李琨琨 吳慧麗

(鄭州大學(xué)附屬鄭州中心醫(yī)院消化內(nèi)科，河南 鄭州 450007)

常見的治療結(jié)腸癌方法有手術(shù)治療、放療及化療，由于結(jié)腸癌具有易轉(zhuǎn)移、易復(fù)發(fā)、早期發(fā)病隱匿等特點(diǎn)，結(jié)腸癌仍然嚴(yán)重威脅人類生命健康〔1～4〕。肝素酶(Hpa)具有降解硫酸肝素多糖的作用，屬于葡萄糖醛酸內(nèi)切酶，而硫酸肝素多糖是血管基質(zhì)和細(xì)胞外基質(zhì)的主要成分之一，在腫瘤轉(zhuǎn)移過程中發(fā)揮促進(jìn)作用〔5〕。近年研究表明，OGT2115是Hpa的特異性抑制劑，能夠抑制膽囊癌、乳腺癌等轉(zhuǎn)移和侵襲〔6，7〕。目前OGT2115對結(jié)腸癌細(xì)胞遷移和侵襲能力的影響尚不清楚。本研究以結(jié)腸癌細(xì)胞為研究對象，通過噻唑藍(lán)(MTT)法、細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)、Transwell小室等實(shí)驗(yàn)技術(shù)手段探討Hpa抑制劑OGT2115對結(jié)腸癌細(xì)胞遷移和侵襲能力的影響。

1 材料與方法

1.1材料 結(jié)腸癌細(xì)胞SW480購自鄭州大學(xué)，基質(zhì)金屬蛋白酶(MMP)-2多克隆抗體、MMP-9多克隆抗體、甘油醛-3-磷酸脫氫酶(GAPDH)單多克隆抗體和辣根過氧化物酶(HRP)標(biāo)記的二抗均購自美國Proteintech公司；二喹啉甲酸(BCA)蛋白濃度檢測試劑盒購自北京天根公司；胎牛血清、RPMI1640、胰蛋白酶均購自美國Gibco；肝素酶抑制劑OGT2115購自美國Tocris Bioscience；Hpa活性檢測試劑盒購自上海紀(jì)寧實(shí)業(yè)。

1.2細(xì)胞培養(yǎng) 取出保存在液氮中的SW48細(xì)胞，在37℃的水浴中融化，加入細(xì)胞培養(yǎng)液(含有10%胎牛血清，100 U/ml青霉素，0.1 mg/ml鏈霉素的RPMI1640)，1 000 r/min離心10 min，棄上清，加入細(xì)胞培養(yǎng)液懸浮細(xì)胞，接種到細(xì)胞培養(yǎng)瓶中，放在37℃，5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。待細(xì)胞融合度達(dá)到90%，吸除細(xì)胞培養(yǎng)液，加入0.25%的胰蛋白酶，消化2 min，1 000 r/min離心10 min，棄上清，加入細(xì)胞培養(yǎng)液，根據(jù)實(shí)驗(yàn)要求按照不同比例接種到細(xì)胞瓶中繼續(xù)培養(yǎng)。

1.3MTT檢測細(xì)胞增殖 取培養(yǎng)至對數(shù)期的SW480細(xì)胞，按照每孔加入4 000個細(xì)胞種植于96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，觀察細(xì)胞貼壁后，將原來的細(xì)胞培養(yǎng)液吸除后，加入含有Hpa抑制劑OGT2115終濃度為0、1.0、2.0、4.0、8.0 μmol/L的細(xì)胞培養(yǎng)液，每個濃度梯度設(shè)置5個復(fù)孔。培養(yǎng)48 h后，在每個孔中加入MTT溶液20 μl(5 mg/ml)，孵育4 h后，將上清液吸除后，每孔加入150 μl的二甲基亞砜溶液，混勻10 min。酶標(biāo)儀檢測570 nm的光密度值(OD值)，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，取均值。

1.4實(shí)驗(yàn)分組 SW480細(xì)胞分為對照組和實(shí)驗(yàn)組，對照組細(xì)胞不含肝素酶抑制劑OGT2115的細(xì)胞培養(yǎng)液培養(yǎng)，實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞用含有6 μmol/L Hpa抑制劑OGT2115的細(xì)胞培養(yǎng)液培養(yǎng)。

1.5細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)檢測細(xì)胞遷移 實(shí)驗(yàn)開始前，用記號筆在6孔細(xì)胞培養(yǎng)板的背面每間隔0.5 cm進(jìn)行劃線。將培養(yǎng)至對數(shù)期的SW480細(xì)胞以每孔加入3×105個細(xì)胞接種至6孔細(xì)胞培養(yǎng)板，觀察細(xì)胞融合度達(dá)到90%時，棄去細(xì)胞培養(yǎng)液，用移液槍槍頭沿著標(biāo)記的線劃線，用磷酸鹽緩沖液(PBS)將劃下的細(xì)胞洗掉，按照對照組和實(shí)驗(yàn)組分組方法分別加入含有0、6 μmol/L OGT2115的不含胎牛血清的細(xì)胞培養(yǎng)液，繼續(xù)培養(yǎng)48 h。記錄0 h劃痕寬度和48 h劃痕寬度，計(jì)算細(xì)胞遷移率，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，取均值。細(xì)胞遷移率=100%×(0 h劃痕寬度-48 h劃痕寬度)/0 h劃痕寬度。

1.6Transwell小室檢測細(xì)胞侵襲 取Matrigel膠與冰預(yù)冷的RPMI1640以1∶8的比例混合，每孔加入50 μl包被Transwell小室。取培養(yǎng)至對數(shù)期的SW480細(xì)胞，用胰蛋白酶消化后，1 000 r/min離心10 min，棄上清，按照對照組和實(shí)驗(yàn)組分組方法加入含有0、6 μmol/L OGT2115的不含有胎牛血清的細(xì)胞培養(yǎng)液懸浮細(xì)胞(濃度為2×105個/ml)，取200 μl加入小室的上室，在外室的24孔板中加入500 μl含有10%胎牛血清的細(xì)胞培養(yǎng)液，每組設(shè)置4個復(fù)孔，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。培養(yǎng)48 h后，將小室取出，用90%的乙醇溶液固定10 min，用PBS洗滌后，1%的結(jié)晶紫染色后，在顯微鏡下隨機(jī)選擇5個視野，計(jì)算侵襲細(xì)胞數(shù)目。

1.7酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)檢測Hpa活性 對照組和實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞按照1.4方法培養(yǎng)48 h后，收集培養(yǎng)液上清，用ELISA試劑盒檢測培養(yǎng)液上清Hpa活性，計(jì)算Hpa活性變化的百分率，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，取均值。

1.8Western印跡檢測MMP-2、MMP-9表達(dá) 對照組和實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞按照1.4中方法培養(yǎng)48 h后，按照細(xì)胞蛋白提取試劑盒提取細(xì)胞中的總蛋白。BCA蛋白濃度檢測試劑盒檢測蛋白濃度，取蛋白樣品與4倍上樣緩沖液按照3∶1的比例混合煮沸5 min。加入聚丙烯酰胺凝膠電泳上樣孔中，每孔加入50 μg的變性蛋白樣品。80 V電壓電泳30 min后，觀察溴酚藍(lán)進(jìn)入分離膠和濃縮膠的邊緣時，調(diào)整為120 V電壓繼續(xù)電泳至結(jié)束。轉(zhuǎn)膜：90 mA，4℃轉(zhuǎn)膜70 min。封閉：5%脫脂奶粉封閉，37℃孵育2 h。一抗結(jié)合：800倍稀釋，4℃，過夜。二抗結(jié)合：1 500倍稀釋，37℃孵育1 h。滴加顯色液，曝光，以GAPDH為內(nèi)參，分析蛋白表達(dá)水平，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，取均值。

1.9統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS22.0軟件進(jìn)行單因素方差分析及t檢驗(yàn)。

2 結(jié) 果

2.1細(xì)胞增殖檢測結(jié)果 0、1.0、2.0、4.0、8.0 μmol/L Hpa抑制劑OGT2115作用后細(xì)胞OD值依：1.39±0.11、1.10±0.05、0.91±0.08、0.71±0.05、0.56±0.04。其半數(shù)抑制濃度為(5.82±0.34)μmol/L。Hpa抑制劑OGT2115能夠呈濃度依賴的抑制結(jié)腸癌細(xì)胞增殖活力(P<0.05)。

2.2細(xì)胞遷移檢測結(jié)果 圖1所示，實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞遷移率〔(25.11±1.32)%〕明顯低于對照組〔(46.84±3.54)%〕，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=9.962，P=0.001)，說明Hpa抑制劑OGT2115能夠降低結(jié)腸癌細(xì)胞遷移能力。

2.3細(xì)胞侵襲檢測結(jié)果 圖2所示，實(shí)驗(yàn)組侵襲細(xì)胞數(shù)目〔(96.87±8.26)個〕明顯低于對照組〔(153.24±11.84)個〕，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=6.763，P=0.003)，說明Hpa抑制劑OGT2115能夠降低結(jié)腸癌細(xì)胞侵襲能力。

圖1 劃痕實(shí)驗(yàn)檢測細(xì)胞遷移率(×20)

圖2 Transwell實(shí)驗(yàn)檢測侵襲細(xì)胞(×40)

2.4Hpa活性檢測結(jié)果 實(shí)驗(yàn)組Hpa活性〔(12.05±1.14)%〕明顯低于對照組〔(26.35±1.58)%〕，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=12.713，P=0.000)，說明Hpa抑制劑OGT2115能夠降低結(jié)腸癌細(xì)胞Hpa活性。

2.5MMP-2、MMP-9表達(dá)檢測結(jié)果 對照組和實(shí)驗(yàn)組MMP-2表達(dá)水平依次為：(0.76±0.08)、(0.25±0.04)，MMP-9表達(dá)水平依次為：(0.78±0.06)、(0.16±0.03)。實(shí)驗(yàn)組MMP-2(0.25±0.04)、MMP-9(0.16±0.03)表達(dá)水平明顯低于對照組〔(0.76±0.08)、(0.78±0.06)〕，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=9.876，P=0.001；t=16.008，P=0.000)，見圖3，表明肝素酶抑制劑能夠降低結(jié)腸癌細(xì)胞中MMP-2、MMP-9的表達(dá)。

圖3 Western印跡檢測MMP-2和MMP-9表達(dá)

3 討 論

腫瘤的轉(zhuǎn)移是一個極為復(fù)雜的過程，腫瘤細(xì)胞從原發(fā)病灶中分離出來以后，進(jìn)入周圍的組織中，穿過基底膜，進(jìn)入淋巴管或者血管中進(jìn)入周圍組織中繼續(xù)增殖形成轉(zhuǎn)移灶〔8～10〕。硫酸肝素多糖是甘氨聚糖家族中的成員之一，含有多個可以被修飾的糖氨殘基，通常情況下其以蛋白聚糖形式存在于細(xì)胞中，而細(xì)胞內(nèi)的多個蛋白聚糖能夠通過共價鍵的形式形成多肽核心〔11〕。纖維蛋白、膠原等在細(xì)胞表面和細(xì)胞基質(zhì)中均廣泛存在，并且在細(xì)胞黏附和特異性結(jié)合過程中發(fā)揮促進(jìn)作用〔12〕。Hpa能夠與硫酸肝素多糖特異性結(jié)合，從而發(fā)揮降解硫酸肝素多糖的作用，影響細(xì)胞的轉(zhuǎn)移〔13〕。OGT2115是一種2，3-二氫-1，3-二氧-1H-異吲哚-5-羧酸化合物，能夠特異性抑制Hpa的活性〔14〕。

近年研究表明，Hpa具有抗腫瘤作用，在腫瘤轉(zhuǎn)移和生長過程中發(fā)揮抑制作用〔15〕。徐錦程等〔16〕的研究表明，0.4～6.4 μmol/L的Hpa抑制劑OGT2115能夠抑制口腔鱗癌細(xì)胞的生長、遷移和侵襲，抑制作用隨著作用濃度的升高而增大。付西峰等〔17〕通過體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，Hpa抑制劑OGT2115能夠降低胰腺癌細(xì)胞遷移率和侵襲細(xì)胞數(shù)目，并且對吉西他濱對胰腺癌的抗遷移和侵襲作用具有協(xié)同作用。這些研究結(jié)果均顯示，Hpa抑制劑OGT2115在腫瘤轉(zhuǎn)移和侵襲過程中發(fā)揮抑制作用。本研究與上述報道結(jié)果相符合，均說明Hpa抑制劑具有抗腫瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)移和侵襲的作用。

癌細(xì)胞的轉(zhuǎn)移過程中，降解細(xì)胞外基質(zhì)成分是關(guān)鍵步驟之一〔18〕。細(xì)胞外基質(zhì)在維持細(xì)胞形態(tài)、細(xì)胞遷移、細(xì)胞分化等過程中發(fā)揮調(diào)控作用。MMP幾乎能夠?qū)⑺屑?xì)胞外基質(zhì)成分降解，在腫瘤細(xì)胞的遷移過程中發(fā)揮破壞組織學(xué)屏障的作用〔19，20〕。MMP-2和MMP-9是基質(zhì)金屬蛋白酶家族的成員之一，屬于明膠酶類，在腫瘤基底膜降解過程中發(fā)揮促進(jìn)作用〔21〕。本研究說明Hpa抑制劑可能通過抑制MMP-2、MMP-9的表達(dá)和Hpa的活性發(fā)揮抗腫瘤轉(zhuǎn)移的作用。

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