柴 瑛

(佳木斯大學(xué)附屬第一醫(yī)院骨科，黑龍江 佳木斯 154002)

骨肉瘤主要發(fā)生于骨骼的生長(zhǎng)和修復(fù)區(qū)域。盡管骨肉瘤的診斷和治療已取得了重大進(jìn)展，但由于常出現(xiàn)復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移，患者5年生存率仍然很低〔1，2〕。白細(xì)胞介素(IL)-8是一種血管生成趨化因子，在許多人類(lèi)惡性腫瘤如直腸癌、宮頸癌、乳腺癌、胃癌等均可檢測(cè)到高水平IL-8表達(dá)，同時(shí)高水平的IL-8也被認(rèn)為可參與腫瘤的血管生成、細(xì)胞轉(zhuǎn)移及復(fù)發(fā)等惡性行為〔3〕。本實(shí)驗(yàn)研究IL-8對(duì)骨肉瘤細(xì)胞增殖及遷移的作用及其機(jī)制。

1 資料與方法

1.1一般資料 2015年6月至2017年7月佳木斯大學(xué)附屬第一醫(yī)院57例骨肉瘤患者和年齡、性別匹配的41例正常健康人為研究對(duì)象。骨肉瘤患者中男26例，女31例；臨床Ⅰ級(jí)17例、Ⅱ級(jí)21例、Ⅲ級(jí)19例；腫瘤浸潤(rùn)T1、T2和T3階段分別為22、18和17例。年齡46～66歲，平均61.43歲。兩組一般資料差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。

1.2實(shí)驗(yàn)材料及試劑 DMEM基培養(yǎng)基及胎牛血清(FBS)購(gòu)自美國(guó)Gibco公司；重組人IL-8購(gòu)自美國(guó)PeproTech公司；細(xì)胞計(jì)數(shù)試劑盒(CCK)-8和IL-8酶聯(lián)免疫吸附(ELISA)試劑盒購(gòu)置武漢博士德公司；細(xì)胞遷移(Transwell)小室購(gòu)自美國(guó)Corning公司；細(xì)胞外信號(hào)調(diào)節(jié)激酶(ERK)抗體購(gòu)自美國(guó)Santa Cruz公司。

1.3ELISA實(shí)驗(yàn) 清晨空腹抽取靜脈血3 ml，離心后收集血清；按IL-8 ELISA試劑說(shuō)明書(shū)操作后利用酶標(biāo)儀測(cè)取吸光度450 nm；繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算樣本血清IL-8濃度。

1.4CCK-8實(shí)驗(yàn) 將培養(yǎng)于96孔板(3×103個(gè)/孔)中的143B細(xì)胞分成5組，各組細(xì)胞所用培養(yǎng)基為含5% FBS和不同濃度重組人IL-8(0、20、40和60 ng/ml)的DMEM培養(yǎng)基。待細(xì)胞培養(yǎng)至24、48 h行CCK-8實(shí)驗(yàn)。

1.5Transwell實(shí)驗(yàn) 將143B細(xì)胞培養(yǎng)于Transwell上室(1.5×104個(gè)/室)，上室中培養(yǎng)基為不含F(xiàn)BS的DMEM培養(yǎng)基，下室中培養(yǎng)基為含5%FBS和不同濃度重組人IL-8(0、20、40、60和 80 ng/ml)的DMEM培養(yǎng)基。待細(xì)胞培養(yǎng)至24、48 h，用脫脂棉擦掉未遷移細(xì)胞，固定、染色后進(jìn)行細(xì)胞計(jì)算。

1.6蛋白印跡實(shí)驗(yàn) 將40 μg細(xì)胞總蛋白行十二烷基硫酸鈉(SDS)-聚丙烯酰胺凝膠電泳并轉(zhuǎn)印于聚偏二氟乙烯(PVDF)膜上；5%脫脂奶37℃封閉1 h；磷酸緩沖液-吐溫(PBS-T)洗滌3次×5 min；一抗4℃冰箱孵育過(guò)夜(ERK稀釋比為1∶200；β-actin稀釋比為1∶1 000)；PBS-T洗滌3次×5 min；二抗37℃孵育45 min；PBS-T洗滌5次×10 min；化學(xué)發(fā)光(ECL)試劑顯色；以β-actin為內(nèi)參，計(jì)算ERK蛋白相對(duì)表達(dá)量。

1.7統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 應(yīng)用SPSS19.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行q檢驗(yàn)。

2 結(jié) 果

2.1骨肉瘤患者高表達(dá)IL-8 與正常健康人 〔(14.257±2.12)pg/ml〕比較，骨肉瘤患者血清IL-8含量〔(16.232±3.46)pg/ml〕顯著增高(P<0.05)；在骨肉瘤患者中，臨床Ⅲ級(jí)血清IL-8含量〔n=19,(16.673±2.17)pg/ml〕明顯高于Ⅰ級(jí)〔n=17,(15.467±2.75)pg/ml〕和Ⅱ級(jí)〔n=21,(16.452±2.01)pg/ml〕，腫瘤浸潤(rùn)T2〔n=18,(16.939±1.97)pg/ml〕和T3階段血清IL-8含量〔n=17,(17.762±3.03)pg/ml〕明顯高于T1〔n=22,(14.471±2.54)pg/ml〕(均P<0.05)；但I(xiàn)L-8含量男女〔(16.247±3.27)vs (16.219±2.96)pg/ml〕差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。

2.2IL-8促進(jìn)143B細(xì)胞增殖 細(xì)胞培養(yǎng)24 h，與0 ng/ml IL-8組比較，40 ng/ml和60 ng/ml IL-8組顯著促進(jìn)143B細(xì)胞增殖；細(xì)胞培養(yǎng)48 h，與0 ng/ml IL-8組比較，20，40和60 ng/ml IL-8組顯著促進(jìn)143B細(xì)胞增殖(均P<0.05)。見(jiàn)表1。

表1 IL-8促進(jìn)143B細(xì)胞增殖吸光度，n=7)

與0 ng/ml比較：1)P<0.05，2)P<0.01;表2同

2.3IL-8促進(jìn)143B細(xì)胞遷移 細(xì)胞培養(yǎng)24 h，與0 ng/ml IL-8組比較，60 ng/ml IL-8組顯著促進(jìn)143B細(xì)胞遷移；細(xì)胞培養(yǎng)48 h，與0 ng/ml IL-8組比較，40和60 ng/ml IL-8組顯著促進(jìn)143B細(xì)胞增殖(均P<0.05)。見(jiàn)表2。

表2 IL-8促進(jìn)143B細(xì)胞遷移細(xì)胞數(shù))

2.4IL-8上調(diào)143B細(xì)胞ERK蛋白表達(dá) 細(xì)胞培養(yǎng)48 h，0、20、40和60 ng/ml IL-8組細(xì)胞ERK蛋白相對(duì)表達(dá)量分別是(0.576±0.042)、(0.608±0.061)、(0.897±0.072)和(0.863±0.058)，與0 ng/ml比較，40和60 ng/ml IL-8組ERK蛋白相對(duì)表達(dá)量顯著增高(P<0.05)。

3 討 論

IL-8屬于促中性粒細(xì)胞趨化和炎癥反應(yīng)趨化因子家族成員，當(dāng)中性粒細(xì)胞、巨噬細(xì)胞應(yīng)對(duì)各種刺激(如化學(xué)成分、炎癥信號(hào)和環(huán)境壓力等)時(shí)，可經(jīng)由活化的核因子(NF)-κB途徑而誘使IL-8表達(dá)上調(diào)。研究表明，IL-8受體CRCX1和CRCX2在腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞、中性粒細(xì)胞及癌細(xì)胞中均有表達(dá)，提示IL-8在腫瘤微環(huán)境中具有重要作用〔4〕。腫瘤微環(huán)境中的IL-8可經(jīng)上調(diào)腫瘤細(xì)胞上IL-8受體CRCX1和CRCX2的表達(dá)而促進(jìn)腫瘤進(jìn)程〔5〕。作為IL-8介導(dǎo)中性粒細(xì)胞趨化性的主要效應(yīng)器，磷脂酰肌醇-3激酶(PI-3K)可使底物絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶(PKB/Akt)磷酸化。MacManus等〔6〕研究顯示，IL-8可通過(guò)誘導(dǎo)腫瘤Akt的過(guò)表達(dá)和活性增加，以調(diào)控腫瘤細(xì)胞生存、血管生成及遷移。IL-8信號(hào)也可調(diào)控促分裂原活化蛋白激酶(MAPK)信號(hào)通路活性，在卵巢癌和肺癌細(xì)胞系中，IL-8信號(hào)激活表皮生長(zhǎng)因子受體，促進(jìn)MAPK信號(hào)通路下游激活，進(jìn)而有助于細(xì)胞的增殖和存活〔7〕。在骨肉瘤中，表達(dá)高水平IL-6和IL-8的骨肉瘤細(xì)胞株不僅可經(jīng)自分泌方式發(fā)揮作用，而且在小鼠異種移植模型中，它們比低表達(dá)IL-6和IL-8的細(xì)胞系更容易形成肺轉(zhuǎn)移；相反，當(dāng)阻斷IL-6和IL-8信號(hào)則可降低骨肉瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)移效率，提示IL-6和IL-8在骨肉瘤的肺轉(zhuǎn)移機(jī)制中發(fā)揮核心作用〔8〕。綜上，高表達(dá)IL-8可經(jīng)ERK通路促進(jìn)骨肉瘤細(xì)胞的增殖及遷移活性。

4 參考文獻(xiàn)

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