劉 紅，邱建平，何 琴，曾明輝

(四川省邛崍市醫(yī)療中心醫(yī)院藥學(xué)部，四川 成都 611530)

急性咽炎是咽部黏膜及黏膜下組織的急性炎癥，多累及咽部淋巴組織，是耳鼻咽喉科常見病及多發(fā)病。急性咽炎的主要臨床表現(xiàn)為咽部干燥、灼熱、疼痛，嚴(yán)重者可出現(xiàn)發(fā)熱、頭痛、四肢酸痛等全身癥狀，治療不得當(dāng)甚至可引起鼻竇炎、中耳炎、支氣管炎等其他急性炎癥，嚴(yán)重影響人們的正常生活和工作[1]。白花龍膽為常用藏藥藥材，始載于8世紀(jì)中期的《月王藥診》[2]，歷部藏醫(yī)學(xué)典籍及本草均有記載。不同的藏藥專著對(duì)白花龍膽的來源存在不同認(rèn)識(shí)[3～6]。經(jīng)全國(guó)第四次中藥資源普查對(duì)該品種進(jìn)行的考證，確定其基原植物應(yīng)為大花龍膽Gentiana szechenyii、岷縣龍膽G.purdomii、高山龍膽G.algida，主流藥材為大花龍膽Gentiana szechenyii[7]。該藥是現(xiàn)行部頒標(biāo)準(zhǔn)藏藥制劑三味龍膽花丸、十五味龍膽花丸等制劑的君藥[8]。白花龍膽提取物性寒，味苦，寒。清肝膽，除濕熱，健胃。用于流行性腦脊髓膜炎、目赤、咽喉痛、肺熱咳嗽、胃脘痛脹、淋證、瀉肝膽實(shí)火及清濕熱等癥[9]。之前有文獻(xiàn)報(bào)道過用龍膽花治療慢性咽炎效果良好，但沒有對(duì)其機(jī)理深入研究。本實(shí)驗(yàn)參考相關(guān)文獻(xiàn)建立實(shí)驗(yàn)方案[10～13]，通過血液生化指標(biāo)、組織病理檢測(cè)等方法，進(jìn)一步探討研究其對(duì)急性咽喉炎的作用。

1 對(duì)象與方法

1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物健康SD大鼠，清潔級(jí)，雄性，體質(zhì)量(180～220)g，共50只，由四川省醫(yī)學(xué)科學(xué)院·四川省人民醫(yī)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物研究所提供，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào)：SCXK(川)2013-015，生產(chǎn)合格證號(hào)：0006303。所有大鼠均正常飼養(yǎng)，自由飲水、進(jìn)食，飼養(yǎng)溫度24～26 ℃，相對(duì)濕度40%～60%。用隨機(jī)數(shù)字表將SD大鼠分為空白組、模型組、陽性對(duì)照組、白花龍膽提取物高劑量組、白花龍膽提取物低劑量組各10只。

1.2儀器與試藥半自動(dòng)酶標(biāo)儀ST-360(上海科華實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)有限公司)、全自動(dòng)血球分析儀BC-6800(邁瑞醫(yī)療國(guó)際有限公司)、切片機(jī)(徠卡-2015，德國(guó))；TSJ-Q型全自動(dòng)封閉式組織脫水機(jī)、BMJ-Ⅲ型包埋機(jī)、PHY-Ⅲ型病理組織漂烘儀(均為常州市中威電子醫(yī)療儀器有限公司產(chǎn)品)；Motic BA400病理攝像系統(tǒng)(麥克奧迪，德國(guó))。白花龍膽提取物(相當(dāng)于0.6 g/ml生藥，批號(hào)：20151108，來源于四川省人民醫(yī)院制劑室)；陽性對(duì)照品：蒲地藍(lán)消炎片(0.6 g/片，批號(hào)：20150306，廣東心寶制藥有限公司)；陰性對(duì)照品：蒸餾水(自制)；氨水(AR級(jí)，批號(hào)：YBZ01152010，成都市科龍化工試劑廠)。

1.3方法

1.3.1急性咽炎動(dòng)物造模 將大鼠口腔擴(kuò)開，除空白組喉頭噴霧生理鹽水外，其余各組用喉頭噴霧器噴25%氨水，每天兩次，每次3掀，共造模3天。操作中確保無液滴流入氣管。

1.3.2給藥方法 空白組與模型組給予蒸餾水，陽性對(duì)照組給予蒲地藍(lán)消炎片0.75 g/(kg·d)，白花龍膽提取物高劑量組給予白花龍膽提取物2 g/(kg·d)，白花龍膽提取物低劑量組給予白花龍膽提取物1 g/(kg·d)。

1.4觀察指標(biāo)

1.4.1大鼠一般狀態(tài)觀察 觀察記錄大鼠造模3天和給藥3天時(shí)大鼠的體重，并全程觀察其飲食、活動(dòng)等情況。

1.4.2大鼠血清制備及測(cè)定 各組大鼠于末次給藥后24 h，取其腹主動(dòng)脈血2 ml抗凝，用于白細(xì)胞計(jì)數(shù)，剩余血液于4 ℃、3000 r/min離心10 min后分離血清，至-70 ℃冰箱保存?zhèn)溆茫捎妹嘎?lián)免疫吸附法(ELISA)測(cè)定血清中IL-1β、IL-6和TNF-α水平，操作依據(jù)試劑盒說明進(jìn)行。

1.4.3大鼠咽部病理樣本的制備與觀察 各組大鼠于末次給藥后24 h，取其腹主動(dòng)脈血后處死。摘取咽部組織，在10%甲醛溶液中固定，次日將固定后的咽部組織進(jìn)行常規(guī)脫水、石蠟包埋、切片、HE染色后在光學(xué)顯微鏡下觀察咽部黏膜鱗狀上皮、黏膜下結(jié)締組織的增生情況和血管的充/出血情況及炎性細(xì)胞浸潤(rùn)情況?；緹o增生標(biāo)記為(-)，稍有增生標(biāo)記為(+)，增生明顯標(biāo)記為(++)；基本無充/出血標(biāo)記為(-)，有充/出血標(biāo)記為(+)；無炎性細(xì)胞浸潤(rùn)標(biāo)記為(-)，少量炎性細(xì)胞浸潤(rùn)標(biāo)記為(+)，明顯炎性細(xì)胞浸潤(rùn)標(biāo)記為(++)，大量炎性細(xì)胞浸潤(rùn)標(biāo)記為(+++)。

1.5統(tǒng)計(jì)學(xué)方法采用SPSS 18.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析數(shù)據(jù)。計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，符合正態(tài)性分布選擇單因素方差分析，如不符合正態(tài)性分布則用非參數(shù)檢驗(yàn)，P< 0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1大鼠一般狀態(tài)觀察各組造模中，大部分大鼠逐漸出現(xiàn)飲食減少、飲水頻繁及搔抓口部的現(xiàn)象，并在造模的最后一天表現(xiàn)最為明顯。造模第3天末及給藥第3天末各組大鼠體重變化情況見表1。造模第3天末，與空白對(duì)照組相比，氨水造模各組大鼠體重明顯降低。給藥第3天末，各組大鼠體重均有增加，但是增加幅度組間無明顯差異。由于實(shí)驗(yàn)操作原因，造模期間氨水造模各組均有1只大鼠死亡，給藥期間白花龍膽提取物低劑量組有1只大鼠死亡。

表1 各組大鼠造模后和給藥后體重變化情況

#與空白對(duì)照組比較，P< 0.01

2.2各組白細(xì)胞分類與計(jì)數(shù)比較給藥3天后各組大鼠的白細(xì)胞分類與計(jì)數(shù)見表2。與空白對(duì)照組相比，各組中性粒細(xì)胞數(shù)差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；與模型對(duì)照組相比，陽性對(duì)照組、白花龍膽提取物高劑量組和低劑量組淋巴細(xì)胞數(shù)、單核細(xì)胞數(shù)差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。

表2 各組大鼠白細(xì)胞分類與計(jì)數(shù)情況 (109/L)

與空白對(duì)照組比較，#P< 0.05，##P< 0.01

2.3大鼠血清中IL-1β、IL-6和TNF-α含量比較

給藥后，各組大鼠血清中IL-1β、IL-6和TNF-α含量見表3。與模型組相比，白花龍膽提取物高劑量組TNF-α、IL-1β、IL-6水平差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，白花龍膽提取物低劑量組差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。

表3 各組大鼠血清中IL-1β、IL-6和TNF-α情況 (pg/ml)

*與模型對(duì)照組比較，P<0.05

2.4大鼠咽部組織病理檢測(cè)情況給藥后，各組大鼠咽部組織病理切片情況如圖1所示，顯微檢測(cè)情況見表4?？瞻捉M大鼠咽部黏膜鱗狀上皮、黏膜下結(jié)締組織和血管及黏膜下腺均正常，未見炎性細(xì)胞浸潤(rùn)；模型組大鼠咽部黏膜鱗狀上皮、黏膜下結(jié)締組織見明顯增生和充血現(xiàn)象，并伴有大量炎性細(xì)胞浸潤(rùn)；陽性對(duì)照組和白花龍膽提取物高劑量組大鼠咽部黏膜鱗狀上皮、黏膜下結(jié)締組織稍有增生，無明顯充血，炎性細(xì)胞浸潤(rùn)明顯減少；白花龍膽提取物低劑量組大鼠咽部黏膜鱗狀上皮、黏膜結(jié)締組織增生明顯減輕，無明顯充血，炎性細(xì)胞浸潤(rùn)有所減少。

圖1大鼠咽部組織病理切片(HE染色，放大100倍數(shù)) a.空白對(duì)照組，b.模型對(duì)照組，c.陽性對(duì)照組，d.白花龍膽提取物高劑量組，e.白花龍膽提取物低劑量組

表4 各組大鼠咽部組織病理顯微檢測(cè)情況 (n)

3 討論

本研究采用大鼠急性咽炎動(dòng)物模型，初步揭示了白花龍膽治療急性咽炎的作用機(jī)理。體重變化研究中，各組大鼠在給藥后體重有所增加，可能與緩解了大鼠的炎性癥狀，使其飲食得以恢復(fù)有關(guān)。雖與模型組比較，白花龍膽提取物高劑量組和低劑量組統(tǒng)計(jì)結(jié)果無明顯差異，但從體重增加的直觀結(jié)果來看，白花龍膽提取物對(duì)急性咽炎還是有效的。

白細(xì)胞分類與計(jì)數(shù)分析中，與模型對(duì)照組相比，白花龍膽提取物高劑量組和低劑量組雖然在白細(xì)胞總數(shù)上無明顯差異，但在改變中性粒細(xì)胞、淋巴細(xì)胞和單核細(xì)胞的比例分配上是有區(qū)別的，從另一個(gè)角度解釋了白花龍膽提取物治療急性咽炎的作用機(jī)制。

TNF-α作為活化單核-巨噬細(xì)胞產(chǎn)生的一種重要細(xì)胞因子，在感染性疾病和炎癥方面，能刺激血管內(nèi)皮細(xì)胞分泌黏附分子，刺激單核-巨噬細(xì)胞和其他細(xì)胞分泌趨化性細(xì)胞因子，引起白細(xì)胞在炎癥部位聚集，促進(jìn)炎癥反應(yīng)。正常水平的TNF-α可抑制病毒復(fù)制，保護(hù)機(jī)體細(xì)胞，但當(dāng)機(jī)體發(fā)生炎癥反應(yīng)后，TNF-α水平顯著升高[14]。IL-1β被稱為“前炎性因子”，作為上游炎性因子能介導(dǎo)多種炎性因子表達(dá)上調(diào)，從而影響炎癥反應(yīng)[15]。在大鼠血清中IL-1β、IL-6和TNF-α變化研究中，造模后的模型對(duì)照組都處于異常增高水平，可能反映了局部過度炎癥反應(yīng)。與模型對(duì)照組比較，白花龍膽提取物高劑量組的血清TNF-α、IL-1β、IL-6水平均有顯著差異，其中，血清TNF-α的降低幅度最大，接近于空白對(duì)照組的指標(biāo)。該結(jié)果在一定程度上揭示了白花龍膽提取物治療急性咽炎可能的主要作用機(jī)制。

大鼠咽部組織病理檢測(cè)觀察中，與空白對(duì)照組相比，模型對(duì)照組咽部黏膜鱗狀上皮、黏膜下結(jié)締組織見明顯增生和充血現(xiàn)象，并伴有大量炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，說明氨水造模引起的大鼠咽部組織病理改變是很明顯的，有效模擬了急性咽炎的組織病理改變情況。與模型對(duì)照組比較，白花龍膽提取物高劑量組和低劑量組中黏膜鱗狀上皮、黏膜下結(jié)締組織增生和充血明顯改善，炎性細(xì)胞浸潤(rùn)也得到抑制，且高劑量組效果略優(yōu)于低劑量組，說明白花龍膽提取物對(duì)急性咽炎的治療是有效的，且與給藥劑量有一定相關(guān)性。

從整個(gè)研究結(jié)果來看，白花龍膽提取物對(duì)急性咽喉炎具有一定治療效果，其主要作用機(jī)理與下調(diào)前炎癥細(xì)胞因子，減輕和消除炎癥損傷，抑制炎癥發(fā)展有關(guān)。部分實(shí)驗(yàn)結(jié)果不夠理性可能與藥材品質(zhì)欠佳及白花龍膽提取物抗炎有效成分富集不足有一定關(guān)系，需要后期進(jìn)一步研究確認(rèn)白花龍膽抗炎的有效成分，并建立合理有效白花龍膽藥材質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)。

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