楊永青，姚一萍，史 培，趙 格，狄彩霞，莎 娜，李秀萍，栗艷芳，駱 洪

（1.內(nèi)蒙古自治區(qū)農(nóng)牧業(yè)科學(xué)院，農(nóng)業(yè)部農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量安全風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估實(shí)驗(yàn)室（呼和浩特），內(nèi)蒙古呼和浩特 010031；2. 內(nèi)蒙古大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，內(nèi)蒙古呼和浩特 010021；3.中國(guó)動(dòng)物衛(wèi)生與流行病學(xué)中心，農(nóng)業(yè)部畜禽產(chǎn)品質(zhì)量安全風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估實(shí)驗(yàn)室（青島），山東青島 266032）

以上的沙門(mén)氏菌感染都由動(dòng)物性食品引起[4-5]?，F(xiàn)有報(bào)道多集中于雞、鴨和生豬屠宰環(huán)節(jié)食源性致病菌的污染種類(lèi)、水平、耐藥性等，而針對(duì)不同規(guī)模羊屠宰場(chǎng)中各屠宰環(huán)節(jié)的相關(guān)研究較少，而研究屠宰環(huán)節(jié)羊肉產(chǎn)品沙門(mén)氏菌和致病性大腸埃希氏菌的攜帶狀況，比較不同規(guī)模屠宰場(chǎng)的攜帶水平，能夠?yàn)檠蛉猱a(chǎn)品食源性病原微生物的防控提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 樣品來(lái)源 羊肉胴體/屠宰環(huán)境拭子：用一次性無(wú)菌棉簽在羊肉、環(huán)境表面（＞30 cm2）擦拭，然后將其放入運(yùn)輸培養(yǎng)基中，36 h內(nèi)冷藏運(yùn)送至實(shí)驗(yàn)室。同時(shí)采集2份棉拭子，分別用于分離致瀉性大腸桿菌和沙門(mén)氏菌。2017年4—11月，選取內(nèi)蒙古6個(gè)不同規(guī)模屠宰場(chǎng)（日屠宰量＞200只為大中型屠宰場(chǎng)，日屠宰量＜200只為小型屠宰場(chǎng)），在各屠宰環(huán)節(jié)（剛宰殺、預(yù)冷間和屠宰環(huán)境）采樣（圖1），共采集349份棉拭子樣品。其中，屠宰環(huán)境包括地面、墻面、工作人員手套、臺(tái)面和托盤(pán)。

1.1.2 主要試劑 一次性無(wú)菌棉拭子、運(yùn)輸培養(yǎng)基、營(yíng)養(yǎng)肉湯、腸道增菌肉湯、麥康凱培養(yǎng)基、伊紅美藍(lán)培養(yǎng)基、緩沖蛋白胨水（BPW）、四硫磺酸鈉煌綠增菌液（TTB）、沙門(mén)氏菌顯色培養(yǎng)基和革蘭氏陰性桿菌鑒定系統(tǒng)（HK-MID-64，GN-ID A）：購(gòu)自廣東環(huán)凱微生物科技有限公司；DBI-05沙門(mén)氏菌干制生化鑒定試劑盒：購(gòu)自北京陸橋技術(shù)有限責(zé)任公司。其他試劑包括細(xì)菌基因組提取試劑盒、GoTaq Green Master Mix 、DNA Marker和ddH2O等。

圖1 不同規(guī)模屠宰場(chǎng)各屠宰環(huán)節(jié)采樣數(shù)量

1.2 方法

1.2.1 致瀉性大腸桿菌分離與生化鑒定 致瀉性大腸桿菌的富集和分離參照《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)食品衛(wèi)生微生物學(xué)檢驗(yàn)致瀉大腸埃希氏菌檢驗(yàn)》（GB/T 4789.6—2016）[6]進(jìn)行。從麥康凱瓊脂（MAC）上挑取表面光滑的紅色或桃紅色單菌落，劃線接種于營(yíng)養(yǎng)瓊脂平板純培養(yǎng)[7]。挑取少量純化后的單菌落，用無(wú)菌水制成0.5麥?zhǔn)蠞岫鹊木鷳乙?，用HK-MID-64，GN-ID A鑒定系統(tǒng)進(jìn)行生化鑒定。大腸埃希氏菌（Escherichia coli）ATCC 25922為質(zhì)控菌株。

1.2.2 沙門(mén)氏菌分離與生化鑒定 沙門(mén)氏菌的富集和分離參照《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)食品衛(wèi)生微生物學(xué)檢驗(yàn)沙門(mén)氏菌檢驗(yàn)》（GB/T 4789.4—2016）[8]方法進(jìn)行。從沙門(mén)氏菌顯色培養(yǎng)基上挑取紫色或淡紫色的單菌落，接種胰蛋白大豆胨平板純培養(yǎng)。挑取少量純化后的單菌落，用無(wú)菌水制成0.5麥?zhǔn)蠞岫鹊木鷳乙海肈BI-05沙門(mén)氏菌干制生化鑒定試劑盒進(jìn)行生化鑒定。

1.2.3 病原菌毒力基因PCR擴(kuò)增 將符合生化現(xiàn)象的分離株接種于營(yíng)養(yǎng)肉湯中，37 ℃培養(yǎng)12～14 h，按照細(xì)菌基因組提取試劑盒說(shuō)明書(shū)提取DNA。分別擴(kuò)增致瀉性大腸桿菌的6種毒力基因、沙門(mén)氏菌invA基因。特異性引物（表1）由上海生工生物工程技術(shù)有限公司合成。致瀉性大腸桿菌多重PCR[9]、沙門(mén)氏菌PCR反應(yīng)體系（25 μL）：GoTaq Green Master Mix 12.5 μL，Primer Mix 1 μL，DNA模板1 μL，ddH2O 10.5 μL。PCR擴(kuò)增條件見(jiàn)表2。PCR產(chǎn)物經(jīng)2.0%瓊脂糖凝膠電泳。

表1 病原菌毒力基因特異性引物序列

表2 致瀉性大腸桿菌和沙門(mén)氏菌PCR擴(kuò)增程序

1.2.4 致瀉性大腸桿菌16S rDNA鑒定及系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)構(gòu)建 以攜帶毒力基因的致瀉性大腸桿菌DNA為模板，擴(kuò)增16S rDNA序列。PCR擴(kuò)增條件[10]見(jiàn)表2。細(xì)菌16S rDNA通用引物：27 F：5′AGAGTTTGATCCTGGCTCAG 3′；1492 R：5′TACGGTTACCTTGTTACGACTT3′。PCR 體 系（50 μL）：GoTaq Master Mix 25.0 μL，27 F 1 μL，1492 R 1 μL，DNA 1 μL，ddH2O 22.0 μL。PCR產(chǎn)物委托上海生工生物測(cè)序。16S rDNA序列用MEGA5.0軟件，以Neighbor-Joining法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)。

2 結(jié)果

2.1 致瀉性大腸桿菌毒力基因PCR擴(kuò)增

經(jīng)生化鑒定篩選出101株符合大腸桿菌生化反應(yīng)結(jié)果的分離株，多重PCR擴(kuò)增其毒力基因并由電泳結(jié)果（圖2）得出，攜帶致瀉性大腸桿菌毒力基因的共12株，其中1株（36號(hào)）攜帶毒力基因eae、elt，其余11株攜帶毒力基因elt，均屬于能夠引起動(dòng)物腸道疾病的產(chǎn)腸毒素大腸埃希氏菌（ETEC）。

圖2 致瀉性大腸桿菌毒力基因多重PCR產(chǎn)物電泳圖

2.2 沙門(mén)氏菌毒力基因PCR擴(kuò)增

經(jīng)生化鑒定篩選出5株符合沙門(mén)氏菌生化現(xiàn)象的分離株。PCR擴(kuò)增其invA基因電泳結(jié)果見(jiàn)圖3。編號(hào)為149的樣品出現(xiàn)與陽(yáng)性對(duì)照大小一致的目的片段，是攜帶invA基因的沙門(mén)氏菌。

圖3 沙門(mén)氏菌invA基因PCR產(chǎn)物電泳圖

2.3 致瀉性大腸桿菌16S rDNA鑒定及系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)

擴(kuò)增12株致瀉性大腸桿菌的16S rDNA，均得到大小約為1 500 bp的單一條帶，與目的片段大小一致，無(wú)明顯非特異性擴(kuò)增現(xiàn)象。部分陽(yáng)性菌株P(guān)CR產(chǎn)物電泳結(jié)果見(jiàn)圖4。由16S rDNA序列構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)（圖5）得出，5株陽(yáng)性菌株18、26、31、36、132與Genebank中雞源（EF620922.1）、鴨 源（EF620921.1） 和 羊 源（EF025911.1、EF025907.1）等動(dòng)物源大腸桿菌處于同一分支，親緣關(guān)系較近，其余7株致瀉性大腸桿菌處于另一獨(dú)立分支，原因可能與地區(qū)差異有關(guān)。

圖4 部分致瀉性大腸桿菌16S rDNA PCR產(chǎn)物電泳圖

2.4 致瀉性大腸桿菌和沙門(mén)氏菌污染狀況分析

2.4.1 大中型屠宰場(chǎng)陽(yáng)性率低于小型屠宰場(chǎng) 通過(guò)試驗(yàn)得出大中型屠宰場(chǎng)致瀉性大腸桿菌陽(yáng)性率為1.21%，小型屠宰場(chǎng)陽(yáng)性率5.43%，大中型屠宰場(chǎng)的陽(yáng)性率低于小型屠宰場(chǎng)（表3）。

表3 不同規(guī)模屠宰場(chǎng)致瀉性大腸桿菌試驗(yàn)結(jié)果

2.4.2 不同規(guī)模屠宰場(chǎng)的預(yù)冷間均未檢出致瀉性大腸桿菌 在174份剛宰殺的羊胴體棉拭子樣品中檢出10份致瀉性大腸桿菌，陽(yáng)性率為5.75%，而預(yù)冷間的樣品中均未檢出致瀉性大腸桿菌。

2.4.3 沙門(mén)氏菌陽(yáng)性率低，在羊屠宰環(huán)節(jié)的污染風(fēng)險(xiǎn)較小 349份棉拭子樣品中，僅檢出1株沙門(mén)氏菌，且來(lái)源于小型屠宰場(chǎng)環(huán)境樣品，可見(jiàn)在目前調(diào)查的屠宰場(chǎng)中沙門(mén)氏菌的攜帶水平較低。

3 討論

圖5 致瀉性大腸桿菌基于16S rDNA基因序列構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)

3.1 剛宰殺的羊胴體表面是致瀉性大腸桿菌的主要來(lái)源

本研究發(fā)現(xiàn)屠宰場(chǎng)中致瀉性大腸桿菌的主要來(lái)源均是剛宰殺的羊胴體表面，陽(yáng)性率分別為3.33%和7.02%。陽(yáng)性菌株均為攜帶elt毒力基因的產(chǎn)腸毒素大腸桿菌。該菌可引起嬰幼兒和旅游者腹瀉，一般呈輕度水樣腹瀉，也可呈嚴(yán)重霍亂樣癥狀，低熱或不發(fā)熱。腹瀉常為自限性，一般2～3 d即可自愈[6]。張佳等[11]研究表明肉牛屠宰過(guò)程中，初始剝皮和去內(nèi)臟是肉牛屠宰工序中造成胴體微生物污染的兩個(gè)關(guān)鍵工序。由于大中型屠宰場(chǎng)在屠宰過(guò)程中工序分工嚴(yán)格、機(jī)械化程度較高和衛(wèi)生消毒徹底等因素，其環(huán)境樣品的致瀉性大腸桿菌陽(yáng)性率為0，而小型屠宰場(chǎng)為5.00%。

3.2 預(yù)冷間羊胴體表面未發(fā)現(xiàn)致瀉性大腸桿菌和沙門(mén)氏菌污染

在349份棉拭子樣品中，不同規(guī)模屠宰場(chǎng)的預(yù)冷間羊胴體表面均未檢出致瀉性大腸桿菌和沙門(mén)氏菌，在一定程度上說(shuō)明屠宰過(guò)程中對(duì)羊肉胴體進(jìn)行高壓沖洗和排酸預(yù)冷工藝，有效地降低了屠宰環(huán)節(jié)羊肉產(chǎn)品致瀉性大腸桿菌的攜帶水平。屠宰工藝中的預(yù)冷排酸是指在0～4 ℃、相對(duì)濕度 90%的冷藏條件下，將屠宰后的羊胴體預(yù)冷24 h。這一過(guò)程中胴體pH 值從活體的7.0～7.2 下降到5.5～6.5，表面形成油膜層，可抑制大多數(shù)微生物的生長(zhǎng)繁殖，同時(shí)提高肉的品質(zhì)[12-13]。

3.3 羊屠宰場(chǎng)各屠宰環(huán)節(jié)中沙門(mén)氏菌污染風(fēng)險(xiǎn)較小

本試驗(yàn)中僅檢出1株沙門(mén)氏菌，污染風(fēng)險(xiǎn)較低。一項(xiàng)針對(duì)烏魯木齊市屠宰場(chǎng)中3種食源性細(xì)菌的調(diào)查研究亦顯示，羊屠宰場(chǎng)中未檢出沙門(mén)氏菌[14]，與本研究結(jié)果一致，說(shuō)明在羊屠宰場(chǎng)沙門(mén)氏菌污染風(fēng)險(xiǎn)較小。食源性病原菌是引起食物中毒的主要原因，羊屠宰場(chǎng)是保證羊肉產(chǎn)品質(zhì)量安全的關(guān)鍵環(huán)節(jié)。本試驗(yàn)中雖然對(duì)致瀉性大腸桿菌和沙門(mén)氏菌的污染狀況進(jìn)行了分析，但有研究報(bào)道在羊屠宰場(chǎng)檢出了單增李斯特菌[15]，進(jìn)口牛肉和屠宰場(chǎng)羊肉攜帶產(chǎn)志賀毒素大腸埃希桿菌O157:H7[15-16]，因此在后續(xù)對(duì)內(nèi)蒙古羊屠宰場(chǎng)的研究中，可進(jìn)行相關(guān)試驗(yàn)的補(bǔ)充。

屠宰環(huán)節(jié)的畜禽產(chǎn)品安全與食品安全密切相關(guān)。食源性病原菌一旦污染肉品，在后續(xù)的速凍、儲(chǔ)藏、運(yùn)輸和銷(xiāo)售等環(huán)節(jié)仍能存活。若食用前處理不當(dāng)或生熟區(qū)分不嚴(yán)格，很可能對(duì)公共衛(wèi)生構(gòu)成威脅[17]。因此，了解羊屠宰環(huán)節(jié)致瀉性大腸桿菌和沙門(mén)氏菌的攜帶狀況，不僅能及時(shí)掌握屠宰場(chǎng)病原菌的分布及水平，而且通過(guò)對(duì)羊源致瀉性大腸桿菌的分離鑒定、毒力基因擴(kuò)增和系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)分析，還能為羊源致瀉性大腸桿菌的防控提供研究基礎(chǔ)。

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