殷 駿 周秀敏

(蘇州大學(xué)附屬第一醫(yī)院，江蘇 蘇州 215000)

乙型肝炎病毒持續(xù)感染是肝癌發(fā)生的重要原因〔1〕。乙型肝炎病毒X蛋白在乙型肝炎病毒持續(xù)感染小鼠模型致癌過程中具有重要生物學(xué)意義〔2〕；環(huán)氧合酶(COX)基因?yàn)榭烧T導(dǎo)表達(dá)基因，其中同工酶COX-2可被多種細(xì)胞外刺激后誘導(dǎo)表達(dá)，與腫瘤發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)〔3〕。本研究擬分析乙型肝炎病毒X蛋白、COX-2在人乙肝相關(guān)性肝細(xì)胞癌發(fā)展與轉(zhuǎn)移中的作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1材料與試劑 53例人肝細(xì)胞癌組織源于2014年5月至2016年6月蘇州大學(xué)附屬第一醫(yī)院手術(shù)切除的病理標(biāo)本，其中乙型肝炎病毒 cccDNA陽性為乙型肝炎相關(guān)性肝癌組織，陰性為非乙型肝炎相關(guān)性肝癌組織。人肝癌細(xì)胞系HepG2、HepG2-X購于中國科學(xué)院。主要試劑：DMEM培養(yǎng)基、胎牛血清購于北京北方同正生物技術(shù)發(fā)展有限公司；乙型肝炎病毒X蛋白鼠抗人單抗、COX-2鼠抗人單抗、CD34鼠抗人單抗購于上海聯(lián)碩生物科技有限公司；NMLV逆轉(zhuǎn)錄酶購于上海經(jīng)科化學(xué)科技有限公司。

1.2免疫組織化學(xué) SP法檢測人肝細(xì)胞癌組織中乙型肝炎病毒X蛋白、COX-2、CD34的表達(dá)水平。鼠抗人乙型肝炎病毒X蛋白、COX-2單抗滴度均為1∶800，鼠抗人CD34單抗滴度為1∶200，磷酸鹽緩沖液(PBS)代替一抗為陰性對(duì)照。半定量積分法判斷陽性表達(dá)，細(xì)胞膜、細(xì)胞質(zhì)、細(xì)胞核被深成棕黃色為陽性，細(xì)胞核藍(lán)色為陰性；Werdner法計(jì)算微血管密度。

1.3細(xì)胞培養(yǎng)和計(jì)數(shù) 人肝癌細(xì)胞系HepG2、HepG2-X細(xì)胞加入含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基中，放入37℃ 5%CO2的培養(yǎng)箱中。每12 h觀察1次，待細(xì)胞貼壁后更換含COX-2抑制劑西樂葆(0、20、40、60 μmol/L)的細(xì)胞培養(yǎng)基，細(xì)胞活性染料臺(tái)盼藍(lán)染色細(xì)胞計(jì)數(shù)，記錄HepG2、HepG2-X細(xì)胞生長情況。

1.4RT-PCR檢測COX-2 mRNA表達(dá) 分別取1×106個(gè)轉(zhuǎn)染X基因的HepG2-X細(xì)胞及空載體轉(zhuǎn)染的對(duì)照HepG2細(xì)胞，使用Trizol試劑盒提取細(xì)胞總RNA，逆轉(zhuǎn)錄為cDNA并進(jìn)行PCR擴(kuò)增，正向引物：5′-AAGTTTACTAACACCCTTTTA-3′，反向引物：5′-TCTAGTAGACGGACTCTATAG-3′；引物設(shè)計(jì)由上海吉然生物科技有限公司完成。反應(yīng)條件：70℃ 20 min，94℃ 60 s，55℃ 45 s，72℃ 60 s，共30個(gè)循環(huán)。擴(kuò)增產(chǎn)物行電泳檢測，分析灰度值，與β-actin的比值為相對(duì)表達(dá)量。

1.5Western印跡檢測COX-2蛋白表達(dá) 細(xì)胞覆蓋面積占培養(yǎng)皿75%～80%時(shí)用PBS洗滌細(xì)胞，冰上收集細(xì)胞后用RIPA裂解，4℃ 10 000 r/min離心20 min，收集上清液蛋白，常規(guī)行蛋白定性、定量、電泳。十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺(SDS-PAGE)分離蛋白后濕法轉(zhuǎn)膜，室溫下用10%脫脂奶粉封閉1 h，滴加COX-2單抗和β-actin，4℃孵育過夜；滴加辣根過氧化酶(HRP)標(biāo)記的羊抗鼠二抗，室溫下孵育4 h，洗膜后ECL顯色。

1.6酶聯(lián)免疫吸附(ELISA)法檢測細(xì)胞上清液中PGE2 將1×106個(gè)細(xì)胞平鋪到24孔板中，培養(yǎng)至貼壁75%～80%融合時(shí)收集細(xì)胞培養(yǎng)上清液，胰酶消化培養(yǎng)板中的細(xì)胞，顯微鏡下計(jì)數(shù)，作為PGE2水平參照。使用ELISA試劑盒，檢測樣品均設(shè)置3個(gè)復(fù)孔，進(jìn)行PGE2水平測定。

1.7統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用SPSS20.0 軟件行t檢驗(yàn)、χ2檢驗(yàn)及Spearman相關(guān)分析。

2 結(jié) 果

2.1人肝細(xì)胞癌組織中乙型肝炎病毒X蛋白、COX-2的表達(dá) 42例乙型肝炎相關(guān)性人肝細(xì)胞癌組織中乙型肝炎病毒X蛋白陽性表達(dá)率為76.19%(32/42)，以細(xì)胞質(zhì)陽性表達(dá)為主且呈棕黃色。COX-2陽性表達(dá)率為83.33%(35/42)，以細(xì)胞質(zhì)與細(xì)胞膜陽性表達(dá)為主且呈棕黃色。32例乙型肝炎病毒X蛋白陽性表達(dá)組織中COX-2陽性率為87.50%(28/32)，明顯高于陰性表達(dá)組織中的30.00%(3/10)和非乙型肝炎相關(guān)性肝癌組織中的45.45%(5/11)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)，見圖1。

2.2微血管密度計(jì)數(shù) CD34抗體多陽性表達(dá)于毛細(xì)血管內(nèi)皮細(xì)胞核，呈棕黃色表達(dá)，見圖2。

圖1 乙型肝炎病毒X蛋白、COX-2在人肝細(xì)胞癌組織中的表達(dá)(×200)

圖2 CD34在早期和進(jìn)展期人肝細(xì)胞癌組織中的表達(dá)(×200)

32例乙型肝炎病毒X蛋白陽性表達(dá)組織中微血管密度平均計(jì)數(shù)為(51.56±9.14)；其中11例早期癌癥組織中微血管密度為(43.18±10.62)，21例進(jìn)展期癌癥組織中微血管密度為(57.81±18.42)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。10例乙型肝炎病毒X蛋白陰性表達(dá)組織中微血管密度為(34.28±2.81)，明顯低于陽性表達(dá)組織；28例COX-2陽性表達(dá)組織中微血管密度為(56.61±3.58)，明顯高于COX-2陰性表達(dá)組織的(33.62±2.83；P<0.01)。非乙型肝炎相關(guān)性肝癌組織中微血管密度為(34.95±1.79)，明顯低于乙型肝炎病毒X蛋白陽性表達(dá)組織及COX-2陽性表達(dá)組織(P<0.01)。乙型肝炎病毒X蛋白陰性表達(dá)組織和COX-2陰性表達(dá)組織之間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。相關(guān)性分析顯示，乙型肝炎病毒X蛋白、COX-2與肝細(xì)胞癌組織微血管生成呈正相關(guān)(r=0.671，P<0.01)。

2.3HepG2、HepG2-X細(xì)胞生長和藥物抑制情況 臺(tái)盼藍(lán)染色細(xì)胞計(jì)數(shù)顯示，培養(yǎng)1～5 d HepG2細(xì)胞數(shù)分別為：1.12×104、3.65×104、6.17×104、7.83×104、9.67×104；HepG2-X細(xì)胞數(shù)分別為：1.09×104、4.81×104、8.35×104、11.06×104、15.92×104。結(jié)果顯示，HepG2-X細(xì)胞在10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基中生長比HepG2細(xì)胞快。20、40、60 μmol/L COX-2抑制劑西樂葆對(duì)HepG2細(xì)胞生長抑制率分別為：(4.61±1.08)%、(10.83±3.67)%、(42.69±8.55)%；HepG2-X細(xì)胞生長抑制率分別為：(7.38±2.15)%、(22.05±6.13)%、(64.18±9.91)%。結(jié)果顯示，西樂葆對(duì)HepG2、HepG2-X細(xì)胞生長抑制呈劑量依賴性且HepG2-X細(xì)胞更為敏感。

2.4HepG2、HepG2-X細(xì)胞中COX-2 mRNA和蛋白表達(dá)情況 HepG2-X細(xì)胞中COX-2 mRNA的相對(duì)表達(dá)量為(6.51±0.79)，明顯高于HepG2細(xì)胞的(4.05±0.42)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；HepG2-X細(xì)胞中COX-2蛋白相對(duì)表達(dá)量為(9.82±1.36)，明顯高于HepG2細(xì)胞的(3.68±0.82)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。見圖3。

圖3 COX-2 mRNA和蛋白表達(dá)情況的RT-PCR和Western印跡檢測結(jié)果

2.5西樂葆作用后細(xì)胞中COX-2表達(dá)情況及細(xì)胞上清培養(yǎng)液中PGE2水平 60 μmol/L的COX-2抑制劑西樂葆作用72 h后HepG2-X、HepG2細(xì)胞中COX-2 mRNA的相對(duì)表達(dá)量分別為(2.15±0.58)、(1.95±0.43)，均較西樂葆作用前的(6.38±0.56)、(4.41±0.37)明顯降低，其中HepG2-X下降幅度更為明顯，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。西樂葆作用后HepG2-X、HepG2細(xì)胞中COX-2 蛋白的相對(duì)表達(dá)量分別為(2.49±0.61)、(1.53±0.38)，均較西樂葆作用前的(10.05±1.82)、(3.81±0.76)明顯降低，其中HepG2-X下降幅度更為明顯，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。見圖4。

1作用前HepG2-X細(xì)胞；2作用前HepG2細(xì)胞；3作用后HepG2-X細(xì)胞；4作用后HepG2細(xì)胞圖4 西樂葆作用前后HepG2-X、HepG2細(xì)胞中COX-2蛋白表達(dá)情況

60 μmol/L西樂葆作用72 h后HepG2-X、HepG2細(xì)胞培養(yǎng)上清液中PGE2水平分別為(513.68±72.15)pg/ml、(639.51±58.09)pg/ml，較作用前的(1 967.85±207.18)pg/ml、(1 304.61±196.50)pg/ml明顯降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。

3 討 論

乙型肝炎病毒X蛋白表達(dá)使肝癌產(chǎn)生獨(dú)特的生物學(xué)特征，與肝細(xì)胞癌的發(fā)生、進(jìn)展、轉(zhuǎn)移密切相關(guān)。新生血管是腫瘤生長、轉(zhuǎn)移過程中的必要因素，COX-2對(duì)腫瘤組織新生血管生成具有明顯促進(jìn)作用，其表達(dá)水平與腫瘤組織浸潤、轉(zhuǎn)移呈正相關(guān)。動(dòng)物試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，在乙型肝炎相關(guān)性肝癌中，乙型肝炎病毒X蛋白可活化T細(xì)胞核因子，進(jìn)而與COX-2啟動(dòng)子結(jié)合后使其表達(dá)上調(diào)，促進(jìn)癌細(xì)胞侵襲〔4〕。乙型肝炎病毒X蛋白和COX-2在肝細(xì)胞癌組織中的協(xié)同表達(dá)提示COX-2可能是乙型肝炎病毒X蛋白的一個(gè)作用靶點(diǎn)。

PEG2是COX-2的主要代謝產(chǎn)物，腫瘤組織中PEG2水平明顯高于正常組織且COX-2與PEG2可促進(jìn)癌細(xì)胞生長和血管生成〔5〕。COX-2/PEG2可通過激活A(yù)KT信號(hào)通路促進(jìn)人肝癌細(xì)胞生長〔6〕。本研究結(jié)果提示，乙型肝炎病毒X蛋白可能通過相應(yīng)的信號(hào)通路活化COX-2表達(dá)，進(jìn)而激活其下游產(chǎn)物PEG2發(fā)揮促進(jìn)肝細(xì)胞癌發(fā)展與轉(zhuǎn)移。提示乙型肝炎病毒X蛋白對(duì)COX-2表達(dá)的影響不僅是數(shù)量的改變，更是功能性的改變。

4 參考文獻(xiàn)

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