農(nóng)慶文 李順堂 劉達(dá)恩 吳亞軍

(廣西醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院燒傷整形科，廣西 南寧 530021)

糖尿病(DM)常伴隨血管病變，包括大血管和微血管病變。其中大血管病變常引起下肢疼痛和間歇性跛行，嚴(yán)重者導(dǎo)致肢體壞疽，多與大血管病變引起皮膚缺血性病變，引發(fā)潰瘍和感染相關(guān)。如何預(yù)防和治療DM相關(guān)的大血管病變是DM治療的重要內(nèi)容〔1,2〕。弱激光對(duì)于創(chuàng)傷的治療自20世紀(jì)60年代開(kāi)始至今，其療效飽受爭(zhēng)議，與弱激光的治療機(jī)制不明密切相關(guān)〔3〕。磷脂酰肌醇3 激酶(PI3K)、蛋白激酶B(Akt)和缺氧誘導(dǎo)因子(HIF)-1α是具有多種功能的信號(hào)通路，功能包括細(xì)胞新陳代謝、大分子合成、細(xì)胞代謝(生長(zhǎng)、增殖和凋亡)等〔4〕。研究顯示PI3K/Akt-HIF-1α信號(hào)系統(tǒng)可能參與2型DM創(chuàng)傷愈合相關(guān)〔5〕。本課題分析PI3K/Akt-HIF-1α信號(hào)系統(tǒng)在DM大鼠皮膚創(chuàng)傷愈合過(guò)程的表達(dá)，并分析不同劑量弱激光對(duì)于DM大鼠皮膚創(chuàng)傷愈合的作用和對(duì)其可能影響。

1 資料與方法

1.1受試動(dòng)物 SD雄性大鼠100只，體重180～220 g，3～4月齡，廣西實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物生產(chǎn)許可證證號(hào)：SCXK2014-0002。

1.2儀器和設(shè)備 血糖儀及配套血糖試紙(上海玉研科學(xué)儀器有限公司)；GL21M型高速低溫離心機(jī)(湖南凱達(dá)科學(xué)儀器有限公司)。

1.3DM大鼠皮膚創(chuàng)傷模型制備 2%的鏈脲佐菌素50 mg/kg腹腔注射，72 h后尾靜脈取血，測(cè)血糖值，血糖≥16.8 mmol/L提示DM大鼠制備成功。大鼠采用水合氯醛麻醉，刮凈背部，常規(guī)消毒術(shù)野，以無(wú)菌手術(shù)剪在背部在脊柱左右對(duì)稱(chēng)地剪開(kāi)1 cm半徑的圓形皮膚創(chuàng)口，手術(shù)全程保持自然暴露。

1.4分組與給藥 將100只SD大鼠隨機(jī)分為5組：正常組、非DM皮膚創(chuàng)傷組、DM皮膚創(chuàng)傷組、弱激光低劑量組和弱激光高劑量組，20只/組。除正常組和非DM皮膚創(chuàng)傷組，其余組造模處理，非DM皮膚創(chuàng)傷組不制備DM模型，給予創(chuàng)傷處理。造模第2天給藥，正常組、非DM皮膚創(chuàng)傷組和DM皮膚創(chuàng)傷組不給予任何干預(yù)，弱激光低劑量組接受1.2 g·cm-2·6 min-1的弱激光照射，弱激光高劑量組接受3.6 g·cm-2·6 min-1的弱激光照射，連續(xù)照射7 d，創(chuàng)傷口以外部位避光處理。

1.5指標(biāo)檢測(cè) ①記錄創(chuàng)傷后1、3、7 d的創(chuàng)傷面積，分析各組創(chuàng)傷愈合情況。②記錄各組創(chuàng)傷后1、3、7 d的體重及隨機(jī)血糖。③HE染色。第8天，處死大鼠，沿窗口取邊緣約1.0 cm×1.0 cm的皮膚組織，浸泡在40.0%甲醛溶液固定，常規(guī)石蠟切片，行HE染色。④Western印跡測(cè)定PI3K/Akt/HIF-1α信號(hào)通路蛋白。取約15 g皮膚勻漿裂解溶液，經(jīng)十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠(SDS-PAGE)電泳后，將蛋白轉(zhuǎn)到聚偏二氟乙烯膜，用封閉液 5%牛血清白蛋白的Tween-20 Tris鹽酸緩沖液(TBST)在室溫封閉2 h，用TBST 1/1 000稀釋兔抗鼠 PI3K、Akt、HIF-1α和β-actin一抗，將膜置于一抗溶液中 4℃過(guò)夜。再將膜取出洗滌后置于TBST1/5 000辣根過(guò)氧化物酶(HRP)的二抗溶液中，4℃反應(yīng) 2 h。洗膜、曝光，以β-actin蛋白為內(nèi)參。

1.6統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS13.0 統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析，計(jì)量資料采用方差分析，計(jì)數(shù)資料采用χ2檢驗(yàn)。

2 結(jié) 果

2.1各組不同時(shí)間皮膚創(chuàng)傷面積比較 隨著時(shí)間的延長(zhǎng)，各組均有不同程度的愈合；與非DM皮膚創(chuàng)傷組比，DM皮膚創(chuàng)傷組愈合最慢(P<0.05)；與DM皮膚創(chuàng)傷組比，弱激光低劑量組創(chuàng)傷后7 d和高劑量組創(chuàng)傷后1、3、7 d愈合明顯(P<0.05)，見(jiàn)表1。

2.2各組不同時(shí)間體重和隨機(jī)血糖的比較 隨著時(shí)間的延長(zhǎng)，各組體重具有不同程度的增高。對(duì)照組和非DM皮膚創(chuàng)傷組不同時(shí)間的體重和隨機(jī)血糖差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；DM皮膚創(chuàng)傷組、弱激光低和高劑量組不同時(shí)間的體重和隨機(jī)血糖差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；與對(duì)照組和非DM皮膚創(chuàng)傷組比，DM皮膚創(chuàng)傷組、弱激光低和高劑量組的體重明顯降低(P<0.05)，隨機(jī)血糖明顯增高(P<0.05)，見(jiàn)表2。

表1 各組不同時(shí)間皮膚創(chuàng)傷面積比較

與對(duì)照組比較：1)P<0.05，與非DM皮膚創(chuàng)傷組比較：2)P<0.05，與DM皮膚創(chuàng)傷組比較：3)P<0.05；下表同

表2 各組不同時(shí)間體重和隨機(jī)血糖的比較

2.3各組皮膚HE染色 對(duì)照組皮膚肌細(xì)胞排列整齊，非DM皮膚創(chuàng)傷組、DM皮膚創(chuàng)傷組和弱激光低劑量組均存在不同程度的橫紋肌壞死、肌纖維斷裂和明顯的嗜中性粒細(xì)胞浸潤(rùn)，其中DM皮膚創(chuàng)傷組最嚴(yán)重，其次非DM皮膚創(chuàng)傷組和弱激光低劑量組，弱激光高劑量組恢復(fù)較好，僅存少量肌纖維斷裂。見(jiàn)圖1。

2.4各組皮膚PI3K/Akt/HIF-1α信號(hào)通路蛋白表達(dá) 對(duì)照組和DM皮膚創(chuàng)傷組PI3K、 Akt和 HIF-1α均呈弱表達(dá)，非DM皮膚創(chuàng)傷組PI3K、 Akt和 HIF-1α均呈強(qiáng)表達(dá)，與DM皮膚創(chuàng)傷組比，弱激光低和高劑量組PI3K、 Akt和 HIF-1α的表達(dá)均較強(qiáng)(P<0.05)，見(jiàn)圖2和表3。

圖1 各組皮膚HE染色(×100)

1.對(duì)照組，2.非DM皮膚創(chuàng)傷組，3.DM皮膚創(chuàng)傷組，4.弱激光低劑量組，5.弱激光高劑量組 圖2 各組皮膚 PI3K/Akt-HIF-1α信號(hào)通路蛋白表達(dá)

表3 各組皮膚 PI3K/Akt /HIF-1α信號(hào)通路蛋白表達(dá)

3 討 論

PI3K由一個(gè)調(diào)節(jié)亞基p85和一個(gè)催化亞基p110組成，主要功能使磷酸酰肌醇4,5-二磷酸磷酸化成第二信使磷脂酰肌醇3,4,5-三磷酸。在生長(zhǎng)因素和(或)營(yíng)養(yǎng)信號(hào)刺激下，PI3K作為上游激酶，磷酸化 Akt 位點(diǎn)，被激活的Akt 可抑制周期蛋白 D1降解，加快細(xì)胞周期G1/S1轉(zhuǎn)換，促進(jìn)增殖相關(guān)基因mRNA轉(zhuǎn)錄。PI3K/Akt 信號(hào)通路激活可促進(jìn)血管內(nèi)皮祖細(xì)胞歸巢至缺血組織，促進(jìn)血管再生，Akt敲除動(dòng)物模型心血管系統(tǒng)因缺乏周細(xì)胞募集可導(dǎo)致層黏連蛋白沉積減少，血管基底膜變薄及血管成熟度降低。類(lèi)似地，PI3K/AKT信號(hào)通路也可被PI3K抑制劑、ATP拮抗劑及二甲雙胍等阻斷，進(jìn)而影響細(xì)胞增殖、擴(kuò)散和血管生成等過(guò)程。本研究結(jié)果提示DM創(chuàng)傷皮膚的PI3K/Akt 信號(hào)通路處于受抑制狀態(tài)，血管內(nèi)皮祖細(xì)胞難以運(yùn)送至缺血組織，血管再生困難，該結(jié)果與文獻(xiàn)報(bào)道類(lèi)似〔6～8〕。

PI3K/Akt 信號(hào)通路激活可活化HIF-1α表達(dá)相關(guān)的mRNA翻譯活化，上調(diào)HIF-1α表達(dá)。血管生成或再生是創(chuàng)面愈合的關(guān)鍵因素，血管可輸送營(yíng)養(yǎng)與氧氣至創(chuàng)面，同時(shí)攜帶炎癥細(xì)胞與干細(xì)胞至創(chuàng)面。血管生成主要由低氧誘導(dǎo)，HIF-1α在調(diào)節(jié)細(xì)胞對(duì)低氧的反應(yīng)，創(chuàng)面血管新生中起關(guān)鍵作用，包括內(nèi)皮細(xì)胞活化、遷移和擴(kuò)增，血管平滑肌細(xì)胞遷移和擴(kuò)增，骨髓源性的成血管細(xì)胞動(dòng)員、分化和擴(kuò)增及基質(zhì)重塑;調(diào)節(jié)特定的干細(xì)胞效應(yīng)器。因?yàn)镈M的創(chuàng)面微循環(huán)明顯受損，連帶內(nèi)皮細(xì)胞的功能也受損〔8,9〕。

激光照射到皮膚組織，在皮膚組織內(nèi)發(fā)生散射和吸收。本課題提示弱激光對(duì)血糖無(wú)明顯作用。但大鼠皮膚的PI3K、Akt和HIF-1α蛋白表達(dá)均有明顯提高，該結(jié)果與皮膚愈合、HE病理數(shù)據(jù)相吻合，且存在劑量依賴(lài)性關(guān)系，提示弱激光對(duì)DM性創(chuàng)傷有促進(jìn)愈合的作用，其作用機(jī)制與激活PI3K/Akt-HIF-1α信號(hào)系統(tǒng)密切相關(guān)。文獻(xiàn)也顯示弱激光的作用靶點(diǎn)較多〔10～12〕：①能夠明顯減輕創(chuàng)傷的炎癥反應(yīng)，加快成纖維細(xì)胞的增殖，促進(jìn)膠原蛋白合成；②促進(jìn)上皮細(xì)胞及毛細(xì)血管再生；③調(diào)整整體免疫系統(tǒng)，提高酶活性，增強(qiáng)脂質(zhì)過(guò)氧化作用。上述促進(jìn)愈合的機(jī)制均與激活PI3K/Akt-HIF-1α信號(hào)通路存在直接或間接的關(guān)聯(lián)。

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