李建民 王麗萍 白偉良

(青海大學(xué)附屬醫(yī)院耳鼻喉科，青海 西寧 810001)

鼻咽癌是常見的呼吸系統(tǒng)惡性腫瘤疾病之一，是侵襲性較強(qiáng)的頭頸部惡性腫瘤，極易發(fā)生淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及肝肺等遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移，影響患者全身多處器官，可嚴(yán)重影響患者的健康和生存質(zhì)量，甚至引發(fā)死亡等不良預(yù)后的發(fā)生〔1～3〕。趨化因子(CCL)是可趨化細(xì)胞定向移動(dòng)的小分子肽，其中的CCL17是與免疫微環(huán)境密切相關(guān)的因子，CCL可通過與CCL4結(jié)合而引發(fā)分子構(gòu)象的改變，導(dǎo)致細(xì)胞外的鈣離子內(nèi)流和細(xì)胞貯存的鈣離子釋放，引發(fā)細(xì)胞質(zhì)內(nèi)鈣離子濃度的明顯增加，引發(fā)靶細(xì)胞反應(yīng)，從而參與白細(xì)胞的遷移并起到調(diào)節(jié)炎癥和調(diào)節(jié)免疫細(xì)胞分化的作用，促進(jìn)血管重塑〔4～6〕。因此，趨化因子17亦可能是與鼻咽癌等腫瘤血管生成、侵襲轉(zhuǎn)移及分化等相關(guān)的因子。本研究探討CCL17對(duì)人鼻咽癌肝細(xì)胞轉(zhuǎn)移分化能力的影響。

1 材料和方法

1.1對(duì)象 2015年1月至2016年1月20例青海大學(xué)附屬醫(yī)院鼻咽癌手術(shù)切除所得的鼻咽癌組織，病例均經(jīng)術(shù)后病理學(xué)檢查證實(shí)為鼻咽癌，術(shù)前未經(jīng)放化療等相關(guān)抗腫瘤治療，實(shí)驗(yàn)標(biāo)本的利用均已獲得患者本人或其委托人的知情同意。進(jìn)行鼻咽癌組織細(xì)胞的培養(yǎng)傳代及鼻咽癌干細(xì)胞的分選富集，獲得20例鼻咽癌干細(xì)胞。其中男12例，女8例，年齡26～75歲，平均(54.66±5.78)歲，26～59歲6例，60～75歲14例。

1.2試劑和儀器 恒溫箱(江蘇佳美儀器有限公司)、流式細(xì)胞儀(德國(guó)Partec公司)、離心管、玻璃瓶、吸管、試管等(廣東東普醫(yī)療科技有限公司)、改良杜氏伊格爾培養(yǎng)基(DMEM)/F12培養(yǎng)基和胎牛血清(美國(guó)Gibco公司)、RNA提取試劑盒(德國(guó)Qiagen公司)、逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(美國(guó)Promega公司)、實(shí)時(shí)定量(RT)-聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)試劑盒和SYBR Premix EX Taq(日本Takara公司)、倒置相差顯微鏡、熒光顯微鏡(日本Nikon公司)、脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染液 LipofectamineTM轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β1(美國(guó)Invitrogen 公司)、凝膠成像系統(tǒng)(美國(guó)Bio-Rad公司)、堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子(美國(guó)Invitrogen 公司)、潑尼松、胰島素、β甘油磷酸鈉、維生素C、3-異丁基-1-甲級(jí)黃嘌呤、吲哚美辛(美國(guó)Sigma 公司)、醫(yī)用恒溫水浴箱(美國(guó)SHELLAB公司)。

1.3細(xì)胞復(fù)蘇 實(shí)驗(yàn)器具紫外線照射1 h后將需復(fù)蘇的細(xì)胞迅速放入37℃水浴箱中，搖晃使固態(tài)細(xì)胞融化，1 200 r/min離心5 min，棄去上清液，加入1 ml細(xì)胞培養(yǎng)液，移入培養(yǎng)瓶中，補(bǔ)充細(xì)胞培養(yǎng)液至5 ml，輕晃使細(xì)胞均勻分布，將培養(yǎng)瓶置于37℃、5%CO2恒溫箱中培養(yǎng)。

1.4細(xì)胞傳代培養(yǎng) 細(xì)胞融合度達(dá)到80%以上時(shí)采用磷酸鹽緩沖液(PBS)清洗細(xì)胞3次，去除殘留血清，加入0.25%的胰酶1 ml消化至細(xì)胞變小且細(xì)胞間隙變寬，棄去胰酶并加入15 ml的細(xì)胞培養(yǎng)液，混勻，均分于3個(gè)培養(yǎng)瓶中進(jìn)行培養(yǎng)。將細(xì)胞再次進(jìn)行消化離心，加入細(xì)胞凍存液1.5 ml移入冷凍管中，液氮保存。

1.5鼻咽癌干細(xì)胞得分選富集 癌細(xì)胞無血清懸浮培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期,胰酶消化,制備成單細(xì)胞懸液，進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)，調(diào)整細(xì)胞密度，采用流式細(xì)胞儀分選p75NTR+細(xì)胞(鼻咽癌干細(xì)胞)。

1.6CCL17轉(zhuǎn)染 將鼻咽癌肝細(xì)胞放入培養(yǎng)皿中并觀察鼻咽癌干細(xì)胞，取生長(zhǎng)狀態(tài)良好的鼻咽癌干細(xì)胞鋪于2個(gè)6孔板中，至細(xì)胞融合度達(dá)到80%左右時(shí)向其中一個(gè)6孔板各孔添加預(yù)先配置的脂質(zhì)體Lipofectamine20005 μl和CCL17 3.75 μl無血清RPMI1640培養(yǎng)液各孔均添加2 ml，將化學(xué)合成的CCL17(序列為：5'-GGGACTGCTGCCTGGAGTAC-3')瞬時(shí)轉(zhuǎn)染鼻咽癌干細(xì)胞輕輕晃勻后置入孵箱中進(jìn)行孵育。2 d后提取總RNA，檢測(cè)CCL17和血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(VEGF)的mRNA表達(dá)相對(duì)強(qiáng)度和蛋白表達(dá)水平。

1.7抗CCL17抑制劑轉(zhuǎn)染 將鼻咽癌肝細(xì)胞放入培養(yǎng)皿中并觀察鼻咽癌干細(xì)胞，取生長(zhǎng)狀態(tài)良好的鼻咽癌干細(xì)胞鋪于2個(gè)6孔板中，至細(xì)胞融合度達(dá)到80%左右時(shí)向其中一個(gè)6孔板各孔添加預(yù)先配置的脂質(zhì)體Lipofectamine20005 μl和3.75 μl無血清RPMI1640培養(yǎng)液，采用化學(xué)合成的siRNAoligo，序列為：5'-ATGTTTTTGCTACCGTAGGGA-3'，2 d后提取總RNA，檢測(cè)CCL17和VEGF的mRNA表達(dá)相對(duì)強(qiáng)度和蛋白表達(dá)水平。

1.8向成骨誘導(dǎo)分化 將鼻咽癌干細(xì)胞培養(yǎng)于含10%胎牛血清的培養(yǎng)基中，添加0.1 μmol/L的潑尼松、50 μmol/L的維生素C及10 mmol/L的β甘油磷酸鈉，每3 d定期更換培養(yǎng)基，共培養(yǎng)21 d。分別于培養(yǎng)前和培養(yǎng)后提取總RNA，采用RT-PCR檢測(cè)骨鈣素等成骨標(biāo)志物的mRNA表達(dá)水平。

1.9向軟骨誘導(dǎo)分化 將鼻咽癌干細(xì)胞培養(yǎng)于含10%胎牛血清的培養(yǎng)基中，添加10 μg/L的轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子、1 μg/L的堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子及6.25 mg/L的胰島素，每3 d定期更換培養(yǎng)基，共培養(yǎng)21 d。分別于培養(yǎng)前和培養(yǎng)后提取總RNA，采用RT-PCR檢測(cè)Ⅱ型膠原等軟骨標(biāo)志物的mRNA表達(dá)水平。

1.10向脂肪誘導(dǎo)分化 將鼻咽癌干細(xì)胞培養(yǎng)于含10%胎牛血清的培養(yǎng)基中，培養(yǎng)至90%融合，添加1 μmol/L的潑尼松、0.5 mmol/L的3-異丁基-1-甲級(jí)黃嘌呤、2 μmol/L的胰島素及200 mmol/L的吲哚美辛，每3 d定期更換培養(yǎng)基，共培養(yǎng)21 d。分別于培養(yǎng)前和培養(yǎng)后提取總RNA，采用RT-PCR檢測(cè)脂聯(lián)素等脂肪標(biāo)志物的mRNA表達(dá)水平。

1.11Transwell小室法 常規(guī)水化基底膜，分別于轉(zhuǎn)染前后2 d收集細(xì)胞，并調(diào)整細(xì)胞數(shù)為5×105/ml，向Transwell小室添加含10%胎牛血清的RPMI1640培養(yǎng)液900 μl和200 μl的細(xì)胞懸液，將細(xì)胞接種于Transwell小室，培養(yǎng)12 h后采用4%多聚甲醛進(jìn)行為時(shí)0.5 h的固定，棄去固定液，采用0.1%結(jié)晶紫染色20 min，棄去染色液并采用PBS沖洗3次。倒置Transwell小室于顯微鏡下放大100倍，觀察并進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)。

1.12劃痕實(shí)驗(yàn) 劃痕實(shí)驗(yàn)操作同參考文獻(xiàn)〔7〕。

1.13RT-PCR檢測(cè)轉(zhuǎn)染前后及誘導(dǎo)分化前后各因子mRNA 相對(duì)表達(dá)量的檢測(cè) 常規(guī)提取總RNA，采用TaqMan@ Small RNA Assays試劑盒進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)，操作按照試劑盒說明進(jìn)行，將cDNA冷藏于-20℃恒溫箱中備用。實(shí)行RT-PCR檢測(cè)，操作亦按照TaqMan@ Small RNA Assays試劑盒說明書進(jìn)行，反應(yīng)條件分別為先于50℃環(huán)境中反應(yīng)2 min，再于95℃環(huán)境中反應(yīng)10 min，再于95℃環(huán)境中反應(yīng)15 s，最后于60℃環(huán)境中反應(yīng)60 s，共進(jìn)行40個(gè)循環(huán)。進(jìn)行3次獨(dú)立重復(fù)檢測(cè)。采用7500SDS v1.3.1軟件操作，以18 S rRNA為內(nèi)參，所得數(shù)據(jù)采用2-ΔΔCt公式進(jìn)行分析，其中Ct為各復(fù)孔平均值，ΔCt=Ct目標(biāo)-CtU6，ΔΔCt=ΔCt處理組-ΔCt未處理組。

1.14統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用SPSS19.0軟件進(jìn)行t檢驗(yàn)。

2 結(jié) 果

2.1CCL17轉(zhuǎn)染前后CCL17和VEGF mRNA相對(duì)表達(dá)量的比較 人工合成的CCL17瞬時(shí)轉(zhuǎn)染后，鼻咽癌干細(xì)胞中CCL17和VEGF mRNA表達(dá)相對(duì)強(qiáng)度較轉(zhuǎn)染前明顯升高(P<0.001)，見表1。

表1 CCL17轉(zhuǎn)染前后CCL17和VEGF mRNA相對(duì)表達(dá)量的比較

2.2CCL17轉(zhuǎn)染前后鼻咽癌干細(xì)胞侵襲及遷移能力比較 人工合成的CCL17瞬時(shí)轉(zhuǎn)染后，鼻咽癌干細(xì)胞侵襲及遷移能力〔Transwell穿膜細(xì)胞數(shù)(146.65±21.75)〕較轉(zhuǎn)染前(65.58±6.68)明顯升高(t=15.880，P=0.000)。

2.3CCL17轉(zhuǎn)染對(duì)分化誘導(dǎo)的骨鈣素、Ⅱ型膠原和脂聯(lián)素mRNA表達(dá)相對(duì)強(qiáng)度的影響 人工合成的CCL17瞬時(shí)轉(zhuǎn)染后，鼻咽癌干細(xì)胞骨鈣素、Ⅱ型膠原和脂聯(lián)素mRNA表達(dá)相對(duì)強(qiáng)度轉(zhuǎn)移降低(P<0.001)，見表2。

表2 CCL17轉(zhuǎn)染對(duì)分化誘導(dǎo)的骨鈣素、Ⅱ型膠原和脂聯(lián)素mRNA表達(dá)相對(duì)強(qiáng)度的影響

2.4人工合成的抗CCL17抑制劑瞬時(shí)轉(zhuǎn)染前后CCL17和VEGF mRNA相對(duì)表達(dá)量的比較 人工合成的抗CCL17抑制劑瞬時(shí)轉(zhuǎn)染后，鼻咽癌干細(xì)胞中CCL17和VEGF mRNA表達(dá)相對(duì)強(qiáng)度較轉(zhuǎn)染前明顯降低(P<0.001)，見表3。

2.5人工合成的抗CCL17抑制劑瞬時(shí)轉(zhuǎn)染前后鼻咽癌干細(xì)胞侵襲及遷移能力 人工合成的抗CCL17抑制劑瞬時(shí)轉(zhuǎn)染后，鼻咽癌干細(xì)胞侵襲及遷移能力〔Transwell穿膜細(xì)胞數(shù)(11.16±4.54)〕較轉(zhuǎn)染前(65.86±6.68)明顯降低(t=30.288，P=0.000)。

2.6人工合成的抗CCL17抑制劑瞬時(shí)轉(zhuǎn)染對(duì)分化誘導(dǎo)的骨鈣素、Ⅱ型膠原和脂聯(lián)素mRNA表達(dá)相對(duì)強(qiáng)度的影響 人工合成的抗CCL17抑制劑瞬時(shí)轉(zhuǎn)染后，鼻咽癌干細(xì)胞骨鈣素、Ⅱ型膠原和脂聯(lián)素mRNA表達(dá)相對(duì)強(qiáng)度較轉(zhuǎn)染前明顯升高(P<0.001)，見表4。

表3 人工合成的抗CCL17抑制劑瞬時(shí)轉(zhuǎn)染前后CCL17和VEGF mRNA相對(duì)表達(dá)量的比較

表4 人工合成的抗CCL17抑制劑瞬時(shí)轉(zhuǎn)染對(duì)分化誘導(dǎo)的骨鈣素、Ⅱ型膠原和脂聯(lián)素mRNA表達(dá)相對(duì)強(qiáng)度的影響

3 討 論

鼻咽癌是最為常見的頭頸部惡性腫瘤，其發(fā)病率近年來隨著環(huán)境污染的加劇而呈現(xiàn)快速增長(zhǎng)的趨勢(shì)〔8〕。鼻咽癌惡性程度高，病情嚴(yán)重，極易發(fā)生淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及肝肺等的遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移，累及全身多處臟器，引發(fā)全身多處器官的病變，加重患者病情，最終造成死亡等不良預(yù)后情況的發(fā)生〔9～11〕。因此，對(duì)鼻咽癌進(jìn)行有效的防治十分重要。鼻咽癌治療的效果差，其治療后復(fù)發(fā)率高，且常伴有遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移，其治療困難，療效欠佳〔12,13〕。鼻咽癌的侵襲轉(zhuǎn)移是影響其預(yù)后的重要因素之一〔14〕。抑制鼻咽癌侵襲轉(zhuǎn)移可能有助于鼻咽癌治療效果的提高和預(yù)后情況的改善。腫瘤的生長(zhǎng)和侵襲轉(zhuǎn)移均依賴其血管的生成，而VEGF是與腫瘤血管生成密切相關(guān)的因子，在腫瘤血管生成中具有重要作用，可促進(jìn)腫瘤血管的形成而促進(jìn)腫瘤生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移〔15～17〕。本研究結(jié)果亦發(fā)現(xiàn)，鼻咽癌干細(xì)胞中的VEGF表達(dá)水平高，可通過發(fā)揮其促進(jìn)血管生成的作用而促進(jìn)鼻咽癌的轉(zhuǎn)移和發(fā)展。因此對(duì)VEGF表達(dá)進(jìn)行抑制從而抑制腫瘤血管形成、腫瘤生長(zhǎng)及腫瘤轉(zhuǎn)移對(duì)抑制鼻咽癌等惡性腫瘤的轉(zhuǎn)移和改善其療效具有重要意義。腫瘤的分化程度與腫瘤的惡性程度密切相關(guān)〔18〕。高分化腫瘤的惡性程度低，常無轉(zhuǎn)移，僅有部分可出現(xiàn)腫瘤的復(fù)發(fā)，而低分化腫瘤的惡性程度高，極易發(fā)生轉(zhuǎn)移和復(fù)發(fā)〔19～21〕。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，鼻咽癌的分化程度較低，其惡性程度高，急需有效的干預(yù)。因此通過采取措施促進(jìn)鼻咽癌分化亦可能是治療鼻咽癌的有效方法。本研究結(jié)果表明，CCL17在鼻咽癌的發(fā)生發(fā)展中具有重要作用。因此，CCL17可能成為鼻咽癌治療的靶基因之一。本研究結(jié)果提示CCL17可能通過調(diào)控VEGF促進(jìn)鼻咽癌血管生成而提高鼻咽癌的侵襲轉(zhuǎn)移能力，并抑制鼻咽癌的分化，是鼻咽癌的促癌因子。CCL17可能作為鼻咽癌治療的靶基因，通過抑制CCL17的表達(dá)可能有助于抑制其腫瘤的生長(zhǎng)和侵襲轉(zhuǎn)移，促進(jìn)其腫瘤分化，降低其腫瘤惡性程度，抑制鼻咽癌轉(zhuǎn)移和復(fù)發(fā)的發(fā)生，達(dá)到良好的治療效果，從而改善鼻咽癌預(yù)后情況。

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