姜 海 劉 宇 徐 剛

(唐山市工人醫(yī)院燒傷整形二科，河北 唐山 063000)

創(chuàng)面是指在熱力、外力、低溫、電流、化學(xué)物質(zhì)、手術(shù)等外界致傷因子以及局部血液供應(yīng)障礙等機(jī)體內(nèi)在因素的作用下引起正常皮膚組織的丟失或出現(xiàn)皮膚完整性的中斷，并伴有皮膚功能損傷。皮膚受傷后發(fā)生一系列炎癥反應(yīng)，真皮組織細(xì)胞分泌纖維連接蛋白和膠原等進(jìn)行真皮組織重建和上皮組織再生〔1〕。整合素連接激酶(ILK)是絲氨酸-蘇氨酸蛋白激酶的一種，激活的ILK參與生長因子和整合素信號(hào)通路，對(duì)細(xì)胞凋亡、細(xì)胞遷移、細(xì)胞增生等多種細(xì)胞功能有調(diào)節(jié)作用，可以介導(dǎo)細(xì)胞外基質(zhì)和細(xì)胞的相互作用〔2,3〕。研究發(fā)現(xiàn)ILK在心肌、肝臟、皮膚、神經(jīng)纖維等組織器官損傷后的修復(fù)過程中發(fā)揮重要作用〔4,5〕。本文通過分析燒傷大鼠創(chuàng)面中ILK的表達(dá)水平及大鼠燒傷創(chuàng)面轉(zhuǎn)染ILK過表達(dá)慢病毒后對(duì)創(chuàng)傷愈合的影響，探討ILK在燒傷創(chuàng)面愈合中的作用。

1 材料與方法

1.1材料 Wistar大鼠購自首都醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物部，二氨基聯(lián)苯胺(DAB)顯色試劑盒、SP試劑盒、兔抗鼠ILK單克隆抗體(美國Sigma公司)，重組慢病毒載體(包含重組綠色熒光蛋白編碼基因和大鼠型ILK的cDNA片段)和不含ILK基因片段的空載慢病毒(上海吉?jiǎng)P基因公司構(gòu)建)等。

1.2實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1大鼠皮膚燒傷模型建立 將Wistar大鼠經(jīng)戊巴比妥鈉腹腔麻醉成功后固定在燙傷儀上，將背部皮毛剔除，消毒背部皮膚，將80℃圓柱形燙頭垂直接觸Wistar大鼠背部兩側(cè)對(duì)稱皮膚致傷8 s建立大鼠燒傷模型；對(duì)照組大鼠不做任何處理。術(shù)后觀察創(chuàng)面的愈合情況。

1.2.2大鼠燒傷創(chuàng)面愈合過程中ILK表達(dá)測定 分別在燒傷后1、2、3 w隨機(jī)取7只燒傷模型大鼠，切取背部全層創(chuàng)面皮膚，對(duì)照組切取背部正常皮膚，用甲醛固定，石蠟包埋，切厚5 μm的切片，進(jìn)行SP法免疫組化染色，以兔抗鼠ILK單克隆抗體為一抗，陰性對(duì)照以磷酸鹽緩沖液(PBS)代替一抗，具體步驟按照試劑盒說明書進(jìn)行。結(jié)果分析，每個(gè)標(biāo)本取7張切片，每張切片取7個(gè)高倍視野，采用Axio Vision顯微圖像采集系統(tǒng)拍攝圖片，采用Image-Proplus圖像分析軟件計(jì)算每個(gè)視野陽性表達(dá)的光密度值(平均光密度值=視野陽性表達(dá)積分光密度值/視野總面積)，蛋白表達(dá)強(qiáng)度和平均光密度值呈正比，平均光密度值越高蛋白水平越高。

1.2.3ILK質(zhì)粒轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞 取生長良好的293T細(xì)胞用胰蛋白酶進(jìn)行消化，制成細(xì)胞懸液接種到24孔板上放回培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，培養(yǎng)至細(xì)胞達(dá)85%融合時(shí)進(jìn)行質(zhì)粒轉(zhuǎn)染，具體轉(zhuǎn)染步驟按照轉(zhuǎn)染試劑說明書操作，并檢測質(zhì)粒轉(zhuǎn)染率。

1.2.4大鼠的分組和處理 取燒傷大鼠隨機(jī)分為ILK轉(zhuǎn)染組、陰性對(duì)照組和空白對(duì)照組，ILK轉(zhuǎn)染組大鼠在燒傷后第2天于創(chuàng)面周圍及基底注射ILK過表達(dá)慢病毒液100 μl；陰性對(duì)照組大鼠在燒傷后第2天于創(chuàng)面周圍及基底注射空質(zhì)粒慢病毒液100 μl；空白對(duì)照組大鼠于燒傷后第2天于創(chuàng)面周圍及基底注射等量生理鹽水。

1.2.5慢病毒轉(zhuǎn)染大鼠后組織綠色熒光檢測 燒傷后2 w，分別取ILK轉(zhuǎn)染組、陰性對(duì)照組大鼠各7只，處死后取相同部位背部創(chuàng)面皮膚，苦味酸標(biāo)記處將創(chuàng)面組織切為厚10 μmol/L的切片，470 nm綠色激光下對(duì)創(chuàng)面組織的綠色熒光進(jìn)行檢測。

1.2.6慢病毒轉(zhuǎn)染大鼠后ILK表達(dá)的檢測 分別取ILK轉(zhuǎn)染組、陰性對(duì)照組和空白對(duì)照組大鼠各21只，分別于燒傷后1、2、3 w每組各處死7只大鼠，取背部創(chuàng)面組織，采用免疫組化法測定組織ILK蛋白的平均光密度值，方法同上。

1.2.7ILK對(duì)大鼠燒傷創(chuàng)面愈合時(shí)間和愈合率的影響 分別取ILK轉(zhuǎn)染組、陰性對(duì)照組和空白對(duì)照組大鼠各7只觀察大鼠燒傷創(chuàng)面愈合時(shí)間和愈合率的影響，在燒傷后第1、2、3周對(duì)創(chuàng)面進(jìn)行拍照，記錄創(chuàng)面愈合時(shí)間，采用Image J軟件分析各組大鼠創(chuàng)面面積，計(jì)算各組大鼠的創(chuàng)面愈合率，創(chuàng)面愈合率=(1-殘余創(chuàng)面面積)/原始創(chuàng)面面積×100。

1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS20.0軟件，多組均數(shù)比較采用方差分析，組內(nèi)兩兩比較采用LSD檢驗(yàn)。

2 結(jié) 果

2.1燒傷創(chuàng)面愈合情況 燒傷后第3天創(chuàng)面開始收縮，1 w時(shí)壞死組織脫離，2 w時(shí)形成大量皮島，3 w時(shí)創(chuàng)面基本痊愈，所有大鼠創(chuàng)面愈合過程平穩(wěn)，未見感染征象。

2.2大鼠燒傷創(chuàng)面愈合過程中ILK的表達(dá)情況 燒傷組燒傷后1 w(0.046±0.014)和2 w(0.057±0.020)燒傷創(chuàng)面ILK的光密度值高于對(duì)照組(0.012±0.003)(P<0.05)，燒傷后3 w(0.014±0.007)燒傷創(chuàng)面ILK光密度值和對(duì)照組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。

2.3ILK質(zhì)粒轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞結(jié)果鑒定 目的基因質(zhì)粒轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞后24 h可以觀察到綠色熒光蛋白表達(dá)，轉(zhuǎn)染率為86.6%，表明ILK基因質(zhì)粒轉(zhuǎn)染成功。見圖1。

圖1 ILK基因質(zhì)粒轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞(×100)

2.4慢病毒活體轉(zhuǎn)染后的表達(dá)情況 熒光顯微鏡下見創(chuàng)面冰凍切片中有綠色熒光蛋白表達(dá)，綠色熒光蛋白主要在皮膚基底層表達(dá)，部分毛囊中也可見綠色熒光蛋白表達(dá)。見圖2。

圖2 慢病毒轉(zhuǎn)染后創(chuàng)面熒光情況(×10)

2.5慢病毒轉(zhuǎn)染后各組大鼠創(chuàng)面組織ILK光密度值比較 燒傷后1、2 w，ILK轉(zhuǎn)染組創(chuàng)面組織ILK光密度值高于空白對(duì)照組和陰性對(duì)照組(P<0.05)；燒傷后3 w，三組創(chuàng)面組織ILK光密度值比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見表1。

表1 慢病毒轉(zhuǎn)染后各組大鼠創(chuàng)面組織ILK光密度值比較

與ILK轉(zhuǎn)染組比較:1)P<0.05

2.6ILK轉(zhuǎn)染后各組大鼠創(chuàng)面愈合率和愈合時(shí)間比較 燒傷后1、2 w，ILK轉(zhuǎn)染組創(chuàng)面愈合率高于空白對(duì)照組和陰性對(duì)照組(P<0.05)；燒傷后3 w，三組創(chuàng)面愈合率比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。ILK轉(zhuǎn)染組創(chuàng)面愈合時(shí)間〔(14.54±0.34)d〕短于空白對(duì)照組〔(17.98±0.46)d〕和陰性對(duì)照組〔(18.24±0.51)d〕(F=223.454，P<0.05)。見表2。

表2 ILK轉(zhuǎn)染后各組大鼠創(chuàng)面愈合率比較

與ILK轉(zhuǎn)染組比較:1)P<0.05

3 討 論

創(chuàng)面的愈合實(shí)質(zhì)為受損組織完整性的重建，創(chuàng)面愈合包括炎性反應(yīng)期、肉芽組織增殖期和細(xì)胞外基質(zhì)重塑期，炎性反應(yīng)期主要表現(xiàn)為炎癥介質(zhì)的釋放和血管收縮；肉芽組織增殖期主要為血管生成、表皮細(xì)胞再生、纖維組織增生、纖維蛋白凝固；細(xì)胞外基質(zhì)重塑期主要為皮膚組織彈性和抗拉強(qiáng)度的再形成和恢復(fù)〔6,7〕。整合素在創(chuàng)面愈合過程中發(fā)揮重要作用，其介導(dǎo)的信號(hào)通路對(duì)細(xì)胞周期、細(xì)胞增殖、細(xì)胞分化、細(xì)胞死亡等具有調(diào)控作用〔8〕；ILK在整合素介導(dǎo)的信號(hào)通路中發(fā)揮關(guān)鍵性的作用，在生長因子信號(hào)通路中，ILK也發(fā)揮重要作用，整合素和生長因子受體胞內(nèi)信號(hào)通路胞內(nèi)結(jié)構(gòu)可以激活I(lǐng)LK，ILK被激活后通過多種途徑發(fā)揮激酶活性，參與細(xì)胞的調(diào)控〔9,10〕。ILK在腫瘤的發(fā)生和轉(zhuǎn)移、組織纖維化、組織損傷后修復(fù)等過程中發(fā)揮重要作用〔11,12〕。

ILK對(duì)細(xì)胞凋亡有抑制作用，其對(duì)細(xì)胞凋亡的抑制作用在腫瘤的發(fā)生發(fā)展中具有重要作用〔13〕，創(chuàng)面的愈合需要細(xì)胞的大量增殖，促進(jìn)細(xì)胞增殖可以促進(jìn)創(chuàng)面的愈合。本文結(jié)果發(fā)現(xiàn)，ILK在燒傷創(chuàng)面的愈合中發(fā)揮一定作用，ILK水平升高有利于促進(jìn)燒傷創(chuàng)面的愈合。創(chuàng)面的修復(fù)包括真皮重構(gòu)和表皮再生，真皮重構(gòu)需要纖維細(xì)胞大量增生，纖維細(xì)胞分泌膠原等細(xì)胞外基質(zhì)，從而完成真皮的重建；表皮再生過程中，汗腺、毛囊、基底層等處表皮干細(xì)胞首先出現(xiàn)增生，然后分化為表皮細(xì)胞，從而完成表皮的再生過程。ILK可能通過整合素信號(hào)通路調(diào)節(jié)燒傷創(chuàng)面細(xì)胞的增生，并在細(xì)胞外基質(zhì)和細(xì)胞的相互作用中發(fā)揮作用，ILK表達(dá)水平升高促進(jìn)細(xì)胞增殖、生長和分化，促進(jìn)血管新生，從而促進(jìn)創(chuàng)面的愈合〔14,15〕。

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