張曉彤，鞏毓剛，李 靈

(1.西南醫(yī)科大學(xué)，四川 瀘州 646000；2.四川省醫(yī)學(xué)科學(xué)院·四川省人民醫(yī)院·皮膚病性病研究所，四川 成都 610072)

黑色素瘤是一種來源于皮膚黏膜和色素膜的惡性腫瘤。來自美國國家癌癥研究所的數(shù)據(jù)[1]顯示，黑色素瘤的發(fā)病率在所有腫瘤中增長最快。脂氧素是花生四烯酸經(jīng)過15-脂氧化酶、12-脂氧化酶、5-脂氧化酶作用后生成的產(chǎn)物。近年來，越來越多的資料表明脂氧素(Lipoxins，LXs)作為一類脂類介質(zhì)具有廣泛的抗炎作用[2～5]。炎癥為一種使機(jī)體避開有害刺激的機(jī)制，可由多種因素誘發(fā)，但持續(xù)的炎癥使機(jī)體通過分泌相關(guān)的炎性細(xì)胞因子，誘導(dǎo)基因突變、抑制細(xì)胞凋亡或刺激血管生成、細(xì)胞增殖，最后導(dǎo)致腫瘤發(fā)生[6，7]。我們的前期研究發(fā)現(xiàn)LXA4抗腫瘤效應(yīng)的機(jī)制，可能是通過抑制炎癥發(fā)展[8]和抑制腫瘤血管生成來抑制腫瘤的生長[9]。但其免疫機(jī)制尚不清晰，相關(guān)研究也較少。腫瘤免疫中，T細(xì)胞對腫瘤可直接殺傷，對控制腫瘤的發(fā)生發(fā)展起到了關(guān)鍵的作用。本研究旨在通過研究LXA4對外周血與脾臟中T細(xì)胞免疫的影響，來闡明其抑制腫瘤發(fā)生發(fā)展的免疫學(xué)機(jī)制，報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)動物造模實(shí)驗(yàn)時(shí)間為2017年10月19～27日，健康純種C57bl/6鼠12只，雌性，SPF級，7周，體重(20±2) g，由四川省醫(yī)學(xué)科學(xué)院四川省人民醫(yī)院實(shí)驗(yàn)動物研究所提供，并在該研究所飼養(yǎng)。飼養(yǎng)環(huán)境溫度為22～25 ℃，濕度為(45%～50%)，光照周期為12 h光照/12 h黑暗，自由飲水/取食。小鼠每3天進(jìn)行一次飼料、飲用水及墊料的更換，其中，飼養(yǎng)小鼠所需的飼料、飲用水以及墊料均須經(jīng)高壓滅菌處理。小鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)一周后進(jìn)行實(shí)驗(yàn)處理。將B16通過皮下接種至正常小鼠腹部，構(gòu)建惡性黑色素瘤動物模型，造模成功后，通過抽簽法分為兩組各6只。5S，6R-7- 三羥甲基庚酸(BML-111)組腹腔注射LXA4類似物BML-111(因脂氧素的體外研究試劑LXA4半衰期太短，在體內(nèi)極易被快速代謝，因此選用BML-111代替)[9](1 mg/kg)進(jìn)行治療；磷酸緩沖鹽溶液(PBS)組腹腔注射PBS緩沖液(1 mg/kg)作為PBS組對照，兩組均每兩天治療一次，共治療5次。每天觀察并記錄腫瘤生長情況。

1.2檢測方法①測量小鼠腫瘤體積及重量。方法：每隔3天進(jìn)行稱重，并用游標(biāo)卡尺測量每只小鼠的腫瘤長徑、短徑，計(jì)算腫瘤體積，根據(jù)腫瘤體積繪制小鼠腫瘤的生長曲線：腫瘤體積=腫瘤長徑×(腫瘤短徑)2/2(mm3)實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)，頸椎脫臼處死小鼠，完整取出腫瘤塊，稱量腫瘤瘤重。剝?nèi)∧[瘤與脾臟，抽取小鼠外周血，稱重并計(jì)算小鼠腫瘤生長抑制率(tumor growth inhibition rate，IR)=1-干預(yù)組平均瘤重/對照組平均瘤重×100%。②測量小鼠脾臟及外周血淋巴細(xì)胞所占比。方法：①收集細(xì)胞：棄去上清，再加入1 ml 0.25%胰酶消化細(xì)胞，待細(xì)胞變圓且有部分細(xì)胞懸浮，即加入PBS終止消化。用移液槍輕輕吹打細(xì)胞，使細(xì)胞懸浮。細(xì)胞懸液轉(zhuǎn)入離心管中，1500 rpm離心5 min收集細(xì)胞。②PBS洗滌細(xì)胞：加入3 ml 4 ℃預(yù)冷的PBS完全重懸細(xì)胞，1500 rpm離心5 min，棄上清。沉淀震蕩混勻。③加一抗：加入100 μl一抗抗體稀釋液，室溫孵育60 min。④加二抗：孵育完后用預(yù)冷的PBS洗滌1次，1500 rpm離心5 min，棄上清。加入100 μl二抗抗體稀釋液，避光室溫孵育30 min。⑤PBS洗滌細(xì)胞：加入500 μl 4 ℃預(yù)冷的PBS完全重懸細(xì)胞，1500 rpm離心5 min，棄上清。沉淀震蕩混勻，用200 μl的4 ℃預(yù)冷的PBS重懸細(xì)胞。⑥上機(jī)檢測：根據(jù)二抗抗體上熒光染料選擇適合的通道進(jìn)行上機(jī)檢測，用FlowJo軟件分析細(xì)胞陽性率及陽性區(qū)平均熒光強(qiáng)度。

1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)方法應(yīng)用SPSS 10.0統(tǒng)計(jì)分析軟件對實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析。計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，組間比較采用t檢驗(yàn)，計(jì)數(shù)資料以百分率表示。P< 0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1小鼠腫瘤生長情況實(shí)驗(yàn)終止時(shí)，BML-111組小鼠腫瘤體積(2069.47±761.17)mm3明顯小于PBS對照組小鼠腫瘤體積(4423.24±590.06)mm3，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P< 0.01)。BML-111組小鼠的瘤重(1.88±0.38) g明顯小于PBS組(2.90±0.22) g，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P< 0.01)，腫瘤生長抑制率為35.17%。

2.2小鼠脾臟與外周血中淋巴細(xì)胞所占比實(shí)驗(yàn)終止時(shí)，兩組小鼠外周血液和脾臟的淋巴細(xì)胞比例比較(圖1)，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P> 0.05)。見表1。

圖1 實(shí)驗(yàn)終止時(shí)PBS組(左列)與BML-111組(右列)小鼠外周血淋巴細(xì)胞占比

組別CD4+T細(xì)胞CD8+T細(xì)胞BML-111組13.07±4.5313.69±4.53PBS組15.60±2.6714.85±2.77

3 討論

MM是起源于胚胎期神經(jīng)嵴的惡性腫瘤，其惡性度極高，預(yù)后較差?？砂l(fā)生于皮膚、眼球、消化道、生殖系統(tǒng)等部位，但其中以皮膚惡性黑色素瘤最常見[10]。脂氧素是一類花生四烯酸的代表產(chǎn)物，研究表明它具有強(qiáng)有力的抗炎和促進(jìn)炎癥消退的作用，可以及時(shí)消退炎癥，阻止炎癥轉(zhuǎn)化為慢性炎癥[11，12]，它是一個(gè)維持內(nèi)環(huán)境穩(wěn)態(tài)平衡的負(fù)性調(diào)控因子。LXA4 作為一種廣泛的內(nèi)源性抗炎因子在腫瘤中發(fā)揮著強(qiáng)大的抗炎作用，并發(fā)現(xiàn)其與腫瘤進(jìn)程密切相關(guān)[13]。除了對天然免疫細(xì)胞以及在炎癥反應(yīng)中有著重要的作用外，LXA4與抗感染的免疫應(yīng)答調(diào)節(jié)也有著密切的關(guān)系。有研究表明LXA4的合成在對弓形蟲感染的免疫應(yīng)答調(diào)控中起到了重要的作用[14，15]?；谝陨系膶?shí)驗(yàn)結(jié)果，Aliberti等進(jìn)一步利用活的弓形蟲對LXA4的合成進(jìn)行了研究[15]。這些結(jié)果都說明了LXA4對免疫應(yīng)答的調(diào)控有著重要的作用。

免疫系統(tǒng)與腫瘤發(fā)生發(fā)展的關(guān)系在過去幾十年中已經(jīng)得到了很好的研究。免疫系統(tǒng)在腫瘤的預(yù)防中發(fā)揮著非常重要的作用[16]。腫瘤之所以發(fā)生發(fā)展，其本質(zhì)上是一個(gè)免疫逃逸的過程。

在本次研究中，我們將B16通過腹部皮下接種，成功構(gòu)建MM動物模型，成瘤率100%。將小鼠隨機(jī)分為兩組進(jìn)行干預(yù)治療。BML-111組小鼠腫瘤體積、瘤重均明顯小于PBS組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P< 0.01)。綜合給藥結(jié)束后小鼠腫瘤瘤重、腫瘤體積的實(shí)驗(yàn)結(jié)果，表明脂氧素在小鼠體內(nèi)可顯著抑制MM的生長。此時(shí)我們使用流式實(shí)驗(yàn)測得小鼠脾臟、外周血液中淋巴細(xì)胞所占比例，結(jié)果提示，LXA4對CD4+T細(xì)胞與CD8+T細(xì)胞沒有影響，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P< 0.05)。查閱大量之前的文獻(xiàn)，并沒有報(bào)道LXA4對T細(xì)胞的作用，而我們的實(shí)驗(yàn)結(jié)果同樣說明了，LXA4可能并不是通過影響外周血和脾臟中T細(xì)胞的增殖和功能，從而產(chǎn)生抑制MM的作用。最新的研究表明，人和小鼠的B淋巴細(xì)胞上有LXA4受體ALX/FPR2的表達(dá)，LXA4可以抑制B細(xì)胞抗體的產(chǎn)生及記憶B細(xì)胞的二次應(yīng)答[17]。我們推測，也許是T細(xì)胞上面的LXA4受體數(shù)量或功能遠(yuǎn)低于B細(xì)胞上面的LXA4受體數(shù)量及功能，或者LXA4不通過影響外周血和脾臟中T細(xì)胞，而作用于引流測淋巴結(jié)T細(xì)胞，或者LXA4是主要通過B細(xì)胞免疫或者B細(xì)胞與T細(xì)胞聯(lián)合免疫，而發(fā)揮抗MM的作用。另一方面以往研究顯示LXA4在其他腫瘤通過抑制調(diào)節(jié)性B淋巴細(xì)胞，下調(diào)調(diào)節(jié)性T淋巴細(xì)胞，增強(qiáng)殺傷性T淋巴細(xì)胞功能而達(dá)到抗腫瘤作用，LXA4在抗MM作用免疫作用機(jī)制是否存在差異或者有類似免疫作用機(jī)制還有待進(jìn)一步研究。本實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步觀察了LXA4在小鼠體內(nèi)可顯著抑制MM的生長；初步觀察了LXA4在抗MM中T淋巴細(xì)胞免疫作用影響，為后續(xù)進(jìn)一步研究LXA4抗MMMM的免疫機(jī)制奠定了基礎(chǔ)。

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