臧玉柱 于潤(rùn)紅 白炎亮 李玉龍 陳玉清 張 茵 孫 愷

(河南省人民醫(yī)院血液科，河南 鄭州 450003)

急性T淋巴細(xì)胞白血病是白血病中較為常見的一種，目前尚沒有特異性的治療手段，患者經(jīng)過(guò)造血干細(xì)胞移植和化療后，5年的生存率仍然不高于40%〔1,2〕。第10號(hào)染色體同源缺失性磷酸酶-張力蛋白(PTEN)是一種具有磷酸酶活性的抑制癌癥發(fā)生的基因，能夠誘導(dǎo)多種癌細(xì)胞凋亡，對(duì)于癌細(xì)胞的生長(zhǎng)、轉(zhuǎn)移等也具有調(diào)控作用〔3,4〕。有研究表明，PTEN在白血病細(xì)胞中低表達(dá)，并且能夠調(diào)控白血病細(xì)胞侵襲能力和血管新生能力〔5〕。本研究旨在探討PTEN對(duì)急性T淋巴細(xì)胞白血病細(xì)胞生長(zhǎng)和凋亡的影響。

1 材料與方法

1.1材料 PTEN過(guò)表達(dá)載體(pEGFP-PTEN)和對(duì)照空載體(pEGFP)由河南省人民醫(yī)院病理實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建并保存。PTEN、甘油醛-3-磷酸脫氫酶(GAPDH)引物均由南京金斯瑞生物科技有限公司合成。Lipofectamine2000為美國(guó)Invitrogen公司產(chǎn)品；胎牛血清、RPMI1640培養(yǎng)基均為美國(guó)Gibco公司產(chǎn)品；二喹啉甲酸(BCA)蛋白定量試劑盒為美國(guó)Thermo公司產(chǎn)品；碘化丙啶(PI)、膜聯(lián)蛋白(V-FITC)、噻唑藍(lán)(MTT)、二氯二氫熒光素-乙酰乙酸酯(DCFH-DA)均為美國(guó)Sigma公司產(chǎn)品；PTEN單克隆抗體為美國(guó)millipore公司產(chǎn)品；β-連環(huán)蛋白(β-catenin)單克隆抗體、c-myc單克隆抗體、活化的含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶(酶切Caspase)-3單克隆抗體均為美國(guó)ABGENT公司產(chǎn)品。

1.2細(xì)胞培養(yǎng) 急性T淋巴細(xì)胞白血病細(xì)胞Jurkat購(gòu)自中科院細(xì)胞庫(kù)。將保存于液氮中的Jurkat細(xì)胞在37℃融化后，加入10%胎牛血清的RPMI1640細(xì)胞培養(yǎng)液，800 r/min離心10 min，吸除上清液，用3 ml的細(xì)胞培養(yǎng)液懸浮后，種植于細(xì)胞培養(yǎng)瓶中，在37℃，飽和濕度，5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。每隔3 d更換1次細(xì)胞培養(yǎng)液。

1.3細(xì)胞轉(zhuǎn)染及分組 Jurkat細(xì)胞培養(yǎng)至對(duì)數(shù)期后，以2×105個(gè)細(xì)胞/ml種植到6孔板中，用Lipofectamine 2000轉(zhuǎn)染試劑將pEGFP-PTEN和pEGFP轉(zhuǎn)染至Jurkat細(xì)胞中，在轉(zhuǎn)染前1 h用不含血清的細(xì)胞培養(yǎng)液培養(yǎng)細(xì)胞，以提高轉(zhuǎn)染效率，轉(zhuǎn)染pEGFP-PTEN和pEGFP的Jurkat細(xì)胞為pEGFP-PTEN組和pEGFP組，不做轉(zhuǎn)染的Jurkat細(xì)胞為對(duì)照組。

1.4RT-PCR檢測(cè)轉(zhuǎn)染效果 3組細(xì)胞培養(yǎng)48 h后，收集細(xì)胞，按照每106個(gè)細(xì)胞加入1 ml Trizol裂解細(xì)胞。加入200 μl氯仿，充分混合，15 s后，靜置3 min。4℃，12 000 r/min離心20 min。取400 μl上層水相溶液，加入500 μl異丙醇混合后，室溫靜置10 min。4℃，12 000 r/min離心20 min，吸除上清液，用75%乙醇溶液洗滌RNA沉淀2次后，用紫外分光光度計(jì)檢測(cè)提取的RNA濃度及純度(OD260/OD280介于1.8～2.0之間)。提取的RNA進(jìn)行RT-PCR。程序?yàn)椋旱谝浑A段1個(gè)循環(huán)(95℃預(yù)變性2 min)，第二階段共40個(gè)循環(huán)(95℃，15 s；60℃，1 min；72℃，2 min)，第三階段1個(gè)循環(huán)(72℃總延伸5 min)。以2-△△Ct法計(jì)算PTEN mRNA水平，內(nèi)參基因?yàn)镚APDH。PTEN上游引物5′-GGGGTGGAACTGTGCACTAA-3′，下游引物5′-TAGGCTTTGAAGGACAGCAGG-3′。GAPDH上游引物5′-CGTCCTCGGATTCTCTGCTC-3′，下游引物5′-GCTGGTGCATTTTCGGTTGT-3′，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，取均值。

1.5Western印跡檢測(cè)轉(zhuǎn)染效果 3組細(xì)胞培養(yǎng)48 h后，1 000 r/min離心10 min，棄上清液，加入裂解液，超聲2次，每次10 s，8 000 r/min離心10 min，吸取蛋白上清液，用BCA法對(duì)蛋白進(jìn)行定量檢測(cè)。配置10%分離膠和4%濃縮膠。將蛋白樣品與上樣緩沖液混合煮沸變性后，按照每孔50 μg的變性蛋白加入到上樣孔中，90 V恒壓電泳。135 mA轉(zhuǎn)膜1 h。5%脫脂奶粉在室溫封閉1 h后，進(jìn)行一抗(1∶1 000倍稀釋，4℃過(guò)夜)、二抗(1∶2 000倍稀釋，室溫1 h)孵育后，顯色，顯影后，用目的蛋白灰度值與GAPDH灰度值表示目的蛋白水平，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，取均值。

1.6MTT檢測(cè)細(xì)胞增殖 3組細(xì)胞培養(yǎng)至對(duì)數(shù)期后，以每孔加入3 000個(gè)細(xì)胞種植于96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，每孔中加入100 μl的細(xì)胞懸浮液，培養(yǎng)48 h后，每孔中加入20 μl MTT溶液，MTT濃度為5 mg/ml，在37℃孵育4 h。吸除上清液，加入150 μl二甲基亞砜溶液，反應(yīng)10 min。酶標(biāo)儀檢測(cè)每孔490 nm的光密度值(OD值)，用不加細(xì)胞只加入等量細(xì)胞培養(yǎng)液的孔調(diào)零后，用轉(zhuǎn)染后的細(xì)胞OD值占對(duì)照組細(xì)胞OD值百分比表示細(xì)胞存活率，每組設(shè)置5個(gè)復(fù)孔，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，取均值。

1.7流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡 3組細(xì)胞培養(yǎng)48 h后，收集106個(gè)細(xì)胞，用提前預(yù)冷的磷酸鹽緩沖液(PBS)重懸細(xì)胞2次后，加入結(jié)合緩沖液混合后，依次加入5 μl PI和5 μl Annexin V-FITC，在室溫避光環(huán)境反應(yīng)15 min，混勻后，加入200 μl結(jié)合緩沖液，在60 min內(nèi)用流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡。

1.8DCFH-DA法檢測(cè)ROS水平 3組細(xì)胞培養(yǎng)48 h后，收集各組細(xì)胞，用400 μl PBS重懸細(xì)胞，加入2 μl DCFH-DA，在4℃孵育15 min后，檢測(cè)其熒光強(qiáng)度，發(fā)射波長(zhǎng)525 nm，激發(fā)波長(zhǎng)488 nm，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，取均值，以轉(zhuǎn)染后的細(xì)胞熒光強(qiáng)度與對(duì)照組細(xì)胞熒光強(qiáng)度的比值表示ROS水平。

1.9Western印跡檢測(cè)β-catenin、c-myc、酶切Caspase-3蛋白表達(dá) 3組細(xì)胞培養(yǎng)48 h后，提取細(xì)胞蛋白，Western印跡檢測(cè)β-catenin、c-myc、酶切Caspase-3蛋白水平，步驟參照1.5，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，取均值。

1.10統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS22.0軟件進(jìn)行t檢驗(yàn)。

2 結(jié) 果

2.1轉(zhuǎn)染后細(xì)胞中PTEN表達(dá) 對(duì)照組和pEGFP組PTEN mRNA和蛋白水平差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，pEGFP-PTEN組均明顯高于對(duì)照組(P<0.05)。見表1，圖1。

圖1 Western印跡檢測(cè)轉(zhuǎn)染后細(xì)胞中PTEN蛋白表達(dá)

表1 3組PTEN mRNA及蛋白表達(dá)水平比較

與對(duì)照組比較：1)P<0.05，下表同

2.2細(xì)胞增殖檢測(cè)結(jié)果 對(duì)照組和pEGFP組細(xì)胞存活率〔(100.00±10.36)%，(100.15±11.97)%〕差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。pEGFP-PTEN組〔(65.84±7.59)%〕明顯低于對(duì)照組(P<0.05)。

2.3細(xì)胞凋亡檢測(cè)結(jié)果 對(duì)照組和pEGFP組細(xì)胞凋亡率〔(7.69±0.98)%，(7.84±1.32)%〕差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，pEGFP-PTEN組〔(26.93±2.45)%〕明顯高于對(duì)照組(P<0.05)。

2.4ROS檢測(cè)結(jié)果 對(duì)照組和pEGFP組ROS水平(1.00±0.13，1.03±0.08)差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，pEGFP-PTEN組(2.95±0.24)明顯高于對(duì)照組(P<0.05)。

2.5β-catenin、c-myc、酶切Caspase-3表達(dá)檢測(cè)結(jié)果 對(duì)照組和pEGFP組β-catenin、c-myc、酶切Caspase-3水平差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，pEGFP-PTEN組β-catenin、c-myc水平均明顯低于對(duì)照組，而酶切Caspase-3水平高于對(duì)照組(P<0.05)。見圖2，表2。

圖2 Western印跡檢測(cè)β-catenin、c-myc、酶切Caspase-3蛋白表達(dá)

表2 3組β-catenin、c-myc、酶切Caspase-3水平比較

3 討 論

PTEN基因定位于10q23.3，其編碼的蛋白質(zhì)由403個(gè)氨基酸組成，在人體內(nèi)的多種組織和器官中均廣泛表達(dá)，是一種抑癌基因〔6,7〕。PTEN具有維持免疫系統(tǒng)穩(wěn)定、胚胎發(fā)育、抑制血管新生等作用，對(duì)于細(xì)胞的增殖能力也具有抑制作用〔8〕。有研究表明，PTEN mRNA和蛋白在子宮內(nèi)膜癌、肺癌、肝癌、腎透明細(xì)胞癌、皮膚鱗狀細(xì)胞癌等癌組織中表達(dá)下調(diào)，過(guò)表達(dá)PTEN后癌細(xì)胞的生長(zhǎng)受到抑制〔9～12〕。Nuciforo等〔13〕研究表明，PTEN能夠調(diào)控乳腺癌細(xì)胞的凋亡。鄒志建〔14〕檢測(cè)了103例慢性淋巴細(xì)胞白血病患者中PTEN的表達(dá)發(fā)現(xiàn)，PTEN在T淋巴細(xì)胞白血病患者中表達(dá)下調(diào)。以上研究結(jié)果均表明，PTEN參與癌癥的發(fā)生過(guò)程。本研究結(jié)果提示，PTEN能夠調(diào)控急性T淋巴細(xì)胞白血病細(xì)胞的增殖和凋亡，發(fā)揮抑癌基因的作用。

細(xì)胞凋亡的發(fā)生與細(xì)胞內(nèi)多種基因的調(diào)控有關(guān)，是一個(gè)極為復(fù)雜而嚴(yán)格的過(guò)程。Caspase蛋白家族是細(xì)胞凋亡的重要調(diào)控因子，當(dāng)?shù)蛲鲂盘?hào)發(fā)出時(shí)，細(xì)胞Caspase級(jí)聯(lián)反應(yīng)被激活，最終使Caspase-3活化生成酶切Caspase-3從而發(fā)揮凋亡執(zhí)行的作用，而Caspase-3的活化是細(xì)胞凋亡進(jìn)入不可逆階段的標(biāo)志〔15〕。ROS參與細(xì)胞內(nèi)多種信號(hào)通路的傳導(dǎo)，與細(xì)胞的生長(zhǎng)和凋亡有關(guān)，當(dāng)細(xì)胞內(nèi)ROS水平異常升高時(shí)，細(xì)胞凋亡增加〔16〕。董瑞紅等〔17〕研究表明，吳茱萸堿能夠通過(guò)促進(jìn)白血病細(xì)胞中ROS水平升高和上調(diào)酶切Caspase-3的水平誘導(dǎo)白血病細(xì)胞的凋亡。Xu等〔18〕研究表明，Disulfiram作用后的白血病細(xì)胞中ROS水平升高2.8倍，細(xì)胞凋亡率高達(dá)27%。這些研究結(jié)果均表明，細(xì)胞中ROS、Caspase-3參與白血病細(xì)胞的生長(zhǎng)和凋亡。提示，PTEN可能通過(guò)作用于ROS水平和酶切Caspase-3的表達(dá)影響急性T淋巴細(xì)胞白血病細(xì)胞的生長(zhǎng)和凋亡。

Wnt信號(hào)通路參與細(xì)胞的生長(zhǎng)和凋亡，其激活后β-catenin表達(dá)上調(diào)，下游靶基因c-myc水平升高〔19〕。Wnt信號(hào)通路與白血病的發(fā)生有關(guān)，通過(guò)RNA干擾技術(shù)抑制Wnt信號(hào)通路激活后，白血病細(xì)胞的凋亡增加〔20,21〕。本研究結(jié)果提示，PTEN可能通過(guò)抑制Wnt信號(hào)通路的激活促進(jìn)急性T淋巴細(xì)胞白血病細(xì)胞的增殖，促進(jìn)人急性T淋巴細(xì)胞血病細(xì)胞凋亡。綜上，PTEN能夠促進(jìn)急性T淋巴細(xì)胞白血病細(xì)胞凋亡，抑制急性T淋巴細(xì)胞白血病細(xì)胞增殖，ROS和Wnt信號(hào)通路可能是其作用機(jī)制之一。

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