ、IL-2、IL-4、IL-5、IL-10及IL-12表達水平(美國R&D公司試劑盒)，具體實驗步驟按照試劑盒說明書操作，測定樣品中細胞因子的水平。

1.3熒光半定量RT-PCR采用熒光半定量RT-PCR的方法檢測33例重型AA患者頭皮皮損及20例健康體檢者頭皮正常組織處IFN-γ、IL-2、IL-4、IL-5、IL-10、IL-12 mRNA表達水平。重型AA組頭皮標本取自活動性皮損邊緣約1 cm，包括皮損及邊緣的正常毛發(fā)頭皮，正常對照組頭皮標本來自于外科頭皮手術(shù)如皮膚良性腫瘤或色素痣切除術(shù)邊緣正常頭皮組織。本實驗采用SYBR Green I實時定量RT-PCR技術(shù)，使用儀器為Bio-Rad iQ5，采用管家基因(β-actin)作為內(nèi)參照基因測定目的基因相對表達量。使用2-△△Ct方法計算結(jié)果，ΔCt為重型AA患者及正常對照者樣本目的基因Ct值減去各自標本內(nèi)參照β-actin的Ct值，ΔΔCt為重型AA患者ΔCt平均值與正常對照者ΔCt平均值的差值。

1.4統(tǒng)計學方法數(shù)據(jù)輸入SPSS 17.0軟件，計量資料先進行正態(tài)性檢測，符合正態(tài)分布采用t檢驗，不符合正態(tài)分布采用非參數(shù)秩和檢驗。P< 0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1外周血中細胞因子的表達水平重型AA組血清IFN-γ和IL-12的表達水平顯著高于正常對照組，差異有統(tǒng)計學意義(P< 0.01)，IL-5的表達水平顯著低于正常對照組，差異有統(tǒng)計學意義(P< 0.01)，IL-2、IL-4、IL-10表達水平較正常對照組比較，差異無統(tǒng)計學意義(P> 0.05)。見表1。

表1 比較重型AA組及正常對照組血清中細胞因子的表達水平 (ng/ml)

2.2頭皮處細胞因子的表達水平重型AA組IFN-γ、IL-12 mRNA表達水平顯著高于正常對照組，IL-4 mRNA表達水平顯著低于正常對照組，差異有統(tǒng)計學意義(P< 0.01)，IL-2 、IL-5、IL-10 mRNA表達水平較正常對照組比較，差異無統(tǒng)計學意義(P> 0.05)。見表2。

3 討論

AA是一種常見的脫發(fā)性疾病，在皮膚病中的發(fā)生率為0.7%～3%[11]。目前尚缺乏特效的治療，可能與其確切的發(fā)病機制仍不明確有關(guān)。近年來越來越多學者致力于探索AA的發(fā)病機制，大部分研究認為本病的發(fā)生可能與自身免疫(生長期特異性毛囊抗原、毛囊黑素細胞抗原)相關(guān)，且多種細胞因子參與了AA的發(fā)病過程[12，13]。

表2 比較重型AA組及正常對照組頭皮細胞因子的表達水平

目前外周血細胞因子的報道相對多見，Sadeghi等[14]檢測了20例AA患者外周血細胞因子的表達水平，與正常對照組比較，T-bet和IFN-γmRNA的表達顯著上調(diào)，GATA-3和IL-4 mRNA的表達顯著下調(diào)，T-bet和IFN-γ、GATA-3和IL-4顯著正相關(guān)，證實AA患者外周血中Th1/Th2平衡狀態(tài)發(fā)生了漂移。王博等[15]對AA患者的Th1/Th2/TH17型細胞因子的表達水平進行檢測，結(jié)果表明AA患者血清中IFN-γ表達顯著高于正常對照組，且在重型、活動期、病程長患者中最高，提示重型AA患者血清中Th1型細胞因子占優(yōu)勢，且Th2細胞對Th1細胞有一定的拮抗作用。本研究對血清中多種細胞因子進行檢測，發(fā)現(xiàn)重型AA患者外周血IFN-γ、IL-12表達顯著上調(diào)，IL-5表達顯著下調(diào)，提示重型AA患者體內(nèi)中確實存在Th1/Th2免疫失衡，即Th1亢進而Th2抑制。

目前AA患者局部皮損免疫狀況的研究尚存在爭議。在Zhang等[16]的研究中，與正常對照組相比，AA患者頭皮皮損處真皮淺層的TNF-α mRNA表達升高，IFN-γmRNA表達降低，真皮深層的IL-2、IL-8、IL-5、IL-10 mRNA表達升高，表明AA患者皮損真皮處Th1、Th2細胞因子均呈高表達狀態(tài)，他們認為IFN-γ表達低于或等于正常對照組，可能與頭皮皮膚部分耐受相關(guān)。蔡澤明等[17]的研究則表明，與正常對照組相比，AA患者頭皮皮損淺層IFN-γ、IL-12 mRNA表達升高，IL-10 mRNA表達降低，皮損深層IL-12 mRNA表達顯著升高，結(jié)果表明AA患者局部皮損處Thl類因子升高，Th2類因子降低，這種變化可能為淺層炎癥所觸發(fā)。我們使用RT-PCR方法檢測了重型AA患者局部頭皮Th1/Th2型細胞因子的表達水平，結(jié)果亦表明重型AA患者頭皮皮損處IFN-γ、IL-12 mRNA的表達升高，IL-4 mRNA表達降低，證實了重型AA患者局部頭皮存在Th1和Th2的免疫失衡，且局部頭皮與外周血的改變一致。

Th1、Th2細胞由Th0細胞分化而來，細胞因子的種類和細胞因子之間的平衡是調(diào)控Th0細胞分化的主要影響因素，如IL-12、IFN-γ促進Th0向分化Th1細胞，Th2的細胞分化依賴IL-4，轉(zhuǎn)錄因子T-bet和GATA-3是調(diào)控Th0分化、Th1/Th2轉(zhuǎn)換的關(guān)鍵因子[18]。機體處于正常狀態(tài)時，Th1/Th2細胞因子處于平衡狀態(tài)，Th1細胞和Th2細胞相互抑制、相互轉(zhuǎn)化，以維持細胞免疫及體液免疫的平衡。當受到抗原、病毒刺激時，Th1/Th2細胞的動態(tài)平衡被破壞，機體就可能發(fā)生Th1優(yōu)勢漂移介導(dǎo)AA免疫應(yīng)答[19]。在毛發(fā)生長初期，TGF-β1、ACTH、α-MSH、IGF-1具有強烈免疫抑制作用，毛囊MHCⅠ類分子僅少量表達，毛囊自身抗原不會被CD8+T細胞識別，毛囊處于免疫豁免狀態(tài)[5]。既往研究認為升高的Th1類細胞因子如IFN-γ、IL-12可通過誘導(dǎo)附近毛囊HLA-A、B、C，HLA-DR，MHCⅠ，MHCⅡ類分子和粘附因子ICAM-1表達升高，導(dǎo)致毛囊的免疫赦免喪失，局部自身抗原暴露，被抗原提呈細胞提呈引起CD4+及CD8+T淋巴細胞活化，在Th1細胞因子作用下進一步刺激Th1細胞因子分泌并激活NK細胞、CD8+T淋巴細胞發(fā)揮細胞毒作用，殺傷靶細胞，導(dǎo)致AA的發(fā)病[20，21]。IL-4及IL-5同為Th2型細胞因子，二者具有協(xié)同作用。IL-4被認為是Th2分化的關(guān)鍵細胞因子，也是IgE合成過程中最重要因子，可抑制Thl型細胞的免疫應(yīng)答，抑制IFN-γmRNA的轉(zhuǎn)錄[22]。IL-5能促進T細胞和嗜酸性粒細胞的增值、活化及分化，主要介導(dǎo)Th2細胞反應(yīng)，在哮喘和變應(yīng)性鼻炎等變態(tài)反應(yīng)性疾病中發(fā)揮重要作用。目前Il-5關(guān)于AA的報道相對少見。在我們的實驗中分別檢測到了血清中IL-4和頭皮處IL-5 的下調(diào)，提示重型AA患者Th2狀態(tài)受到抑制，Th2功能的降低導(dǎo)致對Th1抑制水平的降低可能亦是AA發(fā)生的原因。

本研究檢測了重型AA患者和正常對照組外周血清和局部頭皮皮損處細胞因子的表達水平，進一步探討了Th1和Th2細胞因子在重型AA發(fā)病過程中的作用，細胞因子無論是在蛋白水平的外周血還是在分子水平的局部頭皮皮損，二者的結(jié)果均表現(xiàn)為Th1占優(yōu)勢而Th2抑制。

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