江流芳 勞雅琴 馬慶華 趙宗權

(蘇州衛(wèi)生職業(yè)技術學院基礎部，江蘇 蘇州 215009)

足細胞過度凋亡是糖尿病腎病發(fā)生的重要原因，用高糖處理足細胞是目前常見的研究糖尿病腎病足細胞損傷的體外模型〔1〕。足細胞損傷與腎小球硬化、蛋白尿有關〔2,3〕。維生素D受體(VDR)在多種細胞中存在，與機體內鈣磷等的代謝有關，能夠調控細胞內多種基因的轉錄和表達，影響細胞內信號轉導，與炎癥反應、免疫調節(jié)、蛋白尿產(chǎn)生等有關〔4～6〕。研究表明，糖尿病小鼠經(jīng)VDR基因敲除后，小鼠腎組織中足細胞數(shù)量急劇減少，出現(xiàn)蛋白尿、腎小球硬化等病理癥狀〔7,8〕。本實驗旨在探討VDR對高糖環(huán)境下足細胞凋亡的作用。

1 材料與方法

1.1主要材料 人腎臟足細胞HPC購自中科院細胞庫；qRT-PCR試劑盒為美國DBI BIOSCIENCE產(chǎn)品；RNA提取試劑盒為北京BioTeke公司產(chǎn)品；VDR、β肌動蛋白(β-actin)引物由上海生工合成；VDR多克隆抗體為美國abacm產(chǎn)品；信號轉導與轉錄因子(STAT)3多克隆抗體、磷酸化的STAT3(p-STAT3)多克隆抗體為美國BBI Life Science產(chǎn)品；p38多克隆抗體、磷酸化的p38(p-p38)多克隆抗體為美國CTS產(chǎn)品；膜聯(lián)蛋白(Annexin)V-FITC/碘化丙啶(PI)雙染細胞凋亡檢測試劑盒為上海凱基公司產(chǎn)品；VDR真核表達載體pcDNA3.1-VDR由上海吉瑪構建；重組 γ-干擾素(IFN)為德國Promocell產(chǎn)品；含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶(Caspase)-3活性檢測試劑盒為碧云天產(chǎn)品；Lipofectamine2000為美國 Invitrogen產(chǎn)品。

1.2細胞培養(yǎng)及處理 人腎臟足細胞HPC用100 μg/ml鏈霉素、100 U/ml青霉素、10%胎牛血清、10 U/ml重組γ-IFN的RPMI1640培養(yǎng)液培養(yǎng)，培養(yǎng)條件為：33℃，5%CO2培養(yǎng)箱。誘導分化條件為：37℃，5%CO2培養(yǎng)箱，細胞培養(yǎng)液中不添加重組γ-IFN，培養(yǎng)14 d后，分化成熟。實驗用足細胞均為分化成熟的足細胞。細胞傳代用含有0.25%胰蛋白酶、0.02%乙二胺四乙酸(EDTA)消化液傳代。

1.3細胞分組 人腎臟足細胞HPC分為：Con、HG、pcDNA3.1+HG、pcDNA3.1-VDR+HG、pcDNA3.1、pcDNA3.1-VDR。其中HG、pcDNA3.1+HG、pcDNA3.1-VDR+HG實驗時在細胞培養(yǎng)液中添加30 mmol/L葡萄糖，Con、pcDNA3.1、pcDNA3.1-VDR細胞實驗時在細胞培養(yǎng)液中添加5.5 mmol/L葡萄糖，pcDNA3.1+HG、pcDNA3.1所用細胞為轉染pcDNA3.1后的足細胞，pcDNA3.1-VDR+HG、pcDNA3.1-VDR所用細胞為轉染pcDNA3.1-VDR后的足細胞。人腎臟足細胞HPC培養(yǎng)密度約為60%時，進行細胞轉染，步驟參照Lipofectamine2000轉染試劑說明書。所有實驗用細胞在實驗開始前24 h分別用不含血清的細胞培養(yǎng)液同步化處理。細胞轉染后24 h，Con、pcDNA3.1、pcDNA3.1-VDR細胞用qRT-PCR、Western印跡測定VDR mRNA和蛋白水平，步驟參照1.4和1.5。

1.4高糖作用后足細胞中VDR mRNA水平檢測 VDR mRNA表達水平用qRT-PCR測定。Con、HG細胞培養(yǎng)24 h，用磷酸鹽緩沖液(PBS)洗3次后，提取細胞中總RNA，用紫外分光光度計測定RNA的濃度和純度。逆轉錄合成cDNA，qRT-PCR檢測VDR mRNA。程序為：95℃預變性3 min，95℃變性30 s，55℃退火30 s，72℃延伸1 min，循環(huán)35次。引物：VDR 上游：5′-TCCTTCCTCTGCTGGTAT-3′，下游5′-CTCCCTTGGTTAGTGTGGTAG-3′。β-actin上游：5′-CAGTGGGTTGGAGCGAGCAT-3′，下游5′-GGACTTCCTGTAACAACGCATCT-3′。2-△△Ct法計算VDR mRNA表達，β-actin為內參。實驗重復3次，取均值。

1.5高糖作用后足細胞中VDR 蛋白水平檢測 VDR蛋白水平用Western印跡法測定。Con、HG細胞培養(yǎng)24 h，提取細胞總蛋白，用二喹啉甲酸(BCA)法測定各組足細胞總蛋白濃度。用12%分離膠和5%濃縮膠電泳。將蛋白與同體積的上樣緩沖液在100℃孵育5 min。每個上樣孔添加40 μg蛋白樣品，80 V電壓在濃縮膠中電泳(約0.5 h)，120 V電壓在分離膠中電泳(約2 h)。90 V恒壓轉膜，轉膜時間約為1.5 h。把膜放在含有封閉液(5%牛血清白蛋白)中的薄膜袋，室溫孵育1 h。PBS加吐溫20(PBST)洗滌后，把膜放在含有稀釋好的一抗(VDR 1∶800稀釋，β-actin：1∶1 000稀釋)薄膜袋中，4℃過夜。PBST洗滌，把膜放在含有1∶3 000稀釋的二抗中，室溫孵育2 h。PBST洗滌，用ECL顯色。凝膠成像儀掃描圖像，用Image J分析各條帶的灰度值，以β-actin為內參，分析VDR蛋白水平。實驗重復3次，取均值。

1.6細胞凋亡測定 Con、HG、pcDNA3.1+HG、pcDNA3.1-VDR+HG細胞培養(yǎng)24 h，用Annexin V-FITC/PI雙染法測定細胞凋亡。收集各組細胞，加入胰蛋白酶消化后，1 000 r/min離心10 min，棄除上清，PBS洗滌2次細胞后，在細胞中加入Annexin V-FITC結合緩沖液195 μl，混合均勻，再添加Annexin V-FITC 5 μl和PI 10 μl，在室溫中孵育20 min，用流式細胞儀測定細胞凋亡情況。

1.7Caspase-3活性測定 Con、HG、pcDNA3.1+HG、pcDNA3.1-VDR+HG細胞培養(yǎng)24 h，收集細胞，用比色法測定細胞中Caspase-3的活性。收集細胞，加入細胞裂解液，在冰上裂解10 min，4℃，12 000 r/min離心10 min。取上清溶液，對蛋白進行定量。在蛋白上清中添加入2×反應緩沖液，再加入5 μl AC-DEVD-pNA，37℃孵育60 min。用酶標儀測定405 nm的光密度(OD)值，以OD值表示Caspase-3的活性。

1.8STAT3、p-STAT3、p38、p-p38蛋白表達測定 Con、HG、pcDNA3.1+HG、pcDNA3.1-VDR+HG細胞培養(yǎng)24 h，收集細胞檢測STAT3、p-STAT3、p38、p-p38蛋白水平。STAT3、p-STAT3、p38、p-p38蛋白水平檢測用Western印跡法，步驟同1.5，其中一抗稀釋倍數(shù)為：STAT3(1∶600)、p-STAT3(1∶500)、p38(1∶600)、p-p38(1∶500)。

1.9統(tǒng)計學分析 采用SPSS21.0軟件進行t檢驗、單因素方差分析及LSD-t檢驗。

2 結 果

2.1高糖作用后足細胞中VDR的表達 HG細胞中VDR mRNA和蛋白水平(0.51±0.06，0.38±0.04)與Con相比(1.00，1.12±0.13)明顯降低(P<0.05)。見圖1。

2.2轉染后細胞中VDR的表達 pcDNA3.1細胞中VDR mRNA和蛋白水平與Con相比沒有明顯變化，差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。pcDNA3.1-VDR細胞中VDR mRNA和蛋白水平與Con相比明顯升高(P<0.05)。見圖2和表1。

圖1 Western印跡檢測高糖作用后足細胞中VDR的蛋白水平

表1 細胞中轉染pcDNA3.1-VDR后足細胞中VDR mRNA和蛋白水平

與Con相比：1)P<0.05

圖2 Western印跡檢測細胞中轉染pcDNA3.1-VDR后足細胞中VDR蛋白水平

2.3VDR對高糖誘導細胞凋亡和Caspase-3活化的影響 HG、pcDNA3.1+HG、pcDNA3.1-VDR+HG細胞凋亡率明顯高于Con，細胞中Caspase-3活化水平也明顯高于Con(P<0.05)。pcDNA3.1-VDR+HG細胞凋亡率、Caspase-3活化水平明顯低于HG(P<0.05)。見圖3和表2。

圖3 流式細胞術測定VDR對高糖誘導的足細胞凋亡影響

表2 過表達VDR后經(jīng)高糖作用的足細胞凋亡率及Caspase-3活性

與Con相比：1)P<0.05；與HG相比：2)P<0.05；下表同

2.4VDR對高糖作用后足細胞中STAT3、p-STAT3、p38、p-p38蛋白表達的影響 HG、pcDNA3.1+HG、pcDNA3.1-VDR+HG細胞中p-p38水平、p-STAT3水平明顯高于Con(P<0.05)。pcDNA3.1-VDR+HG細胞中p-p38水平、p-STAT3水平明顯低于HG(P<0.05)。見圖4和表3。

圖4 Western印跡測定VDR對高糖作用的足細胞中STAT3、p-STAT3、p38、p-p38蛋白水平影響

表3 VDR過表達后經(jīng)高糖作用足細胞中STAT3、p-STAT3、p38、p-p38蛋白水平

3 討 論

有研究報道，維生素D參與慢性腎臟病的發(fā)生和發(fā)展，維生素D的缺乏與糖尿病腎病的發(fā)生有關，慢性腎臟患者使用維生素D類的藥物可有效降低尿白蛋白肌酸酐比〔9,10〕。VDR屬于一種轉錄調控因子，可以特異性結合維生素D代謝產(chǎn)物，是維生素D的受體，其在腎臟組織中廣泛表達，腎小球上皮細胞、足細胞、腎小球旁器等中均發(fā)現(xiàn)有VDR的表達〔11,12〕。以前的研究報道，糖尿病小鼠VDR基因敲除后，小鼠產(chǎn)生的血管緊張素、腎素等異常增加，并且小鼠出現(xiàn)嚴重的腎組織損傷，伴隨有腎臟間質纖維化、蛋白尿等癥狀，小鼠腎組織中足細胞大量凋亡〔7,13〕。本實驗說明VDR參與糖尿病腎病的發(fā)生，與上述實驗報道符合。

最初的研究顯示，腎小球肥大、系膜細胞增生、基底膜增厚等是糖尿病腎病早期的主要病理變化，然而隨著研究的不斷深入，人們發(fā)現(xiàn)在糖尿病腎病的早期，足細胞數(shù)量異常減少，細胞間的間隙也不斷增加，并且在蛋白尿的發(fā)生中具有關鍵作用〔14〕。高糖誘導足細胞損傷，足細胞在糖尿病腎病中凋亡異常增加。Caspase-3在正常狀態(tài)下以酶原的狀態(tài)廣泛存在于組織中，在受到細胞因子的作用后，細胞中Caspase-3活化，發(fā)揮凋亡促進的作用〔15,16〕。本實驗結果說明VDR可以降低高糖對足細胞凋亡的誘導作用。

STAT3是STATs家族成員之一，是細胞內重要的信號轉導通路，STAT3磷酸化后形成二聚體進一步轉移到細胞核內調控基因的轉錄和表達，影響細胞的生長、凋亡等一系列過程〔17〕。STAT3在糖尿病腎病組織中磷酸化水平異常升高，在高糖誘導的足細胞中STAT3磷酸化水平也異常升高〔18〕。p38是MAPK亞類之一，與糖尿病腎病的發(fā)生有關〔19〕。研究顯示，p38在糖尿病患者腎組織中的磷酸化水平升高，并且與糖尿病腎病腎組織中的細胞凋亡有關〔20〕。本實驗結果說明VDR對足細胞凋亡的影響與細胞中STAT3和p38磷酸化水平有關。綜上，高糖促進足細胞中VDR的表達，并且VDR可以降低高糖誘導的足細胞凋亡，STAT3和p38磷酸化水平的高低可能與VDR的作用機制有關。

4 參考文獻

1Langham RG,Kelly DJ,Cox AJ,etal.Proteinuria and the expression of the podocyte slit diaphragm protein,nephrin,in diabetic nephropathy:effects of angiotensin converting enzyme inhibition〔J〕.Diabetologia,2002;45(11):1572-6.

2Rd MA,Gill JM.The lack of screening for diabetic nephropathy:evidence from a privately insured population〔J〕.Family Med,2015;33(2):115-9.

3Zhao L,Wang X,Sun L,etal.Critical role of serum response factor in podocyte epithelial-mesenchymal transition of diabetic nephropathy〔J〕.Diabetes Vascular Dis Res,2016;13(1):81-92.

4Vedralová M,Kotrbova-Kozak A,Zelezníková V,etal.Polymorphisms in the vitamin D receptor gene and parathyroid hormone gene in the development and progression of diabetes mellitus and its chronic complications,diabetic nephropathy and non-diabetic renal disease〔J〕.Kidney Blood Press Res,2012;36(1):1-9.

5Thill M,Becker S,Fischer D,etal.Expression of prostaglandin metabolising enzymes COX-2 and 15-PGDH and VDR in human granulosa cell〔J〕.Anticancer Res,2009;29(9):3611-8.

6Keith ME,Laporta E,Welsh J.Stable expression of human VDR in murine VDR-null cells recapitulates vitamin D mediated anti-cancer signaling〔J〕.Mol Carcinog,2014;53(4):286-99.

7Sancheznio MD,Bozic M,Córdobalanús E,etal.Beyond proteinuria:VDR activation reduces renal inflammation in experimental diabetic nephropathy〔J〕.Am J Physiol Renal Physiol,2012;302(6):F647.

8周正宇.1,25-(OH)D對1型糖尿病的防治作用及其機制研究〔D〕.蘇州：蘇州大學,2010.

9史偉佳.維生素D對慢性腎臟疾病腎臟保護作用臨床研究〔D〕.蕪湖：皖南醫(yī)學院,2016.

10王 菊,王海燕,張桂霞,等.慢性腎臟病患者血清25-羥維生素D水平及其影響因素分析〔J〕.安徽醫(yī)科大學學報,2016;51(1):106-9.

11Santoro D,Caccamo D,Gagliostro G,etal.Vitamin D metabolism and activity as well as genetic variants of the vitamin D receptor(VDR)in chronic kidney disease patients〔J〕.J Nephrol,2013;26(4):636-44.

12Uchiyama T,Tatsumi N,Kamejima S,etal.Hypermethylation of the CaSR,and VDR,genes in the parathyroid glands in chronic kidney disease rats with high-phosphate diet〔J〕.Human Cell,2016;29(4):155-61.

13Glenn DJ,Cardema MC,Gardner DG.Amplification of lipotoxic cardiomyopathy in the VDR gene knockout mouse〔J〕.J Ster Biochem Mol Biol,2015;164(8):292-8.

14Xiao T,Xu G,Ling N,etal.Rapamycin promotes podocyte autophagy and ameliorates renal injury in diabetic mice〔J〕.Mol Cell Biochem,2014;394(1-2):145-54.

15Ishizaka M,Gohda T,Takagi M,etal.Podocyte-specific deletion of Rac1 leads to aggravation of renal injury in STZ-induced diabetic mice〔J〕.Biochem Biophys Res Commun,2015;467(3):549-55.

16Reddy S,Bradley J,Ginn S,etal.Immunohistochemical study of caspase-3-expressing cells within the pancreas of non-obese diabetic mice during cyclophosphamide-accelerated diabetes〔J〕.Histochem Cell Biol,2003;119(6):451-61.

17Tang SC,Yiu WH,Lin M,etal.Diabetic nephropathy and proximal tubular damage〔J〕.J Renal Nutr,2015;25(2):230-3.

18史永紅,段惠軍,何 寧,等.氯沙坦對糖尿病大鼠腎小球信號蛋白JAK2和STAT3表達的影響〔J〕.中華危重病急救醫(yī)學,2005;17(11):662-6.

19何日明,門 凌,易無庸,等.黃芩素對糖尿病腎病大鼠腎組織p38MAPK表達的影響〔J〕.廣東醫(yī)學,2016;37(20):3006-9.

20Adhikary L,Chow F,Nikolic-Paterson DJ,etal.Abnormal p38 mitogen-activated protein kinase signalling in human and experimental diabetic nephropathy〔J〕.Diabetologia,2004;47(7):1210-22.