史欣輝 陳建平 楊 陽(yáng) 李 銘 楊曉萍

(石河子大學(xué)醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院腎內(nèi)科，新疆 石河子 832000)

慢性腎臟病(CKD)在全球的發(fā)病率逐年升高〔1，2〕。在我國(guó)，CKD的知曉率、治療率、控制率仍不容樂觀，隨著病情的進(jìn)展，最終將導(dǎo)致終末期腎臟病，該病花費(fèi)高，預(yù)后差。CKD的發(fā)病機(jī)制復(fù)雜，起病隱蔽，防治困難，因此，從CKD的發(fā)病機(jī)制出發(fā)尋找一種確實(shí)有效的方法具有重要意義〔3〕?；钚跃S生素D3是一種類固醇激素，其在體內(nèi)的活性形式為1，25(OH)2D3，其經(jīng)典的生理作用為調(diào)節(jié)鈣磷代謝。1，25(OH)2D3可以抑制細(xì)胞增殖，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡〔4〕，抑制炎癥反應(yīng)〔5〕，同時(shí)其還能延緩大動(dòng)脈重構(gòu)與硬化〔6〕，保護(hù)血管內(nèi)皮功能〔7,8〕。本研究旨在探討1，25(OH)2D3對(duì)脂多糖誘導(dǎo)下人腎小管上皮細(xì)胞(HK-2)細(xì)胞增殖與凋亡的影響。

1 材料與方法

1.1材料與試劑 HK-2細(xì)胞株購(gòu)于湘雅醫(yī)學(xué)院中心實(shí)驗(yàn)室，保持了正常的形態(tài)與功能。低糖細(xì)胞培養(yǎng)基(DMEM)、胰蛋白酶、細(xì)胞計(jì)數(shù)試劑盒(CCK)-8檢測(cè)試劑盒、碘化丙啶(均為美國(guó)Sigma產(chǎn)品)、無支原體胎牛血清(杭州四季青產(chǎn)品)、AnnexinV-FITC凋亡試劑盒(美國(guó) Invitrogen產(chǎn)品)。

1.2細(xì)胞培養(yǎng)與實(shí)驗(yàn)分組 HK-2 細(xì)胞進(jìn)行傳代培養(yǎng)，當(dāng)生長(zhǎng)至 80%～90%融合后，用無血清低糖DMEM培養(yǎng)液同步化24 h，分為正常對(duì)照組(加入含10%胎牛血清的低糖DMEM培養(yǎng)液)、脂多糖組(正常對(duì)照基礎(chǔ)上，加入脂多糖，使其終濃度為1 μg/ml)、1，25(OH)2D3〔正常對(duì)照基礎(chǔ)上，加入1，25(OH)2D3，使其終濃度為10-8mol/L〕、脂多糖聯(lián)合1，25(OH)2D3組〔先在正常對(duì)照基礎(chǔ)上加入脂多糖，使其終濃度為1 μg/ml，干預(yù)培養(yǎng)4 h，然后在正常對(duì)照基礎(chǔ)上加入1，25(OH)2D3，使其終濃度為10-8mol/L〕，均干預(yù)培養(yǎng)48 h。

1.3HK-2細(xì)胞增殖檢測(cè) 細(xì)胞以2×105個(gè)/ml接種于96孔板內(nèi)，200 μl/孔，干預(yù)培養(yǎng)48 h后嚴(yán)格按照CCK-8細(xì)胞增殖檢測(cè)試劑盒操作，用酶標(biāo)儀測(cè)定各孔在450 nm波長(zhǎng)處的吸光度值(A450 nm)，每個(gè)實(shí)驗(yàn)組設(shè)4個(gè)復(fù)孔，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，并按以下公式計(jì)算細(xì)胞抑制率(IR)=(A對(duì)照組值-A實(shí)驗(yàn)組值)/(A對(duì)照組值)。

1.4HK-2細(xì)胞周期分布檢測(cè) 細(xì)胞以5×105個(gè)/ml接種于6孔板內(nèi)，2 ml/孔，干預(yù)培養(yǎng)48 h后，流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞周期，并按以下公式計(jì)算細(xì)胞增殖指數(shù)(PI)=S期和G2期細(xì)胞比例之和/G1期、S期和G2期細(xì)胞比例之和。

1.5HK-2細(xì)胞凋亡檢測(cè) 細(xì)胞以5×105個(gè)/ml接種于6孔板內(nèi)，2 ml/孔，按照實(shí)驗(yàn)分組干預(yù)48 h后，嚴(yán)格按照AnnexinV-異硫氰酸熒光素(FITC)凋亡試劑盒操作步驟，用流式細(xì)胞儀檢測(cè)HK-2細(xì)胞的凋亡，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.6統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用SPSS20.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行單因素方差分析、LSD-t法和秩和檢驗(yàn)。

2 結(jié) 果

2.1各組HK-2細(xì)胞增殖比較 與正常對(duì)照組比較，脂多糖組HK-2細(xì)胞吸光度值明顯升高，細(xì)胞增殖明顯增加(P<0.01)；1，25(OH)2D3組HK-2細(xì)胞吸光度值明顯降低，細(xì)胞增殖明顯抑制(P<0.01)。與脂多糖組比較，脂多糖聯(lián)合1，25(OH)2D3組HK-2細(xì)胞吸光度值明顯降低，細(xì)胞增殖明顯抑制(P<0.01)。見表1。

表1 各組HK-2細(xì)胞增殖情況比較

1)與正常對(duì)照組比較；2)與脂多糖組比較:均P<0.01；下表同

2.2各組HK-2細(xì)胞周期分布比較 與正常對(duì)照組比較，脂多糖組HK-2細(xì)胞G0/G1期比例明顯降低，S期及G2/M期比例明顯增加，增殖指數(shù)明顯升高(均P<0.01)；1，25(OH)2D3組HK-2細(xì)胞G0/G1期比例明顯升高，S期及G2/M期比例明顯降低，增殖指數(shù)明顯降低(均P<0.01)。與脂多糖組比較，脂多糖聯(lián)合1，25(OH)2D3組HK-2細(xì)胞G0/G1期比例明顯升高，S期及G2/M期比例明顯降低，增殖指數(shù)明顯降低(均P<0.01)。見圖1、表2。

圖1 各組HK-2細(xì)胞細(xì)胞周期分布比較

表2 各組HK-2細(xì)胞細(xì)胞周期分布及細(xì)胞凋亡率比較(%)

2.3各組人腎小管上皮細(xì)胞細(xì)胞凋亡比較 細(xì)胞凋亡率低，其凋亡率為(2.72±0.46)%。與正常對(duì)照組比較，脂多糖組HK-2細(xì)胞凋亡率明顯降低(P<0.01)；1，25(OH)2D3組HK-2細(xì)胞凋亡率明顯增加(P<0.01)。與脂多糖組比較，脂多糖聯(lián)合1，25(OH)2D3組HK-2細(xì)胞凋亡亦明顯增加(P<0.01)。見表2與圖2。

圖2 各組HK-2細(xì)胞凋亡率比較

3 討 論

目前，對(duì)于CKD的發(fā)病機(jī)制仍無統(tǒng)一認(rèn)識(shí)。腎小管上皮細(xì)胞轉(zhuǎn)分化是各種腎臟疾病進(jìn)展到終末期腎病的主要病理基礎(chǔ)，也是腎小管間質(zhì)纖維化發(fā)生過程中的關(guān)鍵環(huán)節(jié)。因此，尋找能夠逆轉(zhuǎn)腎小管上皮細(xì)胞轉(zhuǎn)分化的因子或藥物，對(duì)于臨床上防治CKD，改善CKD預(yù)后具有重要意義〔9〕。1，25(OH)2D3經(jīng)典的生理作用為調(diào)節(jié)鈣磷代謝。1，25(OH)2D3可抑制腎臟細(xì)胞增殖、阻滯細(xì)胞周期、誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，進(jìn)而發(fā)揮其腎臟保護(hù)作用〔10～13〕。本文提示脂多糖能顯著促進(jìn)HK-2細(xì)胞的增殖。1，25(OH)2D3能顯著抑制HK-2細(xì)胞的增殖，1，25(OH)2D3可能通過某種機(jī)制逆轉(zhuǎn)脂多糖對(duì)HK-2細(xì)胞的促增殖作用。細(xì)胞增殖的過程，其本質(zhì)是DNA復(fù)制的過程。本文結(jié)果說明脂多糖能夠顯著促進(jìn)HK-2細(xì)胞等增殖。1，25(OH)2D3能夠顯著抑制HK-2細(xì)胞的增殖。1，25(OH)2D3可能通過某種機(jī)制逆轉(zhuǎn)脂多糖對(duì)HK-2細(xì)胞的促增殖作用。

正常情況下，細(xì)胞的增殖與細(xì)胞凋亡處于動(dòng)態(tài)平衡〔14〕，當(dāng)細(xì)胞受外界細(xì)胞因子或炎癥因子的作用，細(xì)胞的這種平衡將被打破，進(jìn)而導(dǎo)致疾病的發(fā)生。在腎臟疾病炎癥的修復(fù)過程中可以通過細(xì)胞凋亡來消除過度增殖的細(xì)胞〔15〕。本文結(jié)果說明脂多糖可顯著抑制HK-2細(xì)胞凋亡。1，25(OH)2D3能夠顯著促進(jìn)HK-2細(xì)胞的凋亡。1，25(OH)2D3可能通過某種機(jī)制逆轉(zhuǎn)脂多糖對(duì)HK-2細(xì)胞凋亡的抑制作用。

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