厲 菁 袁義強 張 宇 張 華 張傳西 宣學習 王明杰

(鄭州市第七人民醫(yī)院心內科，河南 鄭州 450006)

心肌細胞凋亡是引起各種慢性心力衰竭、心臟功能惡性的主要因素〔1〕。microRNA(miRNA)通過對其靶基因的表達調節(jié)，參與細胞增殖、凋亡、分化等生物學行為，也可參與多種疾病的發(fā)生發(fā)展〔2～4〕。miR-92a是miRNAs家族中的一員，有研究表明，miR-92a在誘導缺血后的組織中表達明顯升高〔5〕，心肌梗死模型中抑制miR-92a的表達可降低心肌梗死面積、改善心肌梗死后重塑和新生血管形成，從而促進心臟功能的恢復〔6〕。關于miR-92a對過氧化氫(H2O2)誘導的心肌細胞增殖凋亡的影響尚未清楚。本研究將miR-92a的抑制物(inhibitor)轉染H2O2誘導的H9C2心肌細胞，檢測心肌細胞的增殖凋亡情況及其作用機制。

1 材料與方法

1.1細胞株及主要試劑和儀器 大鼠心肌細胞H9C2購自中國科學院上海細胞庫；胎牛血清、DMEM培養(yǎng)基均購自美國Hycloneo公司；B細胞淋巴瘤/白血病(Bcl)-2、Bcl-2相關X蛋白(Bax)、β-連環(huán)蛋白(β-catenin)、c-Myc抗體均購自美國Epitmics公司；H2O2、細胞增殖及毒性檢測(CCK8)試劑盒、膜聯(lián)蛋白(Annexin)V-異硫/碘化丙錠(PI)細胞凋亡試劑盒均購自中國碧云天試劑公司；二喹啉甲酸(BCA)試劑盒購自Thermo公司；Trizol、熒光定量-PCR試劑盒均購自日本TAKARA公司；酶標儀購自美國Bio Tek公司；實時熒光定量(RT)-PCR儀購自瑞士Roche；流式細胞儀購自美國Bio-Rad公司。

1.2細胞培養(yǎng) 取出在液氮罐中保存的H9C2心肌細胞，置于37℃水浴鍋中快速融化，用含有10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基，置于37℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。細胞達到80%～90%融合生長時，棄去舊的培養(yǎng)液，磷酸鹽緩沖液(PBS)洗滌細胞3次，胰蛋白酶消化細胞，細胞由梭形變?yōu)閳A形時倒掉胰蛋白酶，加入培養(yǎng)基終止消化。根據(jù)實驗需要傳代。實驗為生長至對數(shù)期的細胞。

1.3實驗分組及細胞轉染 H9C2細胞分為空白對照組、陰性對照組、miR-92a inhibitor組?？瞻讓φ战M不經(jīng)特殊處理，陰性對照組和miR-92a inhibitor組通過LipofectamineTM2000(美國，Invitrogen 公司)轉染至H9C2細胞中，轉染濃度均為200 nm，轉染6 h后換成含有10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基，置于37℃、5% CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)48 h，收集細胞。

1.4RT-PCR檢測H9C2心肌細胞中miR-92a的表達 收集轉染48 h的細胞，利用Trizol法提取細胞中的總RNA，并檢測RNA的純度，逆轉錄為cDNA，以U6作為內參基因，cDNA為模板進行RT-PCR，根據(jù)Ct值，通過2-△△Ct法對miR-92a的表達進行定量分析。實驗重復3次。

1.5CCK8實驗檢測細胞增殖 實驗分為空白對照組、H2O2組(200 μmol/L的H2O2處理細胞6 h)和miR-92a inhibitor+H2O2組(細胞中轉染miR-92a inhibitor，轉染48 h后用200 μmol/L的H2O2處理細胞6 h)。取生長至對數(shù)期的H9C2心肌細胞，以每孔1×104個細胞接種在96孔板中，置于37℃、5% CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)12 h以上，觀察細胞是否貼壁，在貼壁均勻的96孔板中按照上述分組加入至細胞，處理完畢后收集細胞，每孔細胞中加入CCK8試劑10 μl，37℃繼續(xù)培養(yǎng)2 h，震蕩5 min后，酶標儀于570 nm波長處測定吸光度(OD)值。

1.6流式細胞儀檢測細胞凋亡 收集按照1.5分組處理完畢的3組細胞，PBS洗滌細胞3次，胰蛋白酶消化細胞，細胞由梭形變圓時，加入培養(yǎng)基終止消化，將細胞吹打成細胞懸液，離心，棄掉上清，PBS洗滌細胞，再次離心，收集(1～5)×105細胞，加入500 μl結合緩沖液懸浮細胞，在分別加入Annexin V-FITC和PI各5 μl(濃度250 μg/ml)，室溫避光反應5～15 min，在1 h內上流式細胞儀檢測細胞凋亡率。

1.7Bcl-2、Bax、β-catenin、c-Myc蛋白表達檢測 收集按照1.5分組處理完畢的3組細胞，加入裂解液裂解細胞30 min，收集蛋白并用BCA試劑盒測定蛋白濃度，蛋白樣品煮沸變性5 min，上樣，每泳道40 μg蛋白樣品經(jīng)10%十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺(SDS-PAGE)電泳分離1～2 h，后轉至硝酸纖維素膜，5%的脫脂奶粉封閉2 h，4℃孵育Bcl-2、Bax、β-catenin、c-Myc一抗(皆按照1∶1 000稀釋)過夜，次日加入辣根過氧化物酶(HRP)標記的羊抗兔二抗，室溫孵育1 h，增強型化學發(fā)光法(ECL)進行顯色，顯影后采用Gel-Pro analyzer分析各個條帶的光密度，

1.8統(tǒng)計學方法 應用SPSS21.0軟件進行單因素方差分析、t檢驗。

2 結 果

2.1轉染效果檢測 miR-92a inhibitor組miR-92a mRNA表達(0.311±0.021)顯著低于空白對照組(1.000±0.031，P<0.05)，陰性對照組(0.964±0.045)與空白對照組差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。

2.2抑制miR-92a表達對H2O2誘導的H9C2心肌細胞增殖的影響 與空白對照組(OD值，0.43±0.35)比較，H2O2組(0.17±0.18)細胞增殖顯著降低，與H2O2組比較，miR-92a inhibitor+H2O2組(0.30±0.24)顯著升高(均P<0.05)。

2.3抑制miR-92a表達對H2O2誘導的H9C2心肌細胞凋亡的影響 與空白對照組比較，H2O2組細胞凋亡率及Bax蛋白表達均顯著升高，Bcl-2蛋白表達顯著降低(P<0.05)，與H2O2組比較，miR-92a inhibitor+H2O2組細胞凋亡率及Bax蛋白表達均顯著降低，Bcl-2蛋白表達顯著升高(P<0.05)。見表1。

表1 抑制miR-92a表達對H2O2誘導的H9C2心肌細胞凋亡率及Bcl-2和Bax表達的影響

與空白對照組比較：1)P<0.05；與H2O2組比較：2)P<0.05

2.4抑制miR-92a表達對H2O2誘導的H9C2心肌細胞Wnt/β-catenin信號通路的影響 與空白對照組(0.138±0.015，0.105±0.010)比較，H2O2組β-catenin和c-Myc蛋白表達(0.662±0.057，0.341±0.032)均顯著升高(P<0.05)，與H2O2組比較，miR-92a inhibitor+H2O2組(0.357±0.039，0.173±0.019)均顯著降低(P<0.05)。

3 討 論

研究發(fā)現(xiàn)，癌癥、內分泌疾病、心血管疾病等的發(fā)生發(fā)展受到miRNA的調控，心血管疾病氧化損傷也受到miRNA的調控〔7〕。研究發(fā)現(xiàn)，經(jīng)H2O2處理的大鼠心肌細胞中miR-181a表達上調，抑制miR-181a的表達可降低H2O2誘導的心肌細胞的凋亡〔8〕；H2O2處理的大鼠心肌細胞中miR-139表達降低，過表達miR-139可降低H2O2誘導的心肌細胞的凋亡〔9〕。miR-92a是miRNAs家族中的一員，有研究發(fā)現(xiàn)，心肌缺血再灌注損傷可引起細胞內miR-92a的表達升高〔10〕，提示miR-92a的高表達可使心肌缺血再灌注損傷加重，有研究也發(fā)現(xiàn)miR-92a參與了心肌梗死后的心臟重塑〔11〕。細胞凋亡受到細胞內抗凋亡蛋白和促凋亡蛋白的調節(jié)，細胞的凋亡發(fā)生是這兩類相互拮抗的蛋白間失衡的結果。Bcl-2家族在各種刺激引起的細胞凋亡中有關鍵作用，Bax和Bcl-2分別是Bcl-2家族的促凋亡和抑凋亡基因，能通過控制線粒體凋亡通過，誘導細胞的凋亡〔12〕。有研究表明，Bcl-2和Bax表達水平的高低與凋亡調控直接相關，Bcl-2降低，Bax增高，促進細胞凋亡，反之抑制細胞凋亡〔13〕。本研究提示miR-92a可通過調節(jié)Bcl-2和Bax表達影響心肌細胞凋亡。在正常情況下，Wnt信號通路是沉默的，在各種病理狀態(tài)下被激活〔14〕。一項體外研究發(fā)現(xiàn)，在缺血缺氧狀態(tài)下的小鼠心肌組織，Wnt信號通路被過度激活，從而使心肌細胞凋亡增加〔15〕。也有研究發(fā)現(xiàn)，抑制Wnt信號通路可減輕心肌梗死面積，降低心肌細胞凋亡，改善心功能〔16〕。本研究結果提示miR-92a可通過Wnt信號通路影響心肌細胞凋亡。miR-92a可能成為一個潛在的治療心肌疾病的作用靶點。

4 參考文獻

1Barile L,Lionetti V,Cervio E,etal.Extracellular vesicles from human cardiac progenitor cells inhibit cardiomyocyte apoptosis and improve cardiac function after myocardial infarction〔J〕.Cardiovasc Res,2014;103(4):530-41.

2Mao J,Lv Z,Zhuang Y.MicroRNA-23a is involved in tumor necrosis factor-α induced apoptosis in mesenchymal stem cells and myocardial infarction〔J〕.Exp Mol Pathol,2014;97(1):23-30.

3孫啟玉,賈興旺,田亞平.動脈粥樣硬化斑塊鈣化與 microRNA〔J〕.中國老年學雜志,2015;35(16):4724-8.

4García R,Nistal JF,Merino D,etal.p-SMAD2/3 and DICER promote pre-miR-21 processing during pressure overload-associated myocardial remodeling〔J〕.Biochim Biophy Acta,2015;1852(7):1520-30.

5Jiang C,Ji N,Luo G,etal.The effects and mechanism of miR-92a and miR-126 on myocardial apoptosis in mouse ischemia-reperfusion model〔J〕.Cell Biochem Biophys,2014;70(3):1901-6.

6Zhang C,Wu W,Wang C,etal.Expression and function of miR-92a in ventricular remodeling after PCI treatment of acute myocardial infarction〔J〕.Int J Clin Exp Pathol,2017;10(2):1158-65.

7Wronska A,Kurkowska-Jastrzebska I,Santulli G.Application of microRNAs in diagnosis and treatment of cardiovascular disease〔J〕.Acta physiologica,2015;213(1):60-83.

8Zhu J,Yao K,Wang Q,etal.Circulating miR-181a as a potential novel biomarker for diagnosis of acute myocardial infarction〔J〕.Cell Physiol Biochem,2016;40(6):1591-602.

9Yang X,Yu H,Hu H,etal.MiR-139-3p is related to left ventricular hypertrophy and cardiomyocyte apoptosis in two-kidney one-clip hypertensive rats〔J〕.Archiv Biolog Sci,2015;67(2):427-35.

10Wang Y,Men M,Yang W,etal.MiR-31 downregulation protects against cardiac ischemia/reperfusion injury by targeting protein kinase C epsilon (PKCε) directly〔J〕.Cell Physiol Biochem,2015;36(1):179-90.

11Boon RA,Dimmeler S.MicroRNAs in myocardial infarction〔J〕.Nat Rev Cardiol,2015;12(3):135-42.

12顧 萬,趙新閣,張 幸.芒柄花黃素通過調節(jié) Bax 和 Bcl-2 蛋白表達誘導 SKOV3 細胞凋亡〔J〕.四川生理科學雜志,2014;36(2):60-2.

13Al-Fatlawi AA,Al-Fatlawi AA,Irshad M,etal.Rice bran phytic acid induced apoptosis through regulation of Bcl-2/Bax and p53 genes in HepG2 human hepatocellular carcinoma cells〔J〕.Asian Pac J Cancer Prev,2014;15(8):3731-6.

14季 紅,高 青,胡先同,等.經(jīng)典 Wnt 信號通路在心肌細胞分化作用的研究進展〔J〕.天津中醫(yī)藥大學學報,2014;33(4):246-8.

15Huang HM,Huang CC,Wang FS,etal.Activating the Wnt/β-catenin pathway did not protect immature retina from hypoxic〔J〕.Invest Ophthalmol,2015;56(8):4300-8.

16Yu H,Zhao XX,Shan XH,etal.Effect of thioredoxin-interacting protein on Wnt/β-catenin signaling pathway and diabetic myocardial infarction〔J〕.Asian Pacific J,2015;8(11):976-82.